CN106995855A - 检测类鼻疽伯克霍尔德菌的引物、试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测类鼻疽伯克霍尔德菌的试剂盒，该试剂盒包括有序列组成为SEQ ID.NO.1‑SEQ ID.NO.2的外引物，序列组成为SEQ ID.NO.3‑SEQ ID.NO.4的内引物。本发明所述试剂盒检测类鼻疽伯克霍尔德菌具有灵敏度高，特异性强，且检测快速的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术，具体是涉及一种检测类鼻疽伯克霍尔德菌的引物、试剂盒。
背景技术
类鼻疽是一种由类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)所致的地方性人兽共患传染病。类鼻疽致死率高，临床表现多样且缺乏特异性，容易被误诊为肺炎、肺结核、肺脓肿或其他化脓菌所致的败血症，又俗称“似百样病”。快速诊断类鼻疽伯克霍尔德菌感染是治疗和预防类鼻疽病的关键。虽然传统的培养法方法是诊断类鼻疽的标准方法，但是需要一定的培养和鉴定时间，容易错过最佳治疗时机，且准确率还有待提高。
因此，找到一种简单、快速、经济的类鼻疽伯克霍尔德检测方法，成为当前的研究热点之一。随着人们对于分子生物学的不断深入研究，一种全新的核酸扩增技术－环介导等温扩增技术(LAMP)越来越受到研究人员的关注，其检测灵敏度远高于PCR方法、耗时也显著减少。因此，本研究拟建立BP的Real－LAMP检测方法，将实时荧光的敏感性和LAMP的快速性有机的结合，探讨其在临床应用中的可行性，为临床提供一种简单、快速的BP的检测方法。
如何将环介导等温扩增技术(LAMP)很好地应用到类鼻疽伯克霍尔德菌检测上，从而建立了一种快速、准确、价廉、操作简单的检测类鼻疽伯克霍尔德菌的荧光定量LAMP方法以该法对临床常见病原菌和类鼻疽伯克霍尔德菌临床分离株进行检测，应用于临床上类鼻疽伯克霍尔德菌的定性检测，以期为该菌的临床诊断和流行病学调查提供可靠方法，目前还没有具体的报道，有待于研发人员的大力研究。
为检测类鼻疽伯克霍尔德提供新的检测技术，我们试行运用Real-time LAMP技术检测类鼻疽伯克霍尔德菌，寻找高特异性的检测类鼻疽伯克霍尔德的Real-time LAMP试剂盒。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种检测类鼻疽伯克霍尔德菌的试剂盒，该试剂盒具有灵敏度高、特异性强的优点。
实现上述目的的技术方案如下。
一种检测类鼻疽伯克霍尔德菌的试剂盒，包括有序列组成为SEQID.NO.1-SEQID.NO.2的外引物，序列组成为SEQID.NO.3-SEQID.NO.4的内引物。
在其中一个实施例中，还包括有序列组成为SEQID.NO.5-SEQID.NO.6的环引物。
在其中一个实施例中，在检测时，所述内引物、外引物、环引物的浓度比为8：1：4。
在其中一个实施例中，所述内引物、外引物、环引物的浓度分别为1.6、0.2、0.8μmol/L。
本发明的另一个目的是提供一种检测类鼻疽伯克霍尔德菌的引物。
实现上述目的的技术方案如下。
一种检测类鼻疽伯克霍尔德菌的引物，包括有序列组成为SEQID.NO.1-SEQID.NO.2的外引物，序列组成为SEQID.NO.3-SEQID.NO.4的内引物。
在其中一个实施例中，还包括有序列组成为SEQID.NO.5-SEQID.NO.6的环引物。
本发明具有以下有益效果：
LAMP技术相对PCR技术，原理相对复杂，特别是对引物的设计及选取要求极高。本发明经过发明人精心筛选到的一套针对检测类鼻疽伯克霍尔德菌的引物，选取8株常见病原菌和BP同时进行LAMP扩增，仅BP出现阳性扩增，其他8株病原菌均未出现阳性结果，证明所设计的LAMP引物特异性强，不与非目标菌发生交叉反应。此外，进一步地，本发明所筛选到的引物，因为还具有特异性的环引物，除有特异性强，灵敏度高的优点之外，还具有检测时间短的优势。本发明中，加环引物使反应速度明显提高，阳性样品BP在反应开始第3min即可被检测出，整个过程可在17min内完成，明显缩短了检测时间。
附图说明
图1为-orf2引物-1扩增曲线结果示意图。
图2为-orf2引物-2扩增曲线结果示意图。
图3为-orf2引物-3扩增曲线结果示意图。
图4为-orf2引物-4扩增曲线结果示意图。
图5为-orf2引物-5扩增曲线结果示意图。
图6为-orf2引物-6扩增曲线结果示意图。
图7为-特异性试验反应曲线结果示意图。
图8为-灵敏度试验反应曲线结果示意图。
图9为-灵敏度试验反应曲线结果示意图。
图10为-不同引物工作液扩增曲线结果示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
一、材料
1.1标本来源：
类鼻疽伯克霍尔德菌标准株K96243的DNA核酸由海南医学院病原微生物学实验室提供。广州医科大学附属第三医院检验科细菌室临床分离株(经梅里埃生化鉴定板鉴定)，常见致病微生物包括:金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、鲍曼不动杆菌、草绿色链球菌。
1.2仪器与试剂
1.2.1仪器
雅睿(Molarray)MA-6000P荧光定量PCR仪，购自苏州雅睿生物技术有限公司，Ⅱ级生物安全柜，)，Eppendorf mini spain离心机。
1.2.2试剂
TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)购自TIANGEN北京生物技术有限公司，双螺旋基因DNA扩增试剂盒购自广州双螺旋基因技术有限公司，均在有效期内使用。
1.3细菌基因组DNA的提取
将－70℃保存的菌株接种于血平板，在37℃温箱培18-24h，取平板上的菌混于无菌生理盐水中制成1ml的0.5麦氏浊度的菌悬液。按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作。
1.4引物设计及合成
根据BP的orf2基因序列，利用LAMP引物设计软件Primer Explorer V4设计引物，从众多引物，先筛出合适的，然后再根据实验室以往积累的经验，筛选出6套orf2基因引物。引物序列由购自英潍捷基上海贸易有限公司合成6套orf2基因引物，包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LoopF、反向环引物LoopB。
表1 Burkholderia pseudomallei Real-LAMP检测体系引物orf2-1
表2 Burkholderia pseudomallei Real-LAMP检测体系引物orf2-2
表3 Burkholderia pseudomallei Real-LAMP检测体系引物orf2-3
表4 Burkholderia pseudomallei Real-LAMP检测体系引物orf2-4
表5 Burkholderia pseudomallei Real-LAMP检测体系引物orf2-5
表6 Burkholderia pseudomallei Real-LAMP检测体系引物orf2-6
以上正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LoopF、反向环引物LoopB可构成一套完整的引物，并组成相应的试剂盒，所述试剂盒除了包括有上述引物，还根据本领域的常识，可包括有如下反应液，聚合酶等。
1.5 Real-LAMP反应体系
按照DNA扩增试剂说明书配制LAMP反应体系。体系加完后加一滴蜡油，再加荧光染料(SYTO-9)。其中，工作液由FIP、BIP、F3、B3、LF、LB按照浓度比8∶8∶1∶1∶4∶4混合配制，使上述引物加入25ul体系后浓度分别达到浓度分别为1.6、1.6、0.2、0.2、0.8、0.8μmol/L。荧光通道选择SYBR。
表6反应体系配制
二、方法
2.1引物筛选
设计6套引物：分别用6套引物(orf2引物1-6)配制工作液，以提取BP的DNA为模板，按照DNA扩增试剂盒说明书的要求进行加样和设置反应条件，比较6套引物的扩增效率和荧光强度。
2.2环引物增强反应速度的验证
以筛选出的orf2引物-6分别配制工作液：(1)加环引物工作液。(2)不加环引物工作液，将这两种工作液分别加入Real－LAMP体系，对BP的orf2基因进行扩增，观察扩增曲线，比较加、不加环引物对orf2基因扩增的影响。
2.3内外引物的作用验证
以筛选出的orf2引物-6分别配制工作液：(1)只加内引物工作液。(2)只加外引物工作液，将这两种工作液分别加入Real－LAMP体系，对BP的orf2基因进行扩增，观察扩增曲线，比较不同工作液体系对orf2基因扩增的影响。
2.4特异性试验
提取BP及其他临床常见病原菌的基因组DNA，按照Real－LAMP的反应条件进行扩增，分析检测信号，评价该引物的特异性。
为避免弱阳性不易判断的缺点，本研究采用荧光染料SYTO-9，引入MA-6000P系统，将实时荧光定量PCR仪作为LAMP反应的平台，实现了可实时观察检测过程并且提高了检测的灵敏度。但是荧光染料SYTO-9检测的原理是与双链DNA结合即可发出荧光，并无特异性结合，当反应体系出现引物二聚体时SYTO-9也可与之结合造成假阳性。为验证是否存在这种可能性，本研究特分析了熔链曲线，试验结果表明各样品的溶解曲线均未出现双峰，说明扩增过程无出现引物二聚体干扰，该方法检测的特异性强。
2.5引物灵敏性和引物二聚体的排查
测定BP的DNA液浓度，先用1ul TE液对Thermo Scientific Nanodrop2000微量分光光度计调0，再加1ul BP的DNA提取液，测量DNA模板浓度。取10ul DNA原液用超纯水进行10倍梯度稀释5次，得到6个不同浓度的DNA模板，加入Real－LAMP体系中反应，观察扩增曲线，检测引物对BP的检测灵敏度。同时对各反应管做溶解曲线检测，排除引物二聚体干扰。
2.6重复性试验
用Real－LAMP对1份阳性菌株及阴性对照各进行3次重复试验，所有菌株重复性试验所用模板为同一份模板。
3结果
3.1.引物筛选试验及熔解曲线分析
在开始反应后，对比各引物的体系反应曲线，综合考虑各引物的出峰时间、荧光强度、熔解曲线等因素,orf2引物-6有相对高的扩增效率，2分钟反应出峰，10分钟达峰，熔解温度为79.32℃。参见图1-图6。
用选择到的orf2引物-6进行后续试验。
3.2.特异性试验及灵敏度试验
本试验选取的常见的病原菌均未出现扩增，而BP被特异性检测出来，说明该引物对BP检测的特异性较好。所设计的Real-LAMP引物具有良好的特异性，与非目标菌不存在交叉反应。
表7-特异性试验结果
经过梯度稀释的模板样品均能出峰，出峰时间和达峰强度随梯度稀释而减少。本试验的检测灵敏度可达到0.65pg/ul，等同于1*103/ml扩增过程无出现引物二聚体干扰，试验结果可靠。参见图7和图8。
3.3重复性试验
阳性样品各自的3个重复管都几乎同时出峰，扩增曲线几乎重叠，相对荧光值强度接近1，批内CV％为2.55％，说明Real-LAMP的重复性良好。参见图9。
3.4.内外引物及不加环引物的验证
通过分别设置三组只加内引物、只加外引物、不加环引物(有内外引物)的引物工作液试验组，在相同环境条件下进行试验，试验结果显示只加内引物的试验组出峰时间最快，只加外引物试验组不能扩增出曲线，不加环引物试验组出峰时间明显延长。参见图10。
试验结果表明本发明所设计的orf2引物-6中的内引物是3对扩增引物中的扩增效率最高的，所述环引物是加快反应扩增速率的关键。
所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州医科大学附属第三医院
<120> 检测类鼻疽伯克霍尔德菌的引物、试剂盒
<160> 36
<170> PatentIn version 3.3
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Claims (6)
1.一种检测类鼻疽伯克霍尔德菌的试剂盒，其特征在于，包括有序列组成为SEQID.NO.1-SEQID.NO.2的外引物，序列组成为SEQID.NO.3-SEQID.NO.4的内引物。
2.根据权利要求1所述的检测类鼻疽伯克霍尔德菌的试剂盒，其特征在于，还包括有序列组成为SEQID.NO.5-SEQID.NO.6的环引物。
3.根据权利要求1或2所述的检测类鼻疽伯克霍尔德菌的试剂盒，其特征在于，在检测时，所述内引物、外引物、环引物的浓度比为8：1：4。
4.根据权利要求3所述的检测类鼻疽伯克霍尔德菌的试剂盒，其特征在于，检测时，所述内引物、外引物、环引物的浓度分别为1.6、0.2、0.8μmol/L。
5.一种检测类鼻疽伯克霍尔德菌的引物，其特征在于，包括有序列组成为SEQID.NO.1-SEQID.NO.2的外引物，序列组成为SEQID.NO.3-SEQID.NO.4的内引物。
6.根据权利要求4所述的检测类鼻疽伯克霍尔德菌的引物，其特征在于，还包括有序列组成为SEQID.NO.5-SEQID.NO.6的环引物。
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| CN102146478A (zh) * | 2011-04-15 | 2011-08-10 | 中国人民解放军第三军医大学 | 一种用于鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的pcr试剂盒 |
| CN103866014A (zh) * | 2014-03-06 | 2014-06-18 | 中国人民解放军总医院 | 类鼻疽伯克霍尔德菌环介导等温扩增的快速检测引物和检测方法 |
| CN105950759A (zh) * | 2016-06-23 | 2016-09-21 | 中国检验检疫科学研究院 | 用于同时检测四种病原菌的试剂盒及其非诊断性检测方法 |
-
2017
- 2017-05-27 CN CN201710392521.XA patent/CN106995855B/zh active Active
Patent Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN102146478A (zh) * | 2011-04-15 | 2011-08-10 | 中国人民解放军第三军医大学 | 一种用于鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的pcr试剂盒 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113755619A (zh) * | 2021-10-19 | 2021-12-07 | 中国医学科学院北京协和医院 | 伯克霍尔德氏菌的数字pcr检测试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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