CN106967693B - 细胞培养病毒液分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物制药生产技术领域，具体涉及一种细胞培养病毒液分离纯化方法，包括：将细胞培养病毒液低温静置使杂质充分沉淀后用无菌处理的气体给生物反应器加压，利用提上清装置进行提上清操作得到病毒液上清；将所述病毒液上清离心后进行浓缩；所述提上清装置包括导流收液桶，所述导流收液桶的侧壁上设置有进液口，所述导流收液桶的顶端与出液管相连；所述进液口上方和下方的桶身上分别设置有上挡板和下挡板，且所述上挡板和下挡板的内径均大于所述导流收液桶的内径。该方法可用于病毒液在离心前用物理的方法进行处理，能够处理掉90％左右的可见大颗粒，大大降低后期离心的难度和时间并提高纯化效率，减少纯化设备及步骤，缩短纯化时间。

Description

细胞培养病毒液分离纯化方法
技术领域
本发明涉及生物制药生产技术领域，具体而言，涉及一种细胞培养病毒液分离纯化方法。
背景技术
随着兽用生物疫苗行业的不断发展，尤其生物反应器细胞高密度悬浮培养技术的应用，人们对疫苗的安全性和副作用的认识逐步加深，分离纯化在疫苗制备和生产中的地位日益凸显，离心和沉淀作为传统的分离大颗粒物方法已在各类疫苗中得到广泛的应用。目前传统的方法主要是离心法，但由于高密度培养的细胞碎片等杂质较多，离心效果也不是很好，并且购买连续离心机的花费也比较高昂，若加上一般的自然沉降也最多只能抽出50％～60％的上清，若用化学法进行沉降，后期去除化学剂又成为难题。由于前端的分离过程效果不好，目前整个的分离纯化的过程比较繁琐，花费时间较长，病毒损耗较大等问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞培养病毒液分离纯化方法，以解决上述问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种细胞培养病毒液分离纯化方法，包括：
将细胞培养病毒液低温静置使杂质充分沉淀后用无菌处理的气体给生物反应器加压，利用提上清装置进行提上清操作得到病毒液上清；将所述病毒液上清离心后进行浓缩；
所述提上清装置包括导流收液桶，所述导流收液桶的侧壁上设置有进液口，所述导流收液桶的顶端与出液管相连；
所述进液口上方和下方的桶身上分别设置有上挡板和下挡板，且所述上挡板和下挡板的内径均大于所述导流收液桶的内径。
该方法对病毒液在离心前用物理的方法进行处理，可处理掉90％左右的可见大颗粒，可大大降低后期离心的难度和时间，大大提高纯化效率，减少纯化设备及步骤，缩短纯化时间。
优选的，如上所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，所述细胞培养病毒液的灭活在所述提上清操作之后进行。
病毒液灭活后由于灭活剂的作用，会使得细胞碎片等颗粒物变得更小，杂质难以屏蔽，不利于提清装置的处理。
优选的，如上所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，所述低温静置的温度为2～8℃，静置时间为20～28小时；
更优选的，所述低温静置的温度为4～6℃，静置时间为22～26小时。
2～8℃的温度一方面利于保持病毒的生物活性，另一方面由于低温下，杂质颗粒的布朗运动水平越低，也利于保证更好的沉降效果。
优选的，如上所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，所述浓缩的方法为膜包法。
优选的，如上所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，所述上挡板设置在所述导流收液桶的顶部，所述下挡板设置在所述导流收液桶的底部；
更优选的，所述进液口与所述下挡板相切。
优选的，如上所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，所述下挡板呈盘口朝下的圆盘形，所述上挡板为圆锥形挡板；
优选的，所述圆锥形挡板轴截面顶角为120°～140°；
优选的，所述上挡板的内径是所述导流收液桶内径的2～3倍，更优选为2.5倍；
优选的，所述下挡板的内径是所述导流收液桶内径的1.3～2倍，更优选为1.6倍。
下挡板的主要作用是阻挡下部碎片上浮；上挡板的主要作用是阻挡少量上浮的碎片或颗粒物再次下落。所述进液口位于上挡板与下挡板之间，可保证收集的上清液中杂质更少。
其中，所述圆锥形挡板的开口向下。
圆锥形挡板可在阻挡少量上浮的碎片或颗粒物再次下落的同时，使得下落的杂质物质呈辐射状地远离导流收液桶的进液口。
下挡板的形状可以设置为一个倒扣的平盘状结构，且平面与边缘处为弧形倒角，可使得上浮的杂质被困在下挡板下面，阻断效果更佳。
优选的，如上所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，所述无菌处理的气体为空气，所述空气的注入速度小于等于0.5L/s；
更优选的，所述空气的注入速度为0.1L/s～0.5L/s；还可以选择 0.2L/s～0.4L/s、0.3L/s等。
空气的注入速度决定这生物反应器中液体流动的快慢，若注入速度太快，会引起反应器中的杂质搅动剧烈，则提清效果也会受到影响；若注入速度太慢，显然会延长提清时间。
空气的注入速度与提清装置的结构有关，本发明优选的提取装置根据流体力学进行优化，使得即便再较快的提清速率下依然能保持良好的提清效果。
优选的，如上所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，所述进液口为1～7 个；更优选的，所述进液口为2～6个，也可以选择3、4、5个，最优选的，所述进液口为4个；
优选的，所述进液口的形状可以为圆形、椭圆形、矩形或上述形状的一部分如半圆形；
优选的，为保证吸收上清液的效率，所述进液口呈辐射状的等距设置于所述导流收液桶的桶壁上。
优选的，所述进液口的总表面积≥16cm2。
最优选的，若生物反应器为1500～2500L容积，则显得所述进液口为4 个，且每个进液口的开口为4cm2。
优选的，所述导流收液桶的桶身形状为圆柱体；
更优选的，所述导流收液桶的直径和桶高的比值为(100～115):150。
优选的，如上所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，所述出液管为L 形管；
更优选的，所述出液管的端部设置有阀门接口；所述阀门接口与L形管的拐角之间设置有罐体连接卡箍。
优选的，如上所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，所述提上清装置位于所述生物反应器的罐体的下1/8～1/2处，且所述导流收液桶设置于所述生物反应器的横截面中心位置。
导流收液桶的位置应该在生物反应器的靠下部位，但也不要低于静置时沉淀的密集处。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
使用本发明提供的细胞培养病毒液分离纯化方法，病毒培养液在离心前用物理的方法进行处理，可处理掉90％左右的可见大颗粒，可大大降低后期离心的难度和时间，大大提高纯化效率，减少纯化设备及步骤，缩短纯化时间。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的提上清装置的结构示意图；
图2为包含本发明提供的提上清装置的生物反应器的示意图。
附图标记：
1-导流收液桶；
2-进液口；
3-出液管；
4-上挡板；
5-下挡板；
6-阀门接口；
7-罐体连接卡箍；
8-生物反应器；
9-提上清装置。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
一种细胞培养病毒液分离纯化方法，包括：
将细胞培养病毒液低温静置使杂质充分沉淀后用无菌处理的气体给生物反应器加压，利用提上清装置进行提上清操作得到病毒液上清，对所述病毒液上清中的病毒进行灭活，离心后利用膜包法进行浓缩；
所述低温静置的温度为4℃，静置时间为24小时。
如图2所示，该提上清装置9可设置于生物反应器8中，用于病毒培养液在离心前用物理的方法进行处理。所述生物反应器8的容积为 1500～2500L，所在给生物反应器加压时使用无菌处理的空气，空气注入速度为0.1～0.5L/s，提上清装置9位于所述生物反应器8的罐体的下1/8～1/2 处，且所述导流收液桶设置于所述生物反应器的横截面中心位置。收集得到病毒液上清会在压力的作用下流入进液口2，经由导流收液桶1流向出液管3。
该提上清装置结构如图1所示，包括导流收液桶1、进液口2、出液管3、上挡板4、下挡板5。
所述装置的主体为导流收液桶1，所述导流收液桶1的侧壁上设置有进液口2，所述导流收液桶1的顶端与出液管3相连；
所述进液口2上端和下端的桶身上分别设置有上挡板4和下挡板5，且所述上挡板4和下挡板5的内径均大于所述导流收液桶1的内径。
下挡板5的主要作用是阻挡下部碎片上浮；上挡板4的主要作用是阻挡少量上浮的碎片或颗粒物再次下落。所述进液口2位于上挡板4与下挡板5之间，可保证收集的上清液中杂质更少。
优选的，所述提上清装置的材质可选择防腐蚀的材料，例如不锈钢，氧化铝、钛合金等。
优选的，所述上挡板4和下挡板5与所述导流收液桶1的连接方式为焊接。
为保证阻挡杂质的效果好，优选的，所述上挡板4设置在所述导流收液桶1的顶部；
优选的，所述下挡板5设置在所述导流收液桶1的底部；
进液口2也可以设置在所述导流收液桶1的底部，优选的，所述进液口2与所述下挡板5相切。
优选的，如上所述的提上清装置，所述上挡板4为圆锥形挡板；更优选的，所述圆锥形挡板轴截面的顶角为120°～140°；最优选为130°。
圆锥形挡板可在阻挡少量上浮的碎片或颗粒物再次下落的同时，使得下落的杂质物质呈辐射状地远离导流收液桶1的进液口2。
优选的，如上所述的提上清装置，所述下挡板5为平面挡板，且边缘处向下方延伸；更优选的，边缘处沿弧形倒角向下方延伸。
下挡板5的形状可以设置为一个倒扣的平盘状结构，弧形倒角可使得上浮的杂质被困在下挡板5下面，阻断效果更佳。
优选的，如上所述的提上清装置，所述进液口2为1～7个。
更优选的，所述进液口2为2～6个，也可以选择3、4、5个，最优选的，所述进液口2为4个。
优选的，所述进液口2的形状可以为圆形、椭圆形、矩形或上述形状的一部分如半圆形。
优选的，为保证吸收上清液的效率，所述进液口2呈辐射状的等距设置于所述导流收液桶的桶壁上。
优选的，如上所述的提上清装置，导流收液桶1的桶身形状为圆柱体。
优选的，如上所述的提上清装置，所述出液管3为L形管，且所述出液管3的端部设置有阀门接口6；
所述阀门接口与L形管的拐角之间设置有罐体连接卡箍7。
为进一步说明发明的技术效果，将给出一个实际应用的案例，细胞培养病毒液分离纯化方法同上面所述，具体在该案例中，生物反应器的容积为2000L，生物反应器罐体的高为0.8米为圆柱体。提上清装置的导流收液桶位于距离罐底10cm处的中心位置。下进液口有4个，每个进液口的开口大小为4cm2。导流收液桶为直径10cm高15cm的圆柱体，上挡板为顶角 130°的圆锥形，下挡板呈盘口朝下的圆盘形，上挡板的直径为25cm，下挡板直径16cm。在注入无菌空气时，空气的流速为120ml/s～130ml/s。实验组和对照组使用的生物反应器相同，所处理的样品也培养状况也相同，区别在于：
未用提清装置的纯化浓缩工艺：离心去碎片→中空纤维柱澄清→膜包浓缩；
使用提清装置的纯化浓缩工艺：静置提清→离心去碎片→膜包浓缩。
结果如表1所示。
表1
通常目前各个厂家的离心机采用进口连续流离心机，生产用离心机基本都在几百万元人名币，而本发明提供的病毒液分离纯化方法由于前端处理比较好，所以用国产管式离心机就可以满足生产要求，国产离心机仅十几万人民币，可以大幅度降低分离纯化的成本。
经离心处理后的病毒液浊度较低，可直接进入膜包进行浓缩处理。而目前大多厂家经离心处理后的病毒液浊度仍然较高，需要再用中空纤维设备继续进行澄清，然后再进入膜包进行浓缩处理。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (18)

1.一种细胞培养病毒液分离纯化方法，其特征在于，包括：
将细胞培养病毒液低温静置使杂质充分沉淀后用无菌处理的气体给生物反应器加压，利用提上清装置进行提上清操作得到病毒液上清；将所述病毒液上清离心后进行浓缩；
所述提上清装置包括导流收液桶，所述导流收液桶的侧壁上设置有进液口，所述导流收液桶的顶端与出液管相连；
所述进液口上方和下方的桶身上分别设置有上挡板和下挡板，且所述上挡板和下挡板的内径均大于所述导流收液桶的内径。
2.如权利要求1所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，其特征在于，所述细胞培养病毒液的灭活在所述提上清操作之后进行。
3.如权利要求1所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，其特征在于，所述低温静置的温度为2～8℃，静置时间为20～28小时。
4.如权利要求1所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，其特征在于，所述浓缩的方法为膜包法。
5.如权利要求1所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，其特征在于，所述上挡板设置在所述导流收液桶的顶部，所述下挡板设置在所述导流收液桶的底部。
6.如权利要求5所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，其特征在于，所述进液口与所述下挡板相切。
7.如权利要求1所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，其特征在于，所述下挡板呈盘口朝下的圆盘形，所述上挡板为圆锥形挡板。
8.如权利要求7所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，其特征在于，所述圆锥形挡板轴截面顶角为120°～140°。
9.如权利要求7或8所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，其特征在于，所述上挡板的内径是所述导流收液桶内径的2～3倍。
10.如权利要求9所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，其特征在于，所述上挡板的内径是所述导流收液桶内径的2.5倍。
11.如权利要求7、8、10任一项所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，其特征在于，所述下挡板的内径是所述导流收液桶内径的1.3～2倍。
12.如权利要求11所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，其特征在于，所述下挡板的内径是所述导流收液桶内径的1.6倍。
13.如权利要求7、8、10、12任一项所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，其特征在于，所述无菌处理的气体为空气，所述空气的注入速度小于等于0.5L/s。
14.根据权利要求1所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，其特征在于，所述进液口为1～7个。
15.根据权利要求14所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，其特征在于，所述进液口为4个。
16.如权利要求1所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，其特征在于，所述出液管为L形管。
17.如权利要求16所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，其特征在于，所述出液管的端部设置有阀门接口；所述阀门接口与L形管的拐角之间设置有罐体连接卡箍。
18.如权利要求1所述的细胞培养病毒液分离纯化方法，其特征在于，所述提上清装置位于所述生物反应器的罐体的下1/8～1/2处，且所述导流收液桶设置于所述生物反应器的横截面中心位置。
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