CN106947808A

CN106947808A - Tmem104基因在制备治疗椎间盘退行性疾病药物中的应用

Info

Publication number: CN106947808A
Application number: CN201710141006.4A
Authority: CN
Inventors: 张艳
Original assignee: Beijing Winner Biotechnology Co Ltd
Current assignee: BEIJING ZHICHENG BIOMEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2017-03-10
Filing date: 2017-03-10
Publication date: 2017-07-14
Anticipated expiration: 2037-03-10
Also published as: CN106947808B

Abstract

本发明公开了一种检测椎间盘退行性疾病的产品。本发明还公开了一种检测椎间盘退行性疾病的试剂盒。本发明进一步公开了TMEM104基因在制备治疗椎间盘退行性疾病的药物中的应用。本发明实验证实TMEM104基因表达水平在椎间盘退行性疾病组织中表达上调，因此，利用TMEM104基因检测椎间盘退行性疾病不仅能够快速有效的做到早期诊断，其精确度大大提高。本发明通过干扰髓核细胞中TMEM104基因的表达可以明显促进细胞增殖和抑制细胞凋亡，因此，TMEM104基因为椎间盘退行性疾病的基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。

Description

TMEM104基因在制备治疗椎间盘退行性疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及TMEM104基因在制备治疗椎间盘退行性疾病药物中的应用。

背景技术

椎间盘退行性疾病是指椎间盘组织在多种原因综合作用下发生细胞介导的生物化学变化，引起老化加速、椎间盘力学特性改变，使临近骨关节、韧带发生相应变化，造成脊柱不稳，压迫脊髓、神经根、动脉，引起相应临床症状和体征的综合征。它包括椎间盘源性腰痛、椎间盘突出症、退行性脊椎不稳症、退行性椎管狭窄症、退行性滑脱症等，是临床上常见疾病之一。其病因尚不清楚，目前普遍认为椎间盘退行性疾病的发生是遗传和环境因素共同作用的结果。随着基因检测技术的发展，近年来，人们逐渐意识到遗传易感性即遗传因素对于揭示椎间盘退行性疾病发病的重要作用。

目前椎间盘退行性疾病一般采取保守治疗，即从保守治疗依次到微创、常规手术治疗、非融合固定治疗、融合固定治疗的阶梯。越是高级阶梯的治疗，创伤越大，对机体自然解剖状态的干预越大，每一高级阶梯的治疗可作为对相对低级阶梯治疗的补救措施。对患者采取的治疗方案要根据患者病情所处的阶段，同时也要考虑到患者个体因素，如创伤、风险、费用以及患者的意愿。但是无论哪种手术方式，均不能在椎间盘退变的早期进行有效地干预，不能延缓或逆转疾病的发展。开放手术(椎间盘切除融合内固定术)虽能较为彻底的切除退变椎间盘，但手术创伤大，费用高，内固定限制了脊柱的活动度，加速邻近节段椎间盘的退变。微创手术不能彻底切除退变椎间盘组织，术后症状可能不能完全缓解，术后复发的可能性较大。

TMEM104基因(transmembrane protein 104，跨膜蛋白104)，在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)基因库的参考序列为NM_001321264.1，位于人类染色体17q25.1，是蛋白编码基因，参与氨基酸运输。

发明内容

为了实现椎间盘退行性疾病的早期发现，早期干预，本发明的目的之一在于提供一种检测椎间盘退行性疾病的产品。

本发明的目的之二在于提供一种检测椎间盘退行性疾病的试剂盒。

本发明的目的之三在于提供TMEM104基因在制备治疗椎间盘退行性疾病的药物中的应用。

为实现上述目的，本发明首先提供一种检测椎间盘退行性疾病的产品，所述产品能够通过检测组织样本中TMEM104基因或其表达产物的表达水平来诊断椎间盘退行性疾病。

优选地，所述TMEM104基因或其表达产物在椎间盘退行性疾病组织中表达上调。

优选地，所述的检测包括基因水平的检测和蛋白水平的检测，所述基因水平检测包括RT-PCR法、实时定量PCR法、基因芯片法和高通量测序法；所述蛋白水平的检测包括免疫组化、胶体金法、ELISA法和Western blot法。

优选地，所述实时定量PCR法包括SYBRGreen法和TaqMan探针法。

优选地，所述产品包括芯片、试剂盒或试剂。

优选地，所述试剂盒可以是检测TMEM104基因转录水平的试剂盒，如QPCR试剂盒，也可以是检测TMEM104蛋白的表达水平的试剂盒，如ELISA试剂盒；所述芯片可以是基因芯片或是蛋白芯片，其能够检测TMEM104基因的表达水平；所述试剂包括TMEM104的特异性引物和TMEM104基因表达蛋白的特异性抗体。

优选地，所述ELISA试剂盒除包含与TMEM104蛋白特异性结合的抗体之外，还包含包被缓冲液、洗涤液、封闭液、加样缓冲液、反应终止液、目的蛋白标准品。

优选地，所述与TMEM104蛋白特异性结合的抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。上述抗体可以从商业途径获取，也可以使用一系列本领域已知的方法来制备。例如，将纯化的人TMEM104蛋白或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗体。同样，表达人TMEM104蛋白或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。单克隆抗体可用杂交瘤技术制备。TMEM104蛋白的抗体包括可以阻抑TMEM104蛋白功能的抗体，也可以是不影响人TMEM104蛋白功能的抗体。

优选地，所述包被缓冲液为磷酸盐缓冲液PBS，其成分为140mM NaCl，2.7mM KCl，10mMNa₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH值为7.4。

优选地，洗涤液为含1％Tween-20的PBS，称为PBST，其成分为PBS，1％Tween-20。

优选地，封闭液为含1％BSA的PBS，其成分为PBS，1％BSA。

优选地，加样缓冲液的成分为50mM Tris-HCl，0.5M KCl，1％BSA，0.05％Tween-20，pH值为8.4。

优选地，反应终止液成分为2M H₂SO₄。

进一步地，本发明提供了一种检测椎间盘退行性疾病的试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)组织样品提取总RNA试剂；

(2)反转录试剂；

(3)定量PCR试剂。

优选地，组织样品提取总RNA试剂包括TRizol、三氯甲烷、异丙醇、75％乙醇和无酶水；所述反转录试剂包括：5x逆转录缓冲液、SuperRT逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPS、OligodT Primer(或Random 6mers)和RNase Free dH₂O。

优选地，逆转录反应液包含：250mM pH8.3的Tris-HCl，375mM的KCl，15mM的MgCl₂，50mM的DTT。

优选地，所述定量PCR试剂包括特异性扩增TMEM104基因的引物组以及特异性捕获TMEM104基因的荧光探针。

优选地，所述的引物组包括如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的上游引物和如SEQID NO:3所示核苷酸序列的下游引物，所述荧光探针为如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列。

优选地，所述定量PCR试剂还包括PCR缓冲液、dNTP、Taq酶。优选地，所述试剂盒含有阳性对照和阴性对照。优选地，所述阳性对照为正常的椎间盘髓核组织RNA或DNA，所述阴性对照为ddH₂O。优选地，所述PCR缓冲液包含：25mM KCl，2.5mM MgCl₂，200mM(NH₄)₂SO₄。

进一步地，本发明还提供TMEM104基因在制备治疗椎间盘退行性疾病的药物中的应用。

优选地，所述药物包括促进椎间盘退行性疾病细胞增殖的药物和抑制椎间盘退行性疾病细胞凋亡的药物。

优选地，所述药物包括通过干扰RNA抑制TMEM104基因表达的siRNA或用于抑制TMEM104蛋白活性的蛋白质。

在本发明中，所述RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因功能和许多疾病的基因治疗领域中。以细胞为基础的RNAi筛选在功能基因学研究方面具有许多优势，主要表现在大多数细胞类型都能使用RNAi方法，并且相对较容易下调或沉默任何目的基因的表达。

优选地，所述siRNA包括如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。

优选地，所述药物可根据需要制备成各种剂型，包括但不限于，片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

优选地，所述药物还可与其他治疗椎间盘退行性病变的药物联用，多种药物联合使用可以大大提高治疗的成功率。

本发明的有益效果如下：

本发明发现了一种椎间盘退行性疾病诊断分子标记物TMEM104基因，并进一步证实TMEM104基因表达水平在椎间盘退行性疾病组织中表达上调。因此，利用TMEM104基因检测椎间盘退行性疾病不仅能够快速有效的做到早期诊断，其精确度大大提高。本发明还通过干扰髓核细胞中TMEM104基因的表达可以明显促进细胞增殖和抑制细胞凋亡，因此，TMEM104基因为椎间盘退行性疾病的基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。

附图说明

图1实时荧光定量PCR检测TMEM104基因在椎间盘退行性疾病髓核组织中的表达情况；

图2实时荧光定量PCR检测siRNA-TMEM104对椎间盘退行性疾病髓核细胞中TMEM104基因表达的影响；

图3利用CCK-8法检测TMEM104基因对髓核细胞增殖的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。

本发明的技术方案主要包括：

利用高通量测序方法对15例椎间盘退行性疾病患者的髓核组织样本TMEM104基因的水平与6例对照样本的髓核组织中进行差异比较。

采用TaqMan实时荧光定量PCR方法验证TMEM104基因在椎间盘退行性疾病患者髓核组织中的表达情况。

本领域技术人员可知，椎间盘退行性病变发生的一个重要的生理特征在于髓核细胞的增殖减缓、衰老加快、凋亡加剧，利用RNA干扰技术使体外培养的髓核细胞中TMEM104基因沉默，进一步检测髓核细胞增殖和凋亡情况。

本发明所述“TMEM104基因”包括以下核酸序列：

(a)具有SEQ ID NO：1的核酸序列的核酸，

(b)关于(a)的核酸的简并核酸，和

(c)与(a)或(b)的核酸至少98％或至少99％同一的核酸。

实施例1筛选与椎间盘退行性疾病相关的基因标志物

1、样本收集

取2012年10月到2015年12月期间在北京协和医院骨科收集15例椎间盘退行性疾病患者作为实验组，对照组来源于同时期骨科住院的其他疾病患者，共收集6例。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。获取所有研究对象椎间盘髓核组织，编号后置-80℃低温冰箱保存。

2、对髓核组织进行总RNA提取

采用Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

收集样本后冻存于液氮，取出后把髓核组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：

①加入Trizol，室温保存5分钟；

②加氯仿0.2mL，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5分钟-10分钟；

③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；

④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按1mL/mL Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；

⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；

⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-80℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。

3、RNA样品的质量分析

RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

4、高通量测序

测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了Gene Ontology和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异性表达基因TMEM104，该基因在髓核组织样本中表达上调。

实施例2实时荧光定量PCR验证椎间盘退行性疾病患者TMEM104基因的表达情况

1、材料

按照实施例1的样本收集方式收集10例椎间盘退行性疾病患者髓核组织及8例对照髓核组织，对其进行分组及编号。

2、方法

2.1对髓核组织进行总RNA提取，同实施例1的提取方法。

2.2逆转录

采用RT reagent kit(Takara，货号DRR037A)进行cDNA反转录。采用10μL反应体系：5xPrimerScript Buffer 2μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μL、OligodT Primer 0.5μL、Random 6 mers 2μL、RNA模板为0.5μg和RNase Free dH₂O补至10μL。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。

2.3 TaqMan PCR

利用ABI Primer Express 3.0软件设计管家基因(Actin)和目的基因(TMEM104，NM_001321264.1)的荧光定量扩增引物及探针，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物和探针序列如表1所示：

表1引物和探针序列表

用Probe qPCR Mix(TOYOBO)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。荧光定量PCR反应体系如下：THUNDERBIRD Probe qPCR Mix：12.5uL，引物(10μM)：正、反向引物各0.8uL，TaqMan Probe(10μM)：0.4uL，ROX Reference Dye(50×)：0.5uL，RNase-free dH₂O：8uL，模板cDNA：2uL，总体系25uL。反应程序在ABI7500上进行，扩增程序为：95℃5min，(95℃15sec，59℃35sec)×40个循环。

3、统计学分析

实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，基线平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；采用2^-ΔΔCt法分析结果，比较TMEM104基因在椎间盘退行性疾病患者髓核组织和对照组髓核组织中的表达水平。结果显示：实时定量PCR扩增结果稳定，其中TMEM104基因在椎间盘退行性疾病组织表达水平明显高于对照组，约是对照组的3.5倍，具体见图1，以上结果验证了高通量测序分析的结果。

实施例3 RNAi干扰椎间盘退行性疾病患者髓核细胞中TMEM104表达

一、细胞培养

(1)将获取的髓核组织在无菌条件下用D-HANKS(华迈科，货号HMK03230)液冲洗3次。

(2)用剪刀将髓核组织剪碎(约1mm³大小)，置于无菌离心管中。

(3)使用0.25％胰蛋白酶于37℃消化20min，每5min摇动一次。

(4)800rpm离心5min，弃去上清液。

(5)0.2％Ⅱ型胶原酶37℃消化4h，用200目筛网过滤。

(6)滤液以800rpm离心5min，弃去上清液。

(7)DMEM/F12培养基冲洗，800rpm离心5min，重复3次。

(8)细胞计数后接种于培养瓶，含10％体积胎牛血清的DMEM/F12培养基作为养液，于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。

二、siRNA设计与合成

依据在线设计软件siDirect version 2.0(http://design.rnai.jp/)，根据基因序列参照NCBI:NM_001321264.1(TMEM104)，设计相应的siRNA，具体序列见表2。设计后送往公司合成。

表2 siRNA序列列表

三、细胞转染

1、转染

实验分为阴性对照组和实验组，按照Lipofectamine^TM2000 TransfectionReagent提供的步骤进行。

(1)将5×10⁴细胞接种在6孔板上，这些用于初期接种的细胞数量，应能在24小时内使细胞汇合达到70％；

(2)准备质粒DNA-Lipofectamine^TM 2000复合物:

a.以250μL Opti-MEM稀释5μL Lipofectamine^TM 2000，轻轻混匀，室温下孵育5分钟；

b.实验各组分别取7.5uL siRNA加入250uL Opti-MEM I中进行稀释，并轻轻摇动将其混匀；

c.孵育5分钟后，将稀释的siRNA和Lipofectamine^TM 2000混合后在室温下孵育20分钟。

(3)在培养板中的每个孔中都加入细胞、培养基及siRNA-LipofectamineTM 2000复合物。然后轻轻摇动培养板，使他们充分混合；

(4)转染放置在37℃，CO₂培养箱内孵育48小时。

2、利用QPCR检测TMEM104基因的转录水平

2.1细胞总RNA的提取步骤同实施例2。

2.2逆转录步骤同实施例2。

2.3 QPCR扩增步骤同实施例2。

3、实验结果

如图2所示，siRNA-TMEM104能有效抑制TMEM104基因的表达。

实施例4 TMEM104对人椎间盘退行性疾病细胞增殖的影响

细胞分组：髓核细胞加非特异性的siRNA组、髓核细胞加siRNA-TMEM104组。

取对数增殖期细胞配置成1×10⁴/mL单细胞悬液接种于96孔板，每孔100μL，每组设6个复孔。待细胞贴壁后，加入CCK-8试剂，2h后用酶标仪测定其450nm波长吸光度值作为零点。之后分别在12、24、48和72小时节点上，每孔加入CCK-8试剂10μL温育2h后，酶标仪测定细胞吸光度值，绘制细胞生长。

结果如图3所示，抑制TMEM104表达后，髓核细胞在0-24小时细胞增殖不明显，但是随着时间的增加，在48、72小时节点上髓核细胞增殖率显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例5 TMEM104对人椎间盘退行性疾病细胞凋亡的影响

使用流式细胞仪检测TMEM104基因对细胞凋亡的影响。

3.1步骤

按照实施例3方法进行细胞转染，转染72h后，使用预冷PBS洗涤细胞，然后用0.25％胰酶消化细胞，中止消化，将离心收集的细胞使用PBS重悬，将细胞定量为1×106个/mL，取200μL上述细胞悬液放置到Appendorf管中，加入10μL Annexin-V-FITC混匀，室温暗处孵育染色15min，上机前5min加入10mg/L碘化丙锭(PI)染色5μL。未转染siRNA的细胞分别用Annexin-V-FITC和PI染色用于标准定量。用FACS流式细胞仪进行双色荧光细胞流式计数，观察凋亡细胞百分比。

3.2统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS19.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用的t检验，认为当P＜0.05时具有统计学意义。

3.3结果

TMEM104基因干扰组的细胞凋亡率为(12.39±0.26)％，阴性对照组的细胞凋亡率为(42.43±2.13)％，上述差异具有统计学意义(P＜0.05)，上述结果表明抑制TMEM104基因的表达能明显抑制髓核细胞的凋亡。

实施例6试剂盒的制备

本实施例检测椎间盘退行性疾病的试剂盒包括以下组成部分：

(1)组织样品提取总RNA试剂包括TRizol、三氯甲烷、异丙醇、75％乙醇和无酶水；

(2)反转录试剂包括：5x逆转录缓冲液、SuperRT逆转录酶、dNTPS、OligodTPrimer、Random 6mers和RNase Free dH₂O，所述逆转录反应液包含：250mM pH8.3的Tris-HCl，375mM的KCl，15mM的MgCl₂，50mM的DTT。进行1次反转录PCR的用量如表3所示，反应程序为：42℃30min，85℃5min。

表3反转录试剂体系

组分	加入量
		5x逆转录缓冲液	4μL
OligodT Primer(50μM)	0.5μL
		Random 6 mers(100μM)	2μL
SuperRT逆转录酶(200U/μL)	1μL
		dNTPs(2.5mM)	4μL
总RNA	1μg
		RNase Free dH2O	至20μL

(3)定量PCR试剂包括：PCR Mix反应体系、Actin和TMEM104的引物和探针。所述PCRMix反应体系的组分包含反应缓冲液、dNTPs、rTaq DNA聚合酶及抗DNA聚合酶抗体的2×预混液。所述引物和探针见表1所示。进行1次定量PCR的用量如表4所示。反应程序为95℃5min，(95℃15sec，59℃35sec)×40个循环。

表4定量PCR体系

组分	加入量
		PCRMix反应体系	12.5μL
上游引物(10μM)	0.5μL
		下游引物(10μM)	0.5μL
TaqMan Probe(10μM)	0.4μL
		模板cDNA	2.0μL
加入灭菌蒸馏水	至25μL

试剂盒还包括：阳性对照为正常的椎间盘髓核组织RNA或DNA和阴性对照为ddH₂O。

一个试剂盒可以包括上述各成分进行多次PCR的用量，如25次、50次、100次等，各成分的具体量视情况需要而定。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京赛尔得生物技术有限公司

<120> TMEM104基因在制备治疗椎间盘退行性疾病药物中的应用

<130> p16zjp20

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1803

<212> DNA

<213> 基因序列

<400> 1

ggcgcatgcg cgctgcggaa gctggtgctg gacagctggc gccggcagca gcggaccggc 60

gggagacggc ggcttgggag ctggctgtgc tgcaggagct gcggcagccg ccgtccttgc 120

acctaaggaa cctctgctgc cagcccttcc tcacttttgg aaatggcggg tgaaattaca 180

gagaccgggg aactctactc ttcctacgtt gggctggtgt acatgtttaa cctcatcgtg 240

ggcacgggcg cactcaccat gcccaaggca ttcgccactg ccgggtggct tgtcagcctc 300

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acagaccggg tggaaatggg acaaatggcc tccatgttct tcaataaagt gggggtcaac 600

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gcctaccgca tctacttggc gatcttcact ctcctcctcg gaccgttcac cttctttgac 840

gtccagaaga ccaagtacct gcagatcctg acctctctga tgagatggat cgatgggccc 900

ccggggtcag tgatgggaag agcagaagag gatgccagcc cagcctggcc caggagcagg 960

tgtcgttgtg gaggaaagct taaactcaac agcctctacc caacatctgc cacctgcatg 1020

gccccagatg cccccggtgc aggccaggtc aaggtgggag taaactttct ttgcctccct 1080

ccccacagaa gcaccagacc cacctgagcc ccagagcctc atgccagcag ctcctggctg 1140

ttcctcacct gaggctagag cagcagctgc cagcttatag atggggcgga tggcaggtga 1200

tagactggga agcactgctg ggtggtggag gtgggcagtg gcaccatgac gggcccctag 1260

ccacacagct gtcctcacta cggggcaggg agcagcctcg gcaacaggca aaggccagag 1320

tcagagtggt ggggaggaca ggggctgctg ccccgctcct ggaaagccac tgcagagggg 1380

cagtggctgg cagtgccagg cctgggggaa gtggaagcgt cctgtctggg ggcagattcc 1440

caagcaaggg tgacccatgg ttaagggcca ctggaaagct ggagagagct tgggatccct 1500

tccacctggg gccaatggtg ttgattgcag actggagggg taacctccgc tgagggtcat 1560

tatgtgccag gcatggcatt gggtactttc tgcattggga ccaggcagcc gggcctgcca 1620

tttgaggcag cgagcctccg tgacctgtcc tccctcattt gtaaagtggg gtaacagcta 1680

tgtcactggc cagttgtggg gattaaagtg ctgagcttag tgcccagccc aaaatgctca 1740

ataaagctat tcagtgatac ctgtttccca catcactcac cagccataaa aaaaaaaaaa 1800

aaa 1803

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tggacgccta ccgcatctac 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tctggacgtc aaagaaggtg aa 22

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tggcgatctt cactctcctc ctcgg 25

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gatacgaagg gagggtgtac ca 22

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctcggccagg gtgttgaa 18

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcttctgatg gcaagctcta cgtctcctt 29

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

aauuucaccc gccauuucca a 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggaaauggcg ggugaaauua c 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 10

auuuugcggu ggaaaugucc u 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 11

gacauuucca ccgcaaaaug g 21

Claims

1.一种检测椎间盘退行性疾病的产品，其特征在于，所述产品能够通过检测组织样本中TMEM104基因或其表达产物的表达水平来诊断椎间盘退行性疾病。

2.如权利要求1所述的产品，其特征在于，所述TMEM104基因或其表达产物在椎间盘退行性疾病组织中表达上调。

3.如权利要求1或2所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒或试剂。

4.一种检测椎间盘退行性疾病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(1)组织样品提取总RNA试剂；

(2)反转录试剂；

(3)定量PCR试剂。

5.如权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述定量PCR试剂包括特异性扩增TMEM104基因的引物组以及特异性捕获TMEM104基因的荧光探针。

6.如权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述的引物组包括如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的上游引物和如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的下游引物，所述荧光探针为如SEQID NO:4所示核苷酸序列。

7.TMEM104基因在制备治疗椎间盘退行性疾病的药物中的应用。

8.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述药物包括促进椎间盘退行性疾病细胞增殖的药物和抑制椎间盘退行性疾病细胞凋亡的药物。

9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述药物包括通过干扰RNA抑制TMEM104基因表达的siRNA或用于抑制TMEM104蛋白活性的蛋白质。

10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述siRNA包括如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。