CN106937594A

CN106937594A - 一种促进茄子花粉胚增殖的方法

Info

Publication number: CN106937594A
Application number: CN201710134062.5A
Authority: CN
Inventors: 杨洋; 田时炳; 王永清; 王之劲; 邹敏; 连勇; 刘富中; 冯雨实
Original assignee: Chongqing Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Chongqing Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-03-07
Filing date: 2017-03-07
Publication date: 2017-07-11

Abstract

本发明属于农业单倍体育种技术领域，公开了一种促进茄子花粉胚增殖的方法。将茄子花药培养出花粉胚，取出带有花粉胚的单个花药，移至胚增殖培养基中，胚增殖培养基：MS+0.01～0.05mg·L^‑1 NAA+1～2mg·L^‑1 KT+2％蔗糖+7g·L^‑1琼脂，pH5.8；最后将单个胚状体再生培养获得单倍体植株。本发明避免了药壁愈伤组织分化为二倍体，提高了单倍体植株产生的效率，同时又不需要如小孢子培养中复杂的培养条件和繁琐的操作步骤，成本降低50％以上，更利于实际应用。常规茄子花药培养出胚数平均为1‑3个，通过胚增殖技术，可以将70％已出胚的单个花药的出胚数平均增殖至5个以上，最多可达45个。

Description

一种促进茄子花粉胚增殖的方法

技术领域

本发明属于农业单倍体育种技术领域，尤其涉及一种促进茄子花粉胚增殖的方法。

背景技术

人工产生单倍体主要由花药培养和小孢子(花粉)培养来实现。经自发加倍或人工诱发加倍，获得纯合可育的二倍体植株，使育种者可以选择满意的基因组合，为进一步的育种和遗传研究提供有用材料。愈伤诱导和胚状体诱导是花药和小孢子培养的两种主要诱导途径。愈伤诱导途径是通过组培技术将处于一定发育阶段的花粉诱导形成细胞团，进一步形成无分化的薄壁组织即愈伤组织，再分化形成完整的植株。胚状体诱导途径是由花粉直接诱导分化形成胚状体，胚状体再直接分化形成的植株。愈伤诱导相对容易，可获得再生率较高的再生植株。但由于花丝和包裹花粉的花药壁属于二倍体组织，因此通过愈伤诱导形成的再生植株的其倍性容易混杂，需要后期经过大量的细胞学鉴定确认植株的倍性后才能在实际应用中得到应用。在现有专利权的茄子花药、小孢子培养操作中主要利用愈伤诱导实现。花粉胚诱导可直接产生单倍体植株，省却对其倍性进行鉴定的步骤，节约大量的时间和精力。花药培养和小孢子培养均可以诱导花粉的胚状体。小孢子培养胚状体诱导效率虽高于花药培养，但其技术难度、操作要求和应用成本均高于花药培养，并且植株的再生率要低于花药培养。

综上所述，现有技术存在的问题是：利用花药培养诱导花粉胚获得单倍体植株的操作难度、应用成本更低，但胚状体的诱导效率低。在传统的花药培养过程中，导致花粉胚状体诱导效率低的主要原因涉及营养条件、激素配比、培养条件等各个方面。而提高花药培养的胚状体诱导率需要大量的取样、设计、试验比较，对多因素进行调整以及筛选，并从花粉胚产生开始全过程跟踪记录每一个胚分化生长的情况。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种促进茄子花粉胚增殖的方法。

本发明是这样实现的，通过在茄子花粉胚萌动时调整外源激素的配比达到刺激多胚萌发的效果。试验证明调整胚分化培养基中的生长素和细胞分裂素的配比浓度，可以提高花粉胚状体的诱导频率，由此获得一种促进茄子花粉胚增殖的方法，所述促进茄子花粉胚增殖的方法采用胚增殖培养；

所述胚增殖将茄子花药培养出胚状体，待胚状体肉眼可见，取出带有胚状体的单个花药，移至胚增殖培养基中。胚增殖培养基：MS+0.01～0.05mg·L^-1NAA+1～2mg·L^-1KT+2％蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 5.8；将单个胚状体移至到再生培养基上再生植株；再生培养基：MS+3％蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 5.8。

进一步，所述胚增殖之前需要进行：

(1)茄子花蕾选择二薹花以上，发育正常，无表面损伤、花萼包裹紧密的花蕾，花冠或低或高于花萼裂基部1-2mm时；

(2)将采集到的适宜大小的花蕾用封口袋封闭，冰盒运输，并放入4℃冷藏室保存24-48h备用；

(3)茄子花蕾表面用70％酒精进行消毒30s、无菌水清洗3次、1g·L^-1的HgCl₂加吐温1滴浸泡7min、无菌水清洗5次，后用无菌纸吸干花蕾；从花蕾中剥取花药，接种于装有培养基的培养皿中；

(4)将接种好的花药放到暗培养箱中进行36℃，6～7d的热激处理；

(5)经高温热激处理后的花药放置在25℃±1℃，光照强度1500-2500Lx，光照时间12-16h，湿度60％下培养5d，然后转移至分化培养基上，之后每隔15-20d继代一次；

进一步，所述接种培养基：MS+0.2mg·L^-12,4-D+1mg·L^-1KT+8mg·L^-1Vc+4mg·L^- ¹AgNO₃+3％蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 5.8。

进一步，所述分化培养基：MS+0.1mg·L^-1KT+8mg·L^-1Vc+3％蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH5.8。

本发明的优点及积极效果为：利用花药培养技术直接诱导胚状体的形成，避免了愈伤组织的产生，诱胚率提高至15％(诱胚率＝产生胚状体数目/接种花药数×100％)，同时又不需要如小孢子培养中复杂的培养基和繁琐的操作步骤，成本降低50％以上，更利于实际应用。未经过胚增殖培养的花粉胚，出胚数平均为1-3个。通过胚增殖技术，可以将70％已出胚的单个花药的出胚数平均增殖至5个以上，最多可增殖至45个，极大的提高了获得花培植株的效率。

本发明利用在常规花药培养过程中增加胚增殖培养步骤，在茄子花药出胚时期，利用出胚花药的胚型分化条件，调整激素配比、营养条件，促进多个花粉细胞的胚分化，从而使出胚花药表现出多胚的萌发。茄子出胚花药的出胚数可显著增加2倍以上，可将花药培养的诱胚率提高至15％。

附图说明

图1是本发明实施例提供的促进茄子花粉胚增殖的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的不同茄子材料在不同培养基中单个出胚花药的平均出胚数示意图。

图3是本发明实施例提供的花粉胚增殖培养植株的倍性鉴定示意图；

图中：A：对照二倍体植株；B：混倍体植株；C、D：单倍体植株。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的促进茄子花粉胚增殖的方法包括以下步骤：

S101：茄子花蕾选择二薹花以上，发育正常，无表面损伤、花萼包裹紧密的花蕾，花冠或低或高于花萼裂基部1-2mm时，此时花药一般为黄绿色；

S102：将采集到的适宜大小的花蕾用封口袋封闭，冰盒运输，并放入4℃冷藏室保存24-48h备用；

S103：茄子花蕾表面用70％酒精进行消毒30s、无菌水清洗3次、1g·L^-1的HgCl2加吐温1滴浸泡7min、无菌水清洗5次，后用无菌纸吸干花蕾。从花蕾中剥取花药，接种于装有培养基的培养皿中；接种培养基：MS+0.2mg·L^-12,4-D+1mg·L^-1KT+8mg·L^-1Vc+4mg·L^- ¹AgNO₃+3％蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 5.8；

S104：将接种好的花药放到暗培养箱中进行36℃，6～7d的热激处理；

S105：经高温热激处理后的花药放置在(25±1)℃，光照强度1500-2500Lx，光照时间12-16h，湿度60％下培养5d，然后转移至分化培养基上：MS+0.1mg·L^-1KT+8mg·L^-1Vc+3％蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 5.8，之后每隔15-20d继代一次；

S106：茄子花药培养一般30-40d左右出现胚状体，待胚状体肉眼可见，取出带有胚状体的单个花药，移至胚增殖培养基中，胚增殖培养基：MS+0.01～0.05mg·L^-1NAA+1～2mg·L^-1KT+2％蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 5.8，对照培养基为分化培养基；

S107：随着胚状体一端颜色逐渐转绿出现绿色小芽时，将单个胚状体移至到再生培养基上再生植株；再生培养基：MS+3％蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 5.8；

S108：取叶样采用流式细胞仪检测倍性。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。

实施例1：

一、本发明的实施例的具体步骤为：

1、材料的选择

茄子花蕾选择二薹花以上，发育正常，无表面损伤、花萼包裹紧密的花蕾，花冠或低或高于花萼裂基部1-2mm时，此时花药一般为黄绿色。

2、低温预处理

将采集到的适宜大小的花蕾用封口袋封闭，冰盒运输，并放入4℃冷藏室保存24-48h备用。

3、接种

茄子花蕾表面用70％酒精进行消毒30s、无菌水清洗3次、1g·L^-1的HgCl₂加吐温1滴浸泡7min、无菌水清洗5次，后用无菌纸吸干花蕾。从花蕾中剥取花药，接种于装有培养基的培养皿中。接种培养基：MS+0.2mg·L^-12,4-D+1mg·L^-1KT+8mg·L^-1Vc+4mg·L^-1AgNO₃+3％蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 5.8。

4、高温热激处理

将接种好的花药放到暗培养箱中进行36℃，6～7d的热激处理。

5、花药培养

经高温热激处理后的花药放置在(25±1)℃，光照强度1500-2500Lx，光照时间12-16h，湿度60％下培养5d，然后转移至分化培养基上：MS+0.1mg·L^-1KT+8mg·L^-1Vc+3％蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 5.8，之后每隔15-20d继代一次。

6、多胚诱导

茄子花药培养一般30-40d左右出现胚状体，待胚状体肉眼可见，取出带有胚状体的单个花药，移至胚增殖培养基中，胚增殖培养基：MS+0.01～0.05mg·L^-1NAA+1～2mg·L^- ¹KT+2％蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 5.8，对照培养基为分化培养基。

对照为未经多胚诱导，待胚状体肉眼可见，取出带有胚状体的单个花药，直接移至再生培养基上。

7、胚状体再生植株

随着胚状体一端颜色逐渐转绿出现绿色小芽时，将单个胚状体移至到再生培养基上再生植株。再生培养基：MS+3％蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 5.8。

8、倍性鉴定

取叶样采用流式细胞仪检测倍性。

二、结果分析：

1、茄子花粉胚增殖诱导过程

茄子花药培养采用的接种培养基为：MS+0.2mg·L^-12,4-D+1mg·L^-1KT+8mg·L^-1Vc+4mg·L^-1AgNO3+3％蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 5.8。经高温热激处理后的花药放置在25-28℃，光照强度在1500-2000Lx、光照12-16h·d^-1下培养，视培养情况，每隔15-20d更新培养基一次。一般情况下30d左右会出现胚状体。待胚状体肉眼可见，取出带有胚状体的单个花药，移至胚增殖培养基中，胚增殖培养基：MS+0.01～0.05mg·L^-1NAA+1～2mg·L^-1KT+2％蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 5.8。随着胚状体一端颜色逐渐转绿出现绿色小芽时，将单个胚状体移至到再生培养基上再生植株。

2、多胚诱导效率

本实验选用了5个不同类型的茄子材料用以比较胚增殖培养基的多胚诱导效果，每种茄子材料在不同培养基中接种100个花药，分别统计各个材料单个出胚花药的平均出胚数。比较常规培养和经过胚增殖培养单个出胚花药的平均出胚数差异。

表1 常规培养和经过胚增殖培养单个出胚花药的平均出胚数多重比较

各个材料单个出胚花药的平均出胚数见图2，单个出胚花药出胚数经多重比较分析(见表1)。16-243,16-278,16-291三个材料及总平均数在不同培养条件下差异达到极显著水平。由此说明经过胚增殖培养，可刺激单个出胚花药中多个花粉细胞的胚分化，显著增加茄子出胚花药的出胚数，因此提高花药培养的诱胚率。

3、花粉胚增殖培养植株倍性鉴定

采用倍性检测仪Partec CyFlow Space对15份茄子花粉胚培养材料进行检测，确定茄子花药培养植株的倍性，由样本的荧光强度Mean判断倍性，将茄子二倍体峰设在200，则单倍体峰在100。15份花药培养植株中除2株检测为混倍体，1株未检测出倍性不做统计，其余12株材料均为单倍体植株，茄子单倍体植株获得效率为85.7％。

本发明利用在常规花药培养过程中增加胚增殖培养步骤，在茄子花药出胚时期，利用出胚花药的胚型分化条件，调整激素配比、营养条件，促进多个花粉细胞的胚分化，从而使出胚花药表现出多胚的萌发，显著增加茄子出胚花药的出胚数，提高花药培养的诱胚率。花药培养技术直接诱导胚状体的形成，避免了愈伤组织的产生，提高了单倍体植株产生的效率，同时又不需要如小孢子培养中复杂的培养基和繁琐的操作步骤，成本更低，更利于实际应用。

茄子的孢子体为二倍体(2n)，其配子体(花粉、卵细胞)只含有一套染色体。在满足特定的生理条件后，配子体未经受精可直接发育成植株，但这样的植株只含有一套染色体，属于单倍体植株。单倍体植株在有性生殖过程中，不能进行正常的减数分裂，因而高度不育。但单倍体植株经染色体加倍，可成为加倍单倍体或双单倍体(DH系)，属于纯合二倍体，育性得到恢复。单倍体自然发生的频率很低，人工诱发单倍体的性细胞发育是获得单倍体植株的重要方法。单倍体育种，主要是指通过花药培养或游离小孢子培养的方式得到单倍体植株，然后经秋水仙素等处理加倍为双单倍体，从而直接获得纯化的品系或将其作为育种过程中的中间材料或亲本的育种方式。

单倍体育种可以直接获得纯合的二倍体，避免进行多代自交，缩短了育种年限。杂合二倍体中显性性状会掩盖隐形性状的表现，然而在纯合二倍体中可以排除这一干扰，隐形性状得以在当代表现，即表现型与基因型一致，提高了选择的准确性和可靠性。在同一选择周期中，单倍体选择效率要比二倍体高很多。由于该技术能快速纯化育种材料，缩短育种周期，提高育种效率，创制商业品种而受到农业育种者的青睐。

花药培养是目前在农业领域广泛应用的一项单倍体育种技术。该技术把花粉发育到一定阶段的花药接种到人工培养基上，改变花粉粒的发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织。随后由胚状体直接发育为植株或诱导愈伤组织分化成植株。实践证明，经花药培养得到的花粉株系系间性状变异幅度大，超亲现象和出现特殊优良性状的频率要显著高于常规育种；株系内性状整齐，世代间稳定性强；通过花药培养选出的自交系具有高度的纯合性，以此配制的杂交组合往往具有更强的杂种优势。提高花药培养中胚状体的产生效率，将会增加获得的单倍体植株的几率，进而增加单倍体育种选择的群体，有利于提高单倍体育种的效率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种促进茄子花粉胚增殖的方法，其特征在于，所述促进茄子花粉胚增殖的方法采用胚增殖培养；

所述胚增殖将茄子花药培养出花粉胚，待花粉胚肉眼可见，取出带有花粉胚的单个花药，移至胚增殖培养基中，胚增殖培养基：MS+0.01～0.05mg·L^-1NAA+1～2mg·L^-1KT+2％蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 5.8；再将单个花粉胚移至到再生培养基上再生植株；再生培养基：MS+3％蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 5.8。

2.如权利要求1所述的促进茄子花粉胚增殖的方法，其特征在于，所述胚增殖之前需要进行：

(5)经高温热激处理后的花药放置在25℃±1℃，光照强度1500-2500Lx，光照时间12-16h，湿度60％下培养5d，然后转移至分化培养基上，之后每隔15-20d继代一次。

3.如权利要求2所述的促进茄子花粉胚增殖的方法，其特征在于，所述接种培养基：MS+0.2mg·L^-12,4-D+1mg·L^-1KT+8mg·L^-1Vc+4mg·L^-1AgNO₃+3％蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 5.8。

4.如权利要求2所述的促进茄子花粉胚增殖的方法，其特征在于，所述分化培养基：MS+0.1mg·L^-1KT+8mg·L^-1Vc+3％蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 5.8。