CN106879445B - 一种快速鉴定和筛选高粱萌发期耐盐性材料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种快速鉴定和筛选高粱萌发期耐盐性材料的方法，包括种子处理、根的培养、氯化钠胁迫处理、耐盐性判断等步骤。观察根的弯曲程度，与处理前相比，根向上弯曲长度超过0.2厘米，即为在盐胁迫下发生弯曲的根，耐盐性强；此时如果根是直立的，与盐处理前没有变化，说明在盐胁迫下，该品种的根没有生长，为盐敏感的高粱材料。本发明鉴定速度快，效果准确、直观，对鉴定环境条件要求低，可控性强，该方法也可用于快速筛选某个或某些高粱品种耐盐极限浓度；还可筛选大批高粱种质资源或育种材料的中的耐盐和盐敏感材料。
Description
技术领域
本发明涉及种质资源筛选与鉴定领域，尤其涉及一种高粱萌发期耐盐性筛选和鉴定方法。
背景技术
高粱是全球第五大重要作物，具有粮、饲、酿造等多种用途。由于高粱基因组较小，且已经完成基因组测序，成为继水稻之后又一个重要的粮食和能源模式作物。
我国有15多亿亩盐碱地，大部分处于荒芜状态。高粱属于中度耐盐作物，在中轻度盐碱地上种植高粱有利于充分利用我国土地资源，缓解国家能源和饲料短缺问题。但是由于高粱品种间的耐盐性存在较大差异，并非所有品种种植在盐碱地上都能获得较高的产量；另外高粱耐盐育种中，耐盐种质少，遗传基础狭窄，制约了耐盐甜高粱选育的效率，因此，筛选耐盐性强的高粱种质资源和品种，不论是对耐盐基础理论研究，还是对耐盐种质创制和品种选育都具有重要的意义。
目前对高粱萌发期耐盐性鉴定，一般采用《高粱种质资源描述规范和数据标准》中的芽期耐盐性鉴定方法，利用相对盐害率进行鉴定。该方法通过对高粱种子进行一周盐处理，调查盐处理和对照的发芽率，以相对盐害率反映幼芽受盐害的程度，根据相对盐害率划分耐盐性级别，可定量评价每个品种的耐盐性，对耐盐性进行分级。但是对于筛选大量的突变体、种质资源和后代育种材料，该方法存在以下缺点：鉴定时间较长，需要7天；鉴定结果需要统计对比，结果不直观；由于在培养皿中萌发，种子胚根生长杂乱，不能有效鉴定根部的生长状况。本发明人在实验中发现，盐害可导致种子萌发延迟，叶片边缘灼伤、萎蔫、变黄，最终导致叶片脱落，同时还抑制了根的发育。因此，盐胁迫中根的生长在一定程度上反映了种子的耐盐性。尽管目前有较多的高粱萌发期耐盐性鉴定与筛选的方法，但利用高粱种子根部弯曲与否来来筛选高粱耐盐性材料的方法还未见有相关研究。
发明内容
为解决现有技术上的不足，本发明提供了一种快速鉴定和筛选高粱萌发期耐盐性材料的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种快速鉴定和筛选高粱萌发期耐盐性材料的方法，包括以下步骤：
(1)种子处理
选取饱满、完整高粱种子，用种子包衣剂进行包衣，放在铺有一层滤纸的培养皿中，加入自来水，使水面与种子面平齐，盖上培养皿盖子，放入28摄氏度光照培养箱中，黑暗培养24小时左右，等种子露白后备用；
（2）根的培养
根据样品种子量的多少准备不同规格的蜡质、发芽纸和广口瓶；
蜡纸1的背面写实验材料编号，发芽纸2和发芽纸3用水浸湿；蜡纸1带有编号的一面朝下放于底层，把发芽纸2放在蜡纸1上，用镊子把露白基本一致的种子胚根朝下排放在发芽纸2上，使其呈一条直线，把发芽纸3盖在种子上面，把蜡纸1，发芽纸2和发芽纸3轻轻压平后，从一边轻轻卷起成一纸卷，两头和中间用橡皮筋固定，防发芽纸中的种子移动位置。胚根方向朝下，放入装有自来水广口瓶中，广口瓶中水溶液的高度距离瓶底2-3厘米；放于28度光照培养箱中，培养箱条件：白天12小时，黑暗12小时，28摄氏度，光照度10000LX。培养24-48小时挑选根长1-2厘米左右的种子，进行盐胁迫处理；
（3）氯化钠胁迫处理
准备好另一套干净的蜡纸4，发芽纸5和发芽纸6。发芽纸5和发芽纸6预先用一定浓度的氯化钠溶液浸湿。蜡纸4背面写实验材料编号和氯化钠浓度放于最底层，上面放发芽纸5。把步骤（2）中的纸卷从广口瓶中取出，去除橡皮筋，展开，掀开发芽纸3，用镊子将挑选的种子转移到发芽纸5上，排放整齐后盖上发芽纸6，轻轻地卷上纸卷，中间用橡皮筋固定，根部朝上放入装有一定氯化钠溶液的广口瓶中，放入纸卷后氯化钠溶液面距离瓶底2-3厘米，盖上盖子，放入28度光照培养室中，光照条件同步骤（2）；氯化钠胁迫处理24-72小时；
(4)耐盐性判断
观察根的弯曲程度，与处理前相比，根向上弯曲长度超过0.2厘米，即为在盐胁迫下发生弯曲的根，耐盐性强；此时如果根是直立的，与盐处理前没有变化，说明在盐胁迫下，该品种的根没有生长，为盐敏感的高粱材料。根据氯化钠梯度试验确定高粱品种发生根部弯曲盐害的临界氯化钠浓度，
发生盐害的临界氯化钠浓度＞450mmol，耐盐性很强；
400 mmol≤发生盐害的临界氯化钠浓度＜450mmol，耐盐性强；
350 mmol≤发生盐害的临界氯化钠浓度＜4000mmol，耐盐性中等；
300 mmol≤发生盐害的临界氯化钠浓度＜350mmol，耐盐性弱；
发生盐害的临界氯化钠浓度＜300mmol，耐盐性很弱。
优选的，步骤（2）中根的培养的时间为36-48小时。
优选的，步骤（2）中挑选根长1.5-2厘米左右的种子，进行盐胁迫处理。
优选的，步骤（3）中氯化钠胁迫处理时间为24小时。
本方法可应用于品种或品系的耐盐性鉴定或耐盐种质资源的筛选。
图1-图8是鉴定高粱萌发期耐盐性方法的各个步骤。
本发明的有益效果是：
1.鉴定速度快。3-4天可筛选出耐盐性强和盐敏感的高粱遗传材料。
2.效果准确、直观。
3.鉴定对生长环境条件要求低，只要温度适宜种子萌发均可进行该实验。
4.可控性强。可通过调节培养箱温度来控制根的生长速度，加速或延迟实验进程。
5.用途广泛。该方法也可快速用于筛选某个或某些高粱品种耐盐极限浓度；还可筛选大批高粱种质资源或育种材料的中的耐盐和盐敏感材料。
附图说明
图1是准备吸水纸和蜡纸，下层放蜡纸，上层放吸水纸。
图2是水溶液浸湿后，把经过消毒包衣催芽的种子胚根朝下放在吸水纸上。
图3是把吸水纸盖在种子上。
图4是把种子卷起来，两头用橡皮筋固定。
图5是把纸卷放于装有水溶液的广口瓶中。
图6是24-36小时后挑选根长在1.5-2厘米的种子，放于新的用盐溶液浸湿的吸水纸中，把籽粒重新卷起。
图7是胚根朝上放于盐溶液中。
图8是24小时后，观察根的弯曲情况，与处理前相同的，为盐敏感材料；与处理前相比，根弯曲超过0.2厘米，即为耐盐材料。
图9是高粱保持系BTx623耐盐性实验，NaCl空白对照处理前和盐处理24小时根部形状。
图10是高粱保持系BTx623耐盐性实验，100mmolNaCl处理前和盐处理24小时根部形状。
图11是高粱保持系BTx623耐盐性实验，150mmolNaCl处理前和盐处理24小时根部形状。
图12是高粱保持系BTx623耐盐性实验，200mmolNaCl处理前和盐处理24小时根部形状。
图13是高粱保持系BTx623耐盐性实验，250mmolNaCl处理前和盐处理24小时根部形状。
图14是高粱保持系BTx623耐盐性实验，300mmolNaCl处理前和盐处理24小时根部形状。
图15是高粱保持系BTx623耐盐性实验，350mmolNaCl处理前和盐处理24小时根部形状。
图16是高粱保持系BTx623耐盐性实验，400mmolNaCl处理前和盐处理24小时根部形状。
图17是高粱保持系BTx623耐盐性实验，450mmolNaCl处理前和盐处理24小时根部形状。
图18是300mmolNaCl盐胁迫7天后Btx623的发芽情况。
图19是300mmolNaCl盐胁迫7天后石红137的发芽情况。
图20是300mmolNaCl盐胁迫7天后L-甜的发芽情况。
图21是300mmolNaCl盐胁迫7天后各品种的发芽情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述：
实施例1 高粱保持系BTx623耐盐实验
试验准备：种子包衣剂500mL；直径10厘米的塑料培养皿10个；15cm×20cm的蜡纸40份；15cm×20cm的发芽纸80份（美国安科）；直径10厘米的带盖广口瓶10个；镊子1把。配制0，100，150，200，250，300，350，400和450mmolNaCl溶液各500ml。
（1）种子催芽
挑选饱满、完整的BTx623种子500粒左右，用种子包衣剂包衣处理。每个培养皿中放50粒种子，加入10毫升自来水，使水面刚盖过种子，放于28摄氏度光照培养箱中，黑暗培养24小时左右。
（2）根的培养
发芽纸2和发芽纸3用水浸湿。蜡纸1放于底层，发芽纸2放在其上，用镊子把露白基本一致的种子胚根部位朝下排放在发芽纸2上，使其呈一条直线，每个发芽纸上放20粒露白的种子，把发芽纸3盖在种子上面，把蜡质1，发芽纸2，种子和发芽纸3轻轻按压平整后，从一边卷起，成一纸卷，两头和中间用橡皮筋固定住。制作完20个纸卷后，胚根方向朝下，竖直放入直径10厘米的广口瓶中，加入自来水，水面距离瓶底2-3厘米。放在28度的光照培养箱中，设置白天12小时，黑暗12小时，28摄氏度，光照度10000LX。48小时后，挑选根长1-2厘米左右的种子，进行盐胁迫处理。
（3）盐胁迫处理
准备好另一套干净的蜡纸4，发芽纸5和发芽纸6。发芽纸5和发芽纸6预先分别用0，100，150，200，250，300，350，400和450mmol盐溶液浸湿。把步骤（2）中的20个纸卷从广口瓶中取出，去除橡皮筋，展开，备用。蜡纸4背面记录每个纸卷盐溶液浓度编号，放于底层，蜡纸4上放浸有相应盐溶液的发芽纸5，用镊子挑选种子12粒放在发芽纸5上，排放整齐后盖上浸有相应盐溶液的发芽纸6，轻轻按压平整后，卷上纸卷，中间用橡皮筋固定。每个浓度两个重复，共18个纸卷。广口瓶编号1-9，对应盐浓度为0-450mmolNaCl，根据对应的盐浓度，把两个盐浓度相同的纸卷根部朝上竖直放入装有对应浓度盐溶液的广口瓶中，盐溶液距离广口瓶底2-3厘米。为防止水分蒸发改变盐浓度，盖上盖子，放入28度光照培养箱中，培养箱条件同步骤（2）。
（4）耐盐性判断
24小时后各个盐浓度中的BTx623胚根弯曲情况如下：0，100，150和200mmolNaCl溶液，所有BTx623种子的根均弯曲，250mmolNaCl溶液中个别种子发生了弯曲，300，350，400和450mmolNaCl溶液中种子的根均没有弯曲；盐胁迫72小时后BTx623根的弯曲情况同盐胁迫处理24小时后的结果相似（表1）。因此，300mmolNaCl是根部弯曲盐害发生的临界浓度。
上述实验结果表明在小于或等于200mmolNaCl胁迫处理24小时后，高粱保持系BTx623受盐胁迫影响程度较小，在盐胁迫下仍可生长；但是当NaCl浓度大于或等于250mmol后，盐胁迫处理24小时后或72小时后，耐盐性鉴定结果差异不显著。在此浓度下BTx623根部生长受到显著地抑制，多数根停止生长，但24小时和72小时监测的结果相似。因此，24小时以后是观察耐盐品种的合适时间。
图9-图17是高粱保持系BTx623耐盐性实验，不同NaCl浓度处理前和盐处理24小时根部形状。
表1.BTx623在9个NaCl浓度下处理24和72小时后根部发生弯曲情况
实施例2 利用《高粱种质资源描述规范和数据标准》芽期耐盐性鉴定方法对包括BTx623在内的10份高粱品种资源进行耐盐性评价
根据《高粱种质资源描述规范和数据标准》中的芽期耐盐性鉴定方法，对10份高粱品种资源进行耐盐性试验。分别配制0(CK)、100、150、200、250、300、350、400和450mmol的NaCl溶液。实验设1个对照和8个处理，3个重复。在培养皿中放入一层滤纸，将50粒完整饱满的高粱种子均匀放入培养皿中，分别加入上述不同浓度的NaCl溶液5mL，盖上盖子，用封口膜封住，防止水分蒸发。将培养皿随机放入培养箱中，培养箱设置温度25℃，光照14小时，黑暗10小时，光照强度3000 lx。培养1周后调查处理和对照的发芽率，以相对盐害率反映幼苗受盐害的程度。
根据下列公式计算相对盐害率，并分级。
RS（%）=100×∑（Gc-Gi）/3Gc
其中，RS-相对盐害率（%）；Gc-对照相对发芽率（%）；Gi-盐处理相对发芽率（%）
根据相对盐害率划分耐盐性级别：1很强（RS<20%）3强（20%<RS<40%）5中等（40%<RS<60%）7弱（60%<RS<80%）9很弱（RS≥80%）。
表2.高粱品种在不同NaCl溶液中的发芽率
对NaCl浓度(Y)和发芽率(X)进行多项式分析，得方程Y=-0.2448x+119.62。当发芽率为50%时，盐浓度为280mmol；当发芽率为10%是，盐浓度为450mmol。因此，高粱种子萌发耐盐半致死浓度为280mmol。
本实验应采用300mmolNaCl，对高粱品种资源进行耐盐性评价（表3）。10个高粱品种中耐盐性1级的1个，3级的4个，5级的3个，7级和9级的各1个。因此用300mmolNaCl可以较好的鉴定出高粱品种资源中耐盐的品种，在该浓度下BTX623的耐盐级别为7级，耐盐弱。
表3. 300mmolNaCl胁迫下，高粱品种的耐盐性分级
对比实施例1和实施例2，本发明耐盐性鉴定方法和《高粱种质资源描述规范和数据标准》提供的方法实验结果一致，证明本发明方法检测高粱耐盐性实验结果准确可靠。本发明更迅速简单直观。
实施例3 利用300mmol，350mmol、400mmol、450mmol和500mmolNaCl溶液逐步筛选高粱耐盐突变体
试验准备：种子包衣剂500mL；直径4厘米的塑料培养皿260个；15cm×20cm的蜡纸520份；15cm×20cm的发芽纸1040份（美国安科）；直径20厘米的带盖广口瓶10个；镊子3把。实验材料：256份高粱突变体。
（1）种子催芽
高粱突变体共256份。每个品系挑选饱满、完整的种子30粒左右，用种子包衣剂进行包衣处理。将每个品系的种子放入直径为4厘米的塑料培养皿，加入3毫升自来水，使水面刚盖过种子，放入28度光照培养箱中，黑暗培养24小时左右。
（2）根的培养
发芽纸2和发芽纸3用水浸湿。蜡纸1背面记录高粱突变体编号，放于底层，发芽纸2放在其上，用镊子把露白基本一致的种子胚根部位朝下排放在发芽纸2上，使其呈一条直线，每个发芽纸上放20粒露白的种子。把发芽纸3盖在种子上面，把蜡质1，发芽纸2，种子和发芽纸3轻轻按压平整后，从一边卷起，成一纸卷，两头和中间用橡皮筋固定。每个高粱突变体系制作一个纸卷，制作完26个纸卷后，胚根方向朝下，竖直放入直径20厘米的广口瓶中，加入自来水，水面距离瓶底2-3厘米。放在28度的光照培养箱中，设置白天12小时，黑暗12小时，28摄氏度，光照度10000LX。按照上述方法制作其他剩余高粱突变体系的纸卷。48小时后，挑选根长1-2厘米左右的种子，进行盐胁迫处理。
（3）盐胁迫处理
准备好另一套干净的蜡纸4，发芽纸5和发芽纸6。发芽纸5和6预先300mmol盐溶液浸湿。把（2）中其中一个广口瓶中26个纸卷取出，去除橡皮筋，依次展开，备用。蜡纸4背面记录每个高粱突变体编号，放于底层，蜡纸4上发芽纸5，用镊子挑选根长1-2厘米左右的种子12粒放在发芽纸5上，排放整齐后盖上发芽纸6，轻轻按压平整后，卷上纸卷，中间用橡皮筋固定。根部朝上放于广口瓶中，每瓶放26个，加入300mmolNaCl溶液，溶液面距离瓶底2-3厘米。为防止水分蒸发改变盐浓度，盖上盖子，放入28度光照培养箱中，培养箱条件同步骤（2），按上述方法依次用盐溶液处理剩余纸卷中的高粱突变体。24小时候观察根的弯曲情况（表4）。在300mmolNaCl胁迫下共有53份高粱耐盐突变体根不发生了弯曲。为了筛选到更高级别的根部耐盐的高粱突变体，通过逐步提高NaCl浓度的方法，用350mmolNaCl对上述的53份突变体进行了筛选，共25没有份根部发生弯曲的耐盐盐体；继续提高盐浓度到400mmolNaCl，共筛选到10份高粱耐盐突变体；盐浓度提高到450mmolNaCl时，共筛选到3份高粱耐盐突变体；当盐浓度到500mmol所有筛选的突变体根部都不能发生弯曲。上述实验结果说明450mmolNaCl下筛选到的3份突变体是256份高粱突变体中根部耐盐性最强的突变体。
表4.利用300mmol，350mmol，400mmol和450mmolNaCl溶液筛选出的根部弯曲的突变体个数
表5.利用300mmol，350mmol，400mmol和450mmolNaCl溶液筛选出的根部弯曲的突变体编号
实施例4 按照《高粱种质资源描述规范和数据标准》对实施例3筛选到的25份根部耐盐突变体进行耐盐性分级验证
根据《高粱种质资源描述规范和数据标准》中芽期耐盐性鉴定方法，用300mmolNaCl对筛选的25份突变体进行耐盐性验证。实验设1个对照和1个处理，3个重复。在直径4厘米的培养皿中放入一层滤纸，将20粒完整饱满的高粱突变体种子均匀放入培养皿中，加入300mmolNaCl溶液2mL，盖上盖子，用封口膜封住，防止水分蒸发。将培养皿随机放入培养箱中，培养箱设置温度25℃，光照14小时，黑暗10小时，光照强度3000lx。
培养1周后调查处理和对照的发芽率，以相对盐害率反映幼苗受盐害的程度。
RS（%）=100×∑（Gc-Gi）/3Gc
RS-相对盐害率（%）；Gc-对照相对发芽率（%）；Gi-盐处理相对发芽率（%）
根据相对盐害率划分耐盐性级别
1很强（RS<20%）；3强（20%<RS<40%）；5中等（40%<RS<60%）；7弱（60%<RS<80%）；9很弱（RS≥80%）。
表6.300mmolNaCl胁迫下25份根部耐盐突变体用相对盐害率鉴定出的耐盐性级别
表7.不同耐盐级别突变体所占比例
对300mmolNaCl溶液中筛选到的25份根部耐盐突变体进行耐盐性鉴定分级结果如表6。其中耐盐性很强耐盐级别为1级的突变体占36%，耐盐性强耐盐级别为3级的突变体为40%。
对照实施例3和实施例4可以看出，本发明提供的耐盐性鉴定方法和《高粱种质资源描述规范和数据标准》中芽期耐盐性鉴定方法结果相类似。本发明提供的鉴定方法可以很好的鉴定出高粱的耐盐性，筛选出耐盐性品种或种质资源，简单易行。
以上所述仅是本专利的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本专利的保护范围。
Claims (5)
1.一种快速鉴定和筛选高粱萌发期耐盐性材料的方法，包括以下步骤：
(1)种子处理
选取饱满、完整高粱种子，用种子包衣剂进行包衣，放在铺有一层滤纸的培养皿中，加入自来水，使水面与种子面平齐，盖上培养皿盖子，放入28摄氏度光照培养箱中，黑暗培养24小时左右，等种子露白后备用；
（2）根的培养
根据样品种子量的多少准备不同规格的蜡质、发芽纸和广口瓶；蜡纸1的背面写实验材料编号，发芽纸2和发芽纸3用水浸湿；蜡纸1带有编号的一面朝下放于底层，把发芽纸2放在蜡纸1上，用镊子把露白基本一致的种子胚根朝下排放在发芽纸2上，使其呈一条直线，把发芽纸3盖在种子上面，把蜡纸1，发芽纸2和发芽纸3轻轻压平后，从一边轻轻卷起成一纸卷，两头和中间用橡皮筋固定，以防发芽纸中的种子移动位置；胚根方向朝下，放入装有自来水广口瓶中，广口瓶中水溶液的高度距离瓶底2-3厘米；放于28度光照培养箱中，培养箱条件：白天12小时，黑暗12小时，28摄氏度，光照度10000LX；培养24-48小时挑选根长1-2厘米左右的种子，进行盐胁迫处理；
（3）氯化钠胁迫处理
准备好另一套干净的蜡纸4，发芽纸5和发芽纸6；发芽纸5和发芽纸6预先用一定浓度的氯化钠溶液浸湿；蜡纸4背面写实验材料编号和氯化钠浓度放于最底层，上面放发芽纸5；把步骤（2）中的纸卷从广口瓶中取出，去除橡皮筋，展开，掀开发芽纸3，用镊子将挑选的种子转移到发芽纸5上，排放整齐后盖上发芽纸6，轻轻地卷上纸卷，中间用橡皮筋固定，根部朝上放入装有一定浓度氯化钠溶液的广口瓶中，放入纸卷后氯化钠溶液面距离瓶底2-3厘米，盖上盖子，放入28度光照培养室中，光照条件同步骤（2）；氯化钠胁迫处理24-72小时；
(4)耐盐性判断
观察根的弯曲程度，与处理前相比，根向上弯曲长度超过0.2厘米，即为在盐胁迫下发生弯曲的根，耐盐性强；此时如果根是直立的，与盐处理前没有变化，说明在盐胁迫下，该品种的根没有生长，为盐敏感的高粱材料；根据氯化钠梯度试验确定高粱品种发生盐害的临界氯化钠浓度；
发生盐害的临界氯化钠浓度＞450mmol，耐盐性很强；
400 mmol≤发生盐害的临界氯化钠浓度＜450mmol，耐盐性强；
350 mmol≤发生盐害的临界氯化钠浓度＜400mmol，耐盐性中等；
300 mmol≤发生盐害的临界氯化钠浓度＜350mmol，耐盐性弱；
发生盐害的临界氯化钠浓度＜300mmol，耐盐性很弱。
2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定和筛选高粱萌发期耐盐性材料的方法，其特征在于，所述的步骤（2）中根的培养的时间为36-48小时。
3.根据权利要求1所述的一种快速鉴定和筛选高粱萌发期耐盐性材料的方法，其特征在于，所述的步骤（2）中挑选根长1.5-2厘米左右的种子，进行盐胁迫处理。
4.根据权利要求1所述的一种快速鉴定和筛选高粱萌发期耐盐性材料的方法，其特征在于，所述的步骤（3）中氯化钠胁迫处理时间为24小时。
5.根据权利要求1-4任一项所述的一种快速鉴定和筛选高粱萌发期耐盐性材料的方法，其特征在于，所述方法可应用于品种或品系的耐盐性鉴定或耐盐种质资源的筛选。
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