CN104041415A - 一种茄子花药培养获得单倍体再生植株的方法 - Google Patents

一种茄子花药培养获得单倍体再生植株的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种茄子花药培养获得单倍体植株的方法，属于农业技术领域。本发明通过鉴定花粉发育时期，选取花蕾，花蕾消毒，花药接种、预处理，花药培养，诱导愈伤组织再分化为单倍体植株。本发明确定了花粉发育时期，外在形态学标记。本发明采用固体培养基将小孢子和花药壁共培养，低温、热激预处理，愈伤诱导和分化培养基成分和培养条件调节，提高了愈伤诱导频率和愈伤组织的分化能力。应用此方法进行茄子花药培养，愈伤诱导率60％以上，出苗率80％以上，解决了茄子花药培养诱导率低的难题。本发明可以获得单倍体植株，出苗率高，若应用于育种实践，可加快育种步伐，为新品种选育提供有力的手段。

Description

一种茄子花药培养获得单倍体再生植株的方法
技术领域：
本发明属农业领域，具体涉及一种茄子花药培养获得单倍体再生植株的方法。
技术背景：
花药培养，是适宜条件下离体花药培养成单倍体植株的组织培养技术，是单细胞水平上获得纯系的有效方法，是重要的育种辅助手段。茄子是重要茄科蔬菜作物之一，发展茄子生产，寻求具有抗性、优质、高产等优良性状的品种具有重要理论和实践意义。茄子杂交优势十分显著，在品种改良上发挥了重要作用；而未被利用的茄子种质材料日益减少，种质资源匮乏，且常规育种手段时间长、工作量大、效率低；应用花药培养技术获得单倍体植株，可克服杂种性状的分离，短时间固定和分析杂种植株的新遗传组合；经染色体加倍后，得到基因位点纯合的新品系，精确、快速创造新种质。常规育种获得遗传稳定自交系一般需要5～8年，而花药培养只需1～2年，省去多代自交的繁琐过程，且避免了优质基因的丢失；花药培养用于茄子育种实践中，大大缩短育种周期，开辟了一条新品种选育的新途径。
茄子花药培养有诸多优点，但由于花粉发育时期选择、花药培养组织褐化、愈伤组织诱导及分化频率低等因素，诱导率极低，重复性操作不强，目前仍未能应用于茄子育种。
发明内容：
本发明目的在于针对背景技术提出的茄子花药培养效率低问题，提供一种茄子花药培养方法，获得单倍体再生植株。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种茄子花药培养获得单倍体再生植株的方法，包括以下步骤：
⑴取花粉发育处于单核中后期的花药；
⑵接种至预处理培养基上，预处理；
⑶将预处理后的花药，在24℃～28℃条件下暗培养6～7d至花药顶端出现黄白色组织后，转接至愈伤组织诱导培养基，在昼温25±1℃/夜温22±1℃、光照2000～3000LX、光周期14h·d-1条件下培养12～16天后，转接至增殖培养基上继续培养至愈伤组织直径为0.4～0.6cm；
⑷将直径为0.4～0.6cm的愈伤组织转接至1/2B5分化培养基，在昼温25±1℃/夜温22±1℃、光照3000～4000LX、光周期16h·d-1条件下分化培养至愈伤组织直径为1～2cm，然后转接至B5分化培养基继续培育获得再生植株；
⑸移栽。
所述的预处理培养基为MS+0.1mg·L-1～0.2mg·L-12,4-D+0.5mg·L-1～1.0mg·L-1KT+2％～3％蔗糖+0.6％～0.8％琼脂，pH5.8～6。
所述预处理的过程为：置于4℃暗处理45～50h；后移至36℃处理120～150h。
所述的愈伤组织诱导培养基为MS+0.2mg·L-1～0.25mg·L-12,4-D+1.0mg·L-1～2.0mg·L-1KT+2％～3％蔗糖+0.6％～0.8％琼脂，pH5.8～6；所述的增殖培养基为MS+0.1mg·L-1～0.25mg·L-12,4-D+2.0mg·L-1～3.0mg·L-1KT+2％～3％蔗糖+0.6％～0.8％琼脂，pH5.8～6。
所述的1/2B5分化培养基为1/2B5+0.01mg·L-1～0.02mg·L-1NAA+4.0mg·L-1～6.0mg·L-1KT+1.0mg·L-1～5.0mg·L-1VC(维生素C)+2％～3％蔗糖+0.6％～0.8％琼脂，pH5.8～6；所述的B5分化培养基为B5+0.01mg·L-1～0.02mg·L-1NAA+6.0mg·L-1～8.0mg·L-1KT+5.0mg·L- 1～10.0mg·L-1VC+2％～3％蔗糖+0.6％～0.8％琼脂，pH5.8～6。
本发明所述培养基中蔗糖和琼脂的浓度单位为质量百分比。
步骤(5)中所述移栽的过程为：提前2d打开瓶盖，然后取出再生植株，洗净培养基，50％多菌灵可湿性粉剂1000倍液浸泡，晾干后移植于装有灭菌蛭石和珍珠岩(体积比2:1)的穴盘；置于育苗棚内驯化30～35d后定植于棚室。
步骤(1)中所述单核中后期花药的取出过程为：植株盛花期于晴天上午9:00～11:00采集花蕾，醋酸洋红染色压片法镜检鉴定花粉发育时期，选取处于单核中后期花蕾；花蕾消毒：花蕾洗涤灵清洗，流水冲洗20～30min；然后依次用75％(体积百分比)乙醇溶液浸0.5min，6.5％次氯酸钠溶液(取市售次氯酸钠分析纯6.5ml加水定容至100ml)消毒15min，最后用无菌水冲洗3～4次；无菌条件下，将花药从花蕾中完整剥离、取出。
本发明方法的最优选技术方案为：
⑴取花粉发育处于单核中后期的花药
取材：植株盛花期，于晴天上午9:00～11:00，选取对茄、四门斗或八面风花蕾；醋酸洋红染色压片法镜检选取花粉发育时期处于单核中后期的花蕾；适宜生长环境条件下花芽分化后24～26d，即开花前6～8d花蕾。选取对茄、四门斗、八面风等生长活跃部位、花药活力旺盛、花粉发育至单核中后期的花蕾，提高愈伤诱导频率。
消毒：花蕾洗涤灵清洗，流水冲洗20～30min；超净工作台内，用75％的乙醇表面消毒0.5min，然后用6.5％的次氯酸钠溶液消毒15min，最后用无菌水冲洗3～4次，每次5min；无菌条件下，将花药从消毒的花蕾中完整剥离、取出。
⑵接种至预处理培养基上，预处理
将取出的花药接种于MS预处理培养基上，Parafilm封口膜封口。
预处理培养基：MS+0.1mg·L-1～0.2mg·L-12,4-D+0.5mg·L-1～1.0mg·L-1KT+2％～3％蔗糖+0.6％～0.8％琼脂，pH5.8～6。
预处理：接种后，置于4℃暗处理45h～50h；然后移至36℃处理120h～150h。通过预处理可显著提高愈伤组织诱导频率。
⑶愈伤组织诱导、培养：预处理后的花药，移至24℃～28℃组织培养室中暗培养。6～7d后花药顶端现黄白色组织，转接至愈伤组织诱导培养基，置于昼温25±1℃/夜温22±1℃、光照2000～3000LX、光周期14h·d-1条件下培养。12～16d后愈伤组织转接至增殖培养基上继续培养至愈伤组织直径为0.4～0.6cm。花药壁组织与小孢子共培养，能提高愈伤组织的诱导频率。
愈伤组织诱导培养基：MS+0.2mg·L-1～0.25mg·L-12,4-D+1.0mg·L-1～2.0mg·L- 1KT+2％～3％蔗糖+0.6％～0.8％琼脂，pH5.8～6。
增殖培养基：MS+0.1mg·L-1～0.25mg·L-12,4-D+2.0mg·L-1～3.0mg·L-1KT+2％～3％蔗糖+0.6％～0.8％琼脂，pH5.8～6。
⑷植株诱导：愈伤组织直径0.4～0.6cm，转接至1/2B5分化培养基，置于昼温25±1℃/夜温22±1℃、光照3000～4000LX、光周期16h·d-1条件下分化培养。18～24d后愈伤组织直径1～2cm，转接至B5分化培养基继续培养。愈伤组织周围逐渐产生黄绿色小点，并逐渐发育成小苗。
1/2B5分化培养基：1/2B5+0.01mg·L-1～0.02mg·L-1NAA+4.0mg·L-1～6.0mg·L-1KT+1.0mg·L-1～5.0mg·L-1VC+2％～3％蔗糖+0.6％～0.8％琼脂，pH5.8～6。
B5分化培养基：B5+0.01mg·L-1～0.02mg·L-1NAA+6.0mg·L-1～8.0mg·L-1KT+5.0mg·L- 1～10.0mg·L-1VC+2％～3％蔗糖+0.6％～0.8％琼脂，pH5.8～6。
⑸移栽：移植前2d打开瓶盖；移栽时，将再生植株取出，洗净培养基，50％多菌灵可湿性粉剂1000倍液浸泡，晾干，移植于装有灭菌蛭石和珍珠岩(体积比2:1)的穴盘；穴盘置于育苗棚内驯化，30～35d后定植于棚室。
染色体鉴定：采用染色体计数直接鉴定法，显微镜下观察统计根尖细胞中期染色体，再生植株染色体倍性检测。
本发明通过培养成分和培养条件的调节，降低愈伤组织褐化的发生，提高诱导频率。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种茄子花药培养技术，利用茄子花药培养获得了单倍体再生植株，出苗率高，若应用于育种实践，可加快育种步伐。
本发明采用固体培养基将小孢子和花药壁共培养，低温、热激预处理，愈伤诱导和分化培养基成分和培养条件调节，提高了愈伤诱导频率和愈伤组织的分化能力。通过本发明的方法培育茄子单倍体植株，其愈伤诱导率达到60％以上，出苗率达到80％以上。本发明的茄子花药培养技术获得再生单倍体植株，解决了茄子花药培养诱导率低的难题；花药培养可获得大量的新基因型纯系，丰富了种质资源，为茄子新品种选育提供更有效的手段。
具体实施方式：
本实例以综合优良性状的杂交一代茄子组合S8847、S8889作为试验材料，采用本发明方法获取了单倍体植株。实施过程如下：
一、取材
5月上旬，试材盛花期于晴天上午10:00采集对茄、四门斗的花蕾。醋酸洋红染色压片法镜检花粉发育时期，确定花粉发育时期和花药形态的相关性。选取花粉发育处于单核中后期的花蕾，蕾长12.0～13.5mm，蕾直径6.5～7.5mm，花萼包裹花冠、先端微微张开略现花冠顶部，花药呈绿黄色；适宜生长环境条件下，花芽分化后24～26d，即开花前6～8d花蕾。
二、消毒
⑴培养基灭菌与分装：60mm培养皿、三角瓶、固体培养基等121℃、1.1Mpa灭菌20min。超净工作台内分装，每一培养皿8ml培养基。
⑵试材消毒：花蕾洗涤灵清洗，流水冲洗30min；超净工作台内，冲洗后的花蕾用75％(体积百分比)乙醇溶液浸0.5min，然后用6.5％次氯酸钠溶液(取市售次氯酸钠分析纯6.5ml加水定容至100ml)消毒15min，最后用无菌水冲洗4次，每次5min。
三、预处理
无菌条件下，将花药从消毒的花蕾中完整剥离、取出，去除花丝，接种于预处理培养基：MS+0.20mg·L-12,4-D+1.0mg·L-1KT+3％(质量百分比)蔗糖+0.75％(质量百分比)琼脂，pH5.8；每一培养皿放入3个蕾的花药，Parafilm封口膜封口。
预处理：将接种花药的培养皿置于4℃暗处理2d；然后移至36℃处理6d。
四、愈伤组织诱导
将预处理后的花药移至25℃组织培养室，暗培养；6d后花药顶端现黄白色愈伤组织约2mm时，接种于愈伤组织诱导培养基：MS+0.25mg·L-12,4-D+2.0mg·L-1KT+3％蔗糖+0.75％琼脂，pH5.8，置于昼温25±1℃/夜温22±1℃、光照2000LX、光周期14h·d-1条件下培养；15d后，转接至增殖培养基：MS+0.25mg·L-12,4-D+3.0mg·L-1KT+3％蔗糖+0.75％琼脂，pH5.8，置于昼温25±1℃/夜温22±1℃、光照2000LX、光周期14h·d-1条件下继续培养至愈伤组织直径为0.4～0.6cm。
五、植株再生
将直径为0.4～0.6cm的愈伤组织接种到1/2B5分化培养基：1/2B5+0.01mg·L-1NAA+4.0mg·L-1KT+2.0mg·L-1VC(维生素C)+3％蔗糖+0.75％琼脂，pH5.8，每瓶接入3～4个愈伤组织，置于昼温25±1℃/夜温22±1℃、光照4000LX、光周期16h·d-1条件下培养。22d后愈伤组织直径1～2cm，接种于B5分化培养基：B5+0.01mg·L-1NAA+7.0mg·L-1KT+10mg·L-1VC+3％蔗糖+0.75％琼脂，pH5.8，置于昼温25±1℃/夜温22±1℃、光照4000LX、光周期16h·d-1条件下培养。10d后愈伤组织周围可见淡黄色球形胚，继而可见绿色小点，并逐渐发育成小苗。
六、移栽：
移植前2d打开瓶盖；移栽时，将再生植株取出，洗净培养基，50％多菌灵可湿性粉剂(市售)1000倍液浸泡，晾干后移植于装有灭菌蛭石、珍珠岩(体积比为2:1)的穴盘；穴盘置于育苗棚内驯化，30～35d后定植于棚室。
七、染色体鉴定：对再生植株采用根尖压片法进行细胞染色体计数，检测再生植株染色体倍性；显微镜下根尖细胞中期染色体数目为n＝12，表明花药培养再生植株为单倍体。该方法中，愈伤诱导率达到60％以上，出苗率达到80％以上。

Claims (7)

1.一种茄子花药培养获得单倍体再生植株的方法，其特征在于包括以下步骤：
⑴取花粉发育处于单核中后期的花药；
⑵接种至预处理培养基上，预处理；
⑶将预处理后的花药，在24℃～28℃条件下暗培养6～7d至花药顶端出现黄白色组织后，转接至愈伤组织诱导培养基，在昼温25±1℃/夜温22±1℃、光照2000～3000LX、光周期14h·d-1条件下培养12～16天后，转接至增殖培养基上继续培养至愈伤组织直径为0.4～0.6cm；
⑷将直径为0.4～0.6cm的愈伤组织转接至1/2B5分化培养基，在昼温25±1℃/夜温22±1℃、光照3000～4000LX、光周期16h·d-1条件下分化培养至愈伤组织直径为1～2cm，然后转接至B5分化培养基继续培育获得再生植株；
⑸移栽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的预处理培养基为MS+0.1mg·L-1～0.2mg·L-12,4-D+0.5mg·L-1～1.0mg·L-1KT+2％～3％蔗糖+0.6％～0.8％琼脂，pH5.8～6。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述预处理的过程为：置于4℃暗处理45～50h；后移至36℃处理120～150h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的愈伤组织诱导培养基为MS+0.2mg·L-1～0.25mg·L-12,4-D+1.0mg·L-1～2.0mg·L-1KT+2％～3％蔗糖+0.6％～0.8％琼脂，pH5.8～6；所述的增殖培养基为MS+0.1mg·L-1～0.25mg·L-12,4-D+2.0mg·L-1～3.0mg·L-1KT+2％～3％蔗糖+0.6％～0.8％琼脂，pH5.8～6。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的1/2B5分化培养基为1/2B5+0.01mg·L-1～0.02mg·L-1NAA+4.0mg·L-1～6.0mg·L-1KT+1.0mg·L-1～5.0mg·L-1VC+2％～3％蔗糖+0.6％～0.8％琼脂，pH5.8～6；所述的B5分化培养基为B5+0.01mg·L-1～0.02mg·L-1NAA+6.0mg·L- 1～8.0mg·L-1KT+5.0mg·L-1～10.0mg·L-1VC+2％～3％蔗糖+0.6％～0.8％琼脂，pH5.8～6。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(5)中所述移栽的过程为：提前2d打开瓶盖，然后取出再生植株，洗净培养基，50％多菌灵可湿性粉剂1000倍液浸泡，晾干后移植于装有灭菌蛭石和珍珠岩(体积比2:1)的穴盘；置于育苗棚内驯化30～35d后定植于棚室。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述单核中后期花药的取出过程为：植株盛花期于晴天上午9:00～11:00采集花蕾，醋酸洋红染色压片法镜检鉴定花粉发育时期，选取处于单核中后期花蕾；花蕾消毒：花蕾洗涤灵清洗，流水冲洗20～30min；然后依次用75％乙醇溶液浸0.5min，6.5％次氯酸钠溶液消毒15min，最后用无菌水冲洗3～4次；无菌条件下，将花药从花蕾中完整剥离、取出。
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