CN106932367A - 一种基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法 - Google Patents

一种基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物科学技术领域，具体的说是基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法。通过天然GTP的荧光类似物mantGTP置换与Rab蛋白结合的GDP，作为荧光共振能量转移的供体；构建Rab蛋白的效应因子与绿色荧光蛋白GFP融合表达的载体，融合蛋白经过表达纯化之后作为荧光共振能量转移的受体；可以利用荧光光谱仪基于荧光共振能量转移的方法在体外直接检测以mantGTP形式结合的Rab蛋白和与绿色荧光蛋白GFP融合表达的效应因子之间的相互作用。本发明提供了一种灵敏快捷的检测Rab蛋白与其效应因子相互作用的新方法，完善了蛋白质相互作用的体系。

Description

一种基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法
技术领域
本发明属于生物科学技术领域，具体的说是一种基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法。
背景技术
Rab蛋白是小分子GTP结合家族中最大的亚家族，是一种单体形式的GTP结合蛋白。它在GTP结合的活性形式和GDP结合的非活性形式之间循环，不同形式的Rab蛋白在结构上会发生变化，这个构象发生变化的区域叫做分子开关区域，包括分子开关I(Switch I)和分子开关II(Switch II)。分子开关I和II是Rab蛋白与其互做因子结合的关键位点。Rab蛋白在这两种核苷酸结合形式之间的转换可由其上游的调控蛋白来催化，例如鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor,GEF)，它能催化Rab蛋白的GDP转化为GTP；而GTP结合形式的Rab蛋白又可以与下游的多种不同种类的效应因子相互作用，使效应因子功能化，在囊泡转运过程中发挥特定功能。
对Rab蛋白与其效应因子的相互作用的检测可以基于同位素32P标记的鸟苷酸，通过免疫共沉淀的方法进行检测，这种方法操作步骤繁琐，并且安全性不高。此外可以利用非标记的技术，例如把重组的Rab蛋白在GTP结合形式下加入到细胞提取液中，通过免疫印记的方法检测其与效应因子的相互作用，但是这种方法操作步骤繁琐，只能做半定量的检测。近来对鸟苷酸的荧光类似物N-methyl-3′-O-anthraniloyl(MANT)的研究得到较大发展，荧光信号比较灵敏，并且由于mantGDP/mantGTP与Rab蛋白的结合或者解离可以引起荧光信号的较大变化，目前已广泛用来检测Rab蛋白与鸟苷酸交换因子(GEF)和GTP酶激活蛋白(GAP)之间的结合。但在以mantGTP为荧光发射基团来检测Rab蛋白和效应因子的相互作用的研究中，效果并不理想，因为效应因子在与Rab:mantGTP结合时，它的分子开关I和II在结构上变化并不是很大，所以通过直接荧光的方法往往检测不到他们之间的相互作用，目前经常是利用mantGTP做为荧光发射基团，采用荧光偏振的方法来检测。荧光偏振的方法是基于用垂直的偏振光去激发荧光发射基团，可以在垂直和水平的偏振平面上去检测发射光谱的强度，这种方法与被检测分子的大小有很大关系，如果效应分子很小的话，往往也得不到令人满意的结果。此外荧光偏振的方法噪声相对比较大，灵敏度低，这些都限制了Rab蛋白 与效应因子之间相互作用的检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
种基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法，以天然GTP的荧光类似物mantGTP置换与Rab蛋白结合的GDP，作为荧光共振能量转移的供体；构建Rab蛋白的效应因子与绿色荧光蛋白GFP融合表达的载体，融合蛋白经过表达纯化作为荧光共振能量转移的受体，而后在体外根据荧光共振能量转移方法直接检测以mantGTP形式结合的Rab蛋白和与绿色荧光蛋白GFP融合表达的效应因子之间的相互作用。
具体为：
1)构建绿色荧光蛋白(GFP)与载体融合表达，得带有GFP的融合表达载体；
2)扩增效应因子，并将扩增效应因子连接到上述带有GFP的融合表达载体上，形成效应因子与GFP的重组载体；
3)将效应因子与GFP的重组载体与Rab蛋白分别进行表达和纯化；而后利用GTP的荧光类似物mantGTP置换与Rab蛋白紧密结合的GDP；
4)基于荧光共振能量转移检测Rab蛋白与效应因子之间的相互作用。
所述步骤1)以pCAMBIA1302质粒为模板，GFP_forward和GFP_reverse为引物扩增绿色荧光蛋白GFP的基因，而后利用载体上位于BamHI之前的任意限制性内切酶识别位点以及BamHI对扩增产物绿色荧光蛋白GFP的基因和载体分别进行双酶切，而后将GFP基因和载体的酶切片段进行连接，得带有绿色荧光蛋白(GFP)的融合表达载体。
所述引物为：
GFP_forward-CCATGGGCCATCATCATCATCATCACGTAGATCTGACTAGTAAAGGAGAAG；
GFP_reverse-CGCGGATCCTTTGTATAGTTCATCCATGCCAT。
BamHI
所述载体为带有BamHI限制性内切酶位点。
所述步骤2)通过PCR的方法扩增效应因子的基因，而后利用带有GFP的融合表达载体的多克隆位点中BamHI以BamHI之后的任意两个限制性内切酶进行双酶切，把效应因子的片段克隆到带有GFP的融合表达载体，即得效应因子与GFP的重组载体。
所述效应因子与GFP的重组载体中效应因子与绿色荧光蛋白GFP之间带有BamHI限制性内切酶位点。即GFP与效应因子之间通过BamHI限制性内切酶所对应的碱基进行连接，蛋白翻译之后，则绿色荧光蛋白GFP与效应因子之间连接的linker为Gly-Ser。Gly-Ser的柔性较大，通常不影响目标蛋白和标签蛋白的结构，非常适合作为标签蛋白和目的蛋白连接的linker。
所述步骤3)置换是利用GTP的荧光类似物mantGTP(2’-/3’-O-(N-Methylanthraniloyl)guanosine-5’-O-triphosphate)置换与Rab蛋白结合的GDP。
所述荧光共振能量转移方法中荧光信号检测所用荧光分光光度计的设定参数为：激发波长为365nm，发射波长为380-600nm，入射狭缝为5nm，发射狭缝为5nm，光电倍增管电压为700V。
原理，由荧光共振能量转移的方法可知较荧光供体和受体的发射光谱，如果激发供体，供体的发射谱强度反而降低，而受体的发射谱能量升高，即表示存在荧光共振能量转移，说明两者的距离小于10nm，存在相互作用；反之，如果激发供体，供体的发射谱强度升高，而受体的发射谱不变化，或者检测不到，说明两者的距离远，不存在相互作用。
本发明所具有的优点：
本发明所提供的方法是通过两个蛋白之间是否存在荧光共振能量转移来检测蛋白之间的相互作用，具体是，构建绿色荧光蛋白(GFP)与效应因子的融合表达载体，以绿色荧光蛋白作为发射基团，采用荧光共振能量转移的方法检测他们之间的相互作用。该发明方法简单、灵敏、分辨率高，能够定性定量的检测蛋白相互作用的强度，较好的解决了现有的检测蛋白质相互作用的假阳性高，操作复杂，相互作用不直接等弊端。
荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer)指距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象，作为一种新兴的体外检测蛋白质相互作用的方法，它能从“时间、空间、动态、连续”对蛋白质之间的相互作用进行检测，弥补了酵母双杂交以及免疫共沉淀等体内、体外检测蛋白质相互作用的缺点。
附图说明
图1为本发明实施例提供的mantGTP与GFP的激发与发射光谱图。
图2为本发明实施例提供的mantGTP结合形式的Rab蛋白与和绿色荧光蛋白GFP融合表达的效应因子之间的荧光共振能量转移谱图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的具体实施方式进行阐述，所述的实施方式仅仅用来解释和说明本发明，其并不限制本发明的保护范围。任何本领域技术人员根据公知的知识和现有技术的教导能够想到的等价的变体都包含在本发明的保护范围中。
实施例1
拟南芥中AtRabE1d蛋白是属于小G蛋白Rab家族中Rab8亚家族的一员，它在高尔基体反面囊膜到质膜的囊泡运输中发挥了重要的作用，AvrPto是丁香假单胞杆菌番茄致病变种通过III分泌系统所分泌到拟南芥中的效应因子，以近两年通过酵母双杂的手段筛选到AvrPto作为效应因子可能与GTP形式结合的AtRabE1d蛋白存在相互作用(Speth EB,Imboden L,Hauck P,He SY,Plant physiology,2009,149,1824-1837.)为例。
(1)构建GFP_pET28a融合表达载体；
pCAMBIA1302质粒为模板，GFP_forward和GFP_reverse为引物，PCR扩增，获得目的基因，而后通过NcoI/BamHI分别对获得的目的基因和pET28a载体进行双酶切，收集酶切产物，再通过T4连接酶16℃连接过夜，即成功构建GFP_pET28a表达载体。
所用引物为：
GFP_forward-CCATGGGCCATCATCATCATCATCACGTAGATCTGACTAGTAAAGGAGAA；
GFP_reverse-CGCGGATCCTTTGTATAGTTCATCCATGCCA。
BamHI
PCR扩增体系为：加入去离子水18.5μl，10×buffer 2.5μl，dNTP1μl，GFP_forward引物1μl，GFP_reverse引物1μl，模板1μl，TaqDNA聚合酶酶0.15μl，共组成25μl反应体系。
PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，72℃最终的延伸10min。
(2)将效应因子的基因连到上述获得的GFP_pET28a表达载体上；
以丁香假单胞杆菌蕃茄致病变种的基因组DNA(Pseudomonas syringae pv.tomato str.DC3000)为模板，AvrPto_forward和AvrPto_reverse为引物，PCR扩增效应因子AvrPto的目的基因。
而后通过BamHI/XhoI对获得的目的基因进行双酶切，收集酶切产物，再通过T4连接酶16℃连接过夜，即获得成功构建GFP_AvrPto_pET28a表达载体。绿色荧光蛋白GFP与效应因子之间通过BamHI限制性内切酶所识别的碱基进行连接，蛋白翻译之后，则绿色荧光蛋白GFP与效应因子之间连接的linker为Gly-Ser。
BamHI是一种非常常见的限制性内切酶，大部分载体都具有这个酶所识别的碱基序列。但是如果所选用的载体确实没有限制性内切酶BamHI所识别的碱基序列，那么在克隆绿色荧光的蛋白GFP到所选择载体上时设计的反向引物的5'端除了加上克隆时所用的限制性内切酶的识别序列，同时还要在此识别序列之前加上BamHI所识别的碱基序列，从而使得表达的蛋白在GFP的C末端和效应因子连接处包含Gly-Ser linker。
所用引物如下：
AvrPto_forward-CGGGATCCGGATCCAGGATGGCCCATC,
AvrPto_reverse-CCGCTCGAGCGGGCTAGGAGAAAGTGTTG。
PCR扩增体系为：
加入去离子水18.5μl，10×buffer 2.5μl，dNTP 1μl，GFP_forward引物1μl，GFP_reverse引物1μl，模板1μl，TaqDNA聚合酶酶0.15μl，共组成25μl反应体系。
PCR反应条件：
94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，72℃最终的延伸10min。
(3)将上述GFP_AvrPto_pET28a表达载体转入到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，在LB培养基中37℃表达，当OD600＝0.6-0.8时，经过0.2mM IPTG诱导，20℃表达过夜。第二天离心收获菌体。在菌体沉淀中加入缓冲溶液I涡旋震荡菌体，使其充分悬浮，冰浴条件下超声波破碎(工作2s，间歇5s)，细菌破碎完全后在4℃经16000转高速离心之后上清液即含有目的蛋白。上清液加入到已用缓冲溶液II平衡的镍柱进行亲和层析，经洗脱液III对镍柱进行洗脱之后即可获得带有GFP标签以及效应因子的融合蛋白。洗脱下来的融合蛋白经透析缓冲液IV进行透析除盐后，经密理博(Millipore)超滤管浓缩到10mg/ml待用。
缓冲溶液Ⅰ为：50mM NaPi，pH7.5；500mM NaCl；2mMβ-mercaptethanol；1mM PMSF。
缓冲溶液Ⅱ为：50mM NaPi，pH7.5；500mM NaCl；2mMβ-mercaptoethanol。
缓冲溶液Ⅲ为：50mM NaPi，pH7.5；500mM NaCl；500mMImidazol；2mMβ-mercaptoethanol。
缓冲溶液Ⅳ为：50mM HEPES，pH7.5；150mM NaCl；2mMDTT。
(4)纯化AtRabE1d蛋白，置换与其紧密结合的鸟苷酸GDP为mantGTP。
纯化AtRabE1d蛋白的过程采用上述步骤(3)记载的纯化方式进行，所用的缓冲溶液(Ⅰ～Ⅳ)中分别加入10μM GDP和1mM MgCl2，其纯化方法与效应因子的方法基本相同，最终获得以GDP形式结合的AtRabE1d:GDP蛋白。
置换与AtRabE1d紧密结合的鸟苷酸GDP为mantGTP的反应条件如下：在AtRabE1d:GDP蛋白中加入5 mM EDTA螯合Mg2+，以减弱GDP与AtRabE1d的结合能力，再加入相对于AtRabE1d摩尔数10倍量的mantGTP，冰上放置2小时，过NAP5柱子以除去小分子，收集AtRabE1d:mantGTP样品。
(5)基于荧光共振能量转移技术检测AtRabE1d:mantGTP和GFP_AvrPto之间的相互作用。图1、图2均为日立荧光光谱仪F-4600检测的结果，检测过程中所用的缓冲溶液为：50mM HEPES,50mM NaCl,5mM MgCl2,5mM DTT。
mantGTP的激发和最大发射波长分别为365nm和440nm，GFP的激发和最大发射波长分别为490nm和510nm。从图1可见，mantGTP的发射波长与GFP的激发波长存在一定重叠。
在AtRabE1d:mantGTP和GFP_AvrPto之间的相互作用的检测过程中，荧光信号检测所用F-4600荧光分光光度计的设定参数为：激发波长为365nm，发射波长为380-600nm，入射狭缝为5nm，发射狭缝为5nm，光电倍增管电压为700V。检测到AtRabE:mantGTP的发射光谱，在相同条件下加入GFP_AvrPto，从图2可见，在平衡状态下AtRabE:mantGTP的荧光强度逐渐降低而GFP_AvrPto的荧光强度逐渐增强，表明二者存在荧光共振能量转移，即存在相互作用。
实施例2:AtRabA4b是拟南芥中Rab家族成员，最近文献报道通过酵母双杂交的方法鉴定到它的一个新的效应因子Plant U-BOX13(PUB13)，并且文献中提到PUB13的UND和U-box结构域(氨基酸序列1-370)只能与以GTP形式结合的AtRabA4b相互作用(Antignani V,Klocko AL,Bak G,Chandrasekaran SD,Dunivin T,Nielsen E,The Plant Cell,2015,27,243-261.)。
(1)构建GFP_pET28a融合表达载体；
pCAMBIA1302质粒为模板，GFP_forward和GFP_reverse为引物，PCR扩增，获得目的基因，而后通过NcoI/BamHI分别对获得的目的基因和pET28a载体进行双酶切，收集酶切产物，再通过T4连接酶16℃连接过夜，即成功构建GFP_pET28a表达载体。
所用引物为：
GFP_forward-CCATGGGCCATCATCATCATCATCACGTAGATCTGACTAGTAAAGGAGAA；
GFP_reverse-CGCGGATCCTTTGTATAGTTCATCCATGCCA。
BamHI
PCR扩增体系为：加入去离子水18.5μl，10×buffer 2.5μl，dNTP 1μl，GFP_forward引物1μl，GFP_reverse引物1μl，模板1μl，TaqDNA聚合酶酶0.15μl，共组成25μl反应体系。
PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，72℃最终的延伸10min。
(2)将效应因子的基因连到上述获得的GFP_pET28a表达载体上；
以拟南芥基因组DNA(Arabidopsis thaliana)为模板，PUB13_forward和PUB13_reverse为引物，PCR扩增效应因子PUB131-370的目的基因。
而后通过BamHI/XhoI对获得的目的基因进行双酶切，收集酶切产物，再通过T4连接酶16℃连接过夜，即获得成功构建GFP_PUB131-370_pET28a表达载体。绿色荧光蛋白GFP与效应因子之间通过BamHI限制性内切酶所识别的碱基进行连接，蛋白翻译之后，则绿色荧光蛋白GFP与效应因子之间连接的linker为Gly-Ser。
所用引物如下：
PUB131-370_forward-CGGGATCCGAGGAAGAGAAAGCTTCTGC，
PUB131-370_reverse-CCGCTCGAG TCGTTGGTCCTCGGGGT。
PCR扩增体系为：
加入去离子水18.5μl，10×buffer 2.5μl，dNTP 1μl，GFP_forward引物1μl，GFP_reverse引物1μl，模板1μl，TaqDNA聚合酶酶0.15μl，共组成25μl反应体系。
PCR反应条件：
94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，72℃最终的延伸10min。
(3)将上述GFP_PUB131-370_pET28a表达载体转入到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，在LB培养基中37℃表达，当OD600＝0.6-0.8时，经过0.2mM IPTG诱导，20℃表达过夜。第二天离心收获菌体。在菌体沉淀中加入缓冲溶液I涡旋震荡菌体，使其充分悬浮，冰浴条件下超声波破碎(工作2s，间歇5s)，细菌破碎完全后在4℃经16000转高速离心之后上清液即含有目的蛋白。上清液加入到已用缓冲溶液II平衡的镍柱进行亲和层析，经洗脱液III对镍柱进行洗脱之后即可获得带有GFP标签以及效应因子的融合蛋白。洗脱下来的融合蛋白经过透析缓冲液IV进行透析除盐后，经密理博(Millipore)超滤管浓缩到12mg/ml待用。
缓冲溶液Ⅰ为：50mM NaPi，pH 7.5；500mM NaCl；2mMβ-mercaptoethanol；1mM PMSF。
缓冲溶液Ⅱ为：50mM NaPi，pH 7.5；500mM NaCl；2mM β-mercaptoethanol。
缓冲溶液Ⅲ为：50mM NaPi，pH 7.5；500mM NaCl；500mM Imidazol；2mMβ-mercaptoethanol。
缓冲溶液Ⅳ为：50mM HEPES，pH 7.5；150mM NaCl；2mMDTT。
(4)纯化AtRabA4b蛋白，置换与其紧密结合的鸟苷酸GDP为mantGTP。
纯化AtRabA4b蛋白的过程采用上述步骤(3)记载的纯化方式进行，所用的缓冲溶液(Ⅰ～Ⅳ)中分别加入10μM GDP和1mM MgCl2，其纯化方法与效应因子的方法基本相同，最终获得以GDP形式结合的AtRabA4b:GDP蛋白。
置换与AtRabA4b紧密结合的鸟苷酸GDP为mantGTP的反应条件如下：在AtRabA4b:GDP蛋白中加入5 mM EDTA螯合Mg2+，以减弱GDP与AtRabA4b的结合能力，再加入相对于AtRabA4b摩尔数10倍量的mantGTP，冰上放置2小时，过NAP5柱子以除去小分子，收集AtRabA4b:mantGTP样品。
(5)基于荧光共振能量转移技术检测AtRabA4b:mantGTP和GFP_PUB131-370之间的相互作用。
在AtRabA4b:mantGTP和GFP_PUB131-370相互作用的检测过程中所用的缓冲溶液为：50mM HEPES,50mM NaCl,5mM MgCl2,5mM DTT。荧光信号检测所用F-4600荧光分光光度计的设定参数为：激发波长为365nm，发射波长为380-600nm，入射狭缝为5nm，发射狭缝为5nm，光电倍增管电压为700V。检测到AtRabA4b:mantGTP的发射光谱，在相同条件下加入GFP_PUB131-370，在平衡状态下AtRabA4b:mantGTP的荧光强度逐渐降低而GFP_PUB131-370的荧光强度逐渐增强，表明二者存在荧光共振能量转移，即存在相互作用。
实施例3：Rab8a是人源中Rab家族成员，文献报道它的一个效应因子肌醇5-磷酸酶OCRL1540-678与Rab8a存在相互作用(Hou XM,Hagemann N,Schoebel S,Blankenfeldt W,Goody RS,Erdmann KS,Itzen A,The EMBO Journal,2011,30,1659-1670)。
(1)构建GFP_pET28a融合表达载体；
pCAMBIA1302质粒为模板，GFP_forward和GFP_reverse为引物，PCR扩增，获得目的基因，而后通过NcoI/BamHI分别对获得的目的基因和pET28a载体进行双酶切，收集酶切产物，再通过T4连接酶16℃连接过夜，即成功构建GFP_pET28a表达载体。
所用引物为：
GFP_forward-CCATGGGCCATCATCATCATCATCACGTAGATCTGACTAGTAAAGGAGAA；
GFP_reverse-CGCGGATCCTTTGTATAGTTCATCCATGCCA。
BamHI
PCR扩增体系为：加入去离子水18.5μl，10×buffer 2.5μl，dNTP1μl，GFP_forward引物1μl，GFP_reverse引物1μl，模板1μl，TaqDNA聚合酶酶0.15μl，共组成25μl反应体系。
PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，72℃最终的延伸10min。
(2)将效应因子的基因连到上述获得的GFP_pET28a表达载体上；
以人源基因组DNA(Homo sapiens)为模板，OCRL1_forward和OCRL1_reverse为引物，PCR扩增效应因子OCRL1540-678的目的基因。
而后通过BamHI/XhoI对获得的目的基因进行双酶切，收集酶切产物，再通过T4连接酶16℃连接过夜，即获得成功构建GFP_OCRL1540-678_pET28a表达载体。绿色荧光蛋白GFP与效应因子之间通过BamHI限制性内切酶所识别的碱基进行连接，蛋白翻译之后，则绿色荧光蛋白GFP与效应因子之间连接的linker为Gly-Ser。
所用引物如下：
OCRL1540-678_forward-CGCGGATCCGAACGAAGGTACCGGAAAG，
OCRL1540-678_reverse-CCGCTCGAGACTTGGGAGGTAATTTCCAC。
PCR扩增体系为：
加入去离子水18.5μl，10×buffer 2.5μl，dNTP 1μl，GFP_forward引物1μl，GFP_reverse引物1μl，模板1μl，TaqDNA聚合酶酶0.15μl，共组成25μl反应体系。
PCR反应条件：
94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，72℃最终的延伸10min。
(3)将上述GFP_OCRL1540-678_pET28a表达载体转入到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，在LB培养基中37℃表达，当OD600＝0.6-0.8时，经过0.2mM IPTG诱导，20℃表达过夜。第二天离心收获菌体。在菌体沉淀中加入缓冲溶液I涡旋震荡菌体，使其充分悬浮，冰浴条件下超声波破碎(工作2s，间歇5s)，细菌破碎完全后在4℃经16000转高速离心之后上清液即含有目的蛋白。上清液加入到已用缓冲溶液II平衡的镍柱进行亲和层析，经洗脱液III对镍柱进行洗脱之后即可获得带有GFP标签以及效应因子的融合蛋白。洗脱下来的融合蛋白经过透析缓冲液IV进行透析除盐后，经密理博(Millipore)超滤管浓缩到10mg/ml待用。
缓冲溶液Ⅰ为：50mM NaPi，pH 7.5；500mM NaCl；2mM β-mercaptoethanol；1mM PMSF。
缓冲溶液Ⅱ为：50mM NaPi，pH 7.5；500mM NaCl；2mMβ-mercaptoethanol。
缓冲溶液Ⅲ为：50mM NaPi，pH 7.5；500mM NaCl；500mM Imidazol；2mMβ-mercaptoethanol。
缓冲溶液Ⅳ为：50mM HEPES，pH 7.5；150mM NaCl；2mMDTT。
(4)纯化Rab8a蛋白，置换与其紧密结合的鸟苷酸GDP为mantGTP。
在纯化Rab8a蛋白的过程中除了上述所用到的缓冲溶液(Ⅰ～Ⅳ)都要加入10μM GDP和1mM MgCl2之外，其纯化方法与效应因子的方法基本相同，最终获得以GDP形式结合的Rab8a:GDP蛋白。
置换与Rab8a紧密结合的鸟苷酸GDP为mantGTP的反应条件如下：在Rab8a:GDP蛋白中加入5 mM EDTA螯合Mg2+，以减弱GDP与Rab8a的结合能力，再加入相对于Rab8a摩尔数10倍量的mantGTP，冰上放置2小时，过NAP5柱子以除去小分子，收集Rab8a:mantGTP样品。
(5)基于荧光共振能量转移技术检测Rab8a:mantGTP和GFP_OCRL1540-678之间的相互作用。
在Rab8a:mantGTP和GFP_OCRL1540-678相互作用的检测过程中所用的缓冲溶液为：50mM HEPES,50mM NaCl,5mM MgCl2,5mMDTT。荧光信号检测所用F-4600荧光分光光度计的设定参数为：激发波长为365nm，发射波长为380-600nm，入射狭缝为5nm，发射狭缝为5nm，光电倍增管电压为700V。检测到Rab8a:mantGTP的发射光谱，在相同条件下加入GFP_OCRL1540-678，在平衡状态下Rab8a:mantGTP的荧光强度逐渐降低而GFP_OCRL1540-678的荧光强度逐渐增强，表明二者存在荧光共振能量转移，即存在相互作用。

Claims (8)

1.一种基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法，其特征在于：以天然GTP的荧光类似物mantGTP置换与Rab蛋白结合的GDP，作为荧光共振能量转移的供体；构建Rab蛋白的效应因子与绿色荧光蛋白GFP融合表达的载体，融合蛋白经过表达纯化作为荧光共振能量转移的受体，而后在体外根据荧光共振能量转移方法直接检测以mantGTP形式结合的Rab蛋白和与绿色荧光蛋白GFP融合表达的效应因子之间的相互作用。
2.按权利要求1基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法，其特征在于：
1)构建绿色荧光蛋白(GFP)与载体融合表达，得带有GFP的融合表达载体；
2)扩增效应因子，并将扩增效应因子连接到上述带有GFP标签的融合表达载体上，形成效应因子与GFP的重组载体；
3)将效应因子与GFP的重组载体与Rab蛋白分别进行表达和纯化；而后利用GTP的荧光类似物mantGTP置换与Rab蛋白紧密结合的GDP；
4)基于荧光共振能量转移检测Rab蛋白与效应因子之间的相互作用。
3.按权利要求2基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法，其特征在于：所述步骤1)以pCAMBIA1302质粒为模板，GFP_forward和GFP_reverse为引物扩增绿色荧光蛋白GFP的基因，而后利用载体上位于BamHI之前的任意限制性内切酶识别位点以及BamHI对扩增产物绿色荧光蛋白GFP的基因和载体分别进行双酶切，而后将GFP基因和载体的酶切片段进行连接，得带有绿色荧光蛋白(GFP)的融合表达载体。
4.按权利要求3基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法，其特征在于：所述引物为：
GFP_forward-CCATGGGCCATCATCATCATCATCACGTAGATCTGACTAGTAAAGGAGAAG；
5.按权利要求2基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法，其特征在于：所述步骤2)通过PCR的方法扩增效应因子的基因，而后利用带有GFP的融合表达载体的多克隆位点中BamHI以BamHI之后的任意两个限制性内切酶进行双酶切，把效应因子的片段克隆到带有GFP的融合表达载体，即得效应因子与GFP的重组载体。
6.按权利要求5基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法，其特征在于：所述效应因子与GFP的重组载体中效应因子与绿色荧光蛋白GFP之间带有BamHI限制性内切酶位点。
7.按权利要求2基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法，其特征在于：所述步骤3)中置换是利用GTP的荧光类似物mantGTP(2’-/3’-O-(N-Methylanthraniloyl)guanosine-5’-O-triphosphate)置换与Rab蛋白结合的GDP。
8.按权利要求2基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法，其特征在于：所述荧光共振能量转移方法中荧光信号检测所用荧光分光光度计的设定参数为：激发波长为365nm，发射波长为380-600nm，入射狭缝为5nm，发射狭缝为5nm，光电倍增管电压为700V。
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