CN104762385A - 一种检测uPA功能的FRET生物传感器及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

一种检测uPA功能的FRET生物传感器及其构建方法与应用，所述FRET生物传感器含有配体uPA特异底物的蛋白与荧光供体和荧光受体蛋白构建的融合蛋白的真核表达载体。本发明还包括FRET生物传感器的构建方法与应用。本发明可以确定活软骨细胞中分子或蛋白之间的相互作用关系以及观察uPA的病理作用，而且可以明确活细胞下药物的作用、活细胞状态下治疗技术的应用等。本发明之检测uPA功能的FRET生物传感器具有操作简便、结果直观等特点。

Description

一种检测uPA功能的FRET生物传感器及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及一种单分子型FRET生物传感器及其构建方法与应用，具体涉及一种活细胞中检测uPA功能的单分子型FRET生物传感器及其构建方法与应用。
背景技术
骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)作为一种慢性退行性疾病，多见于中老年人，其致痛、致残率高，严重影响老年人的生活质量。流行病学调查显示，国内外60岁以上的老年人OA患病率高达50％，且随着年龄的增加患病率呈显著上升趋势。研究表明，OA的发生与年龄、性别、免疫反应、骨内压升高、酶对软骨的降解、细胞因子等因素相关，另外与基因的多态性也有较大关系，但其具体的发病机制仍然不清。其中，由软骨细胞所产生的参与细胞外基质及基底膜成分降解的蛋白水解酶成为国内外学者研究OA发病机制的热点。最新的研究表明，在众多酶系中，基质金属蛋白酶系统中MMP-3和丝氨酸蛋白水解酶系统中uPA在软骨的退变中起着极其重要的作用。其中，尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)是一种丝氨酸蛋白水解酶，在软骨退变的过程中扮演着始动因子的角色，其通过激活大量MMP-3，共同参与软骨细胞外基质的降解。基质金属蛋白酶-3(MMP-3)即基质溶解素-1，是基质金属蛋白酶类的主要成员之一，在正常稳定状态组织中MMP-3表达量很少，而在炎性细胞因子、激素、生长因子刺激下和细胞转化过程中其表达量上升，MMP-3可以通过降低激活纤溶酶原而下调与细胞有关的纤溶酶活性，同时也可以水解抗纤溶酶(a-AP)，从而促进纤溶酶介导的蛋白酶解，由此可见MMP-3和uPA共同促进软骨的降解。因此，研究uPA和MMPs之间的相互作用非常重要，然而近几年发展起来的生物技术均以细胞的破碎为代价，无法在活细胞状态下研究蛋白质及分子之间的相互作用，应用荧光共振能量转移技术(FRET)并结合基因工程等技术正好弥补了这一缺陷。
目前，FRET是一种观察活细胞内分子之间相互作用等的新技术，作为1～10nm距离范围内的光学“分子尺”，具有高分辨率、高灵敏度、简单方便的优点，可以定时、定量、定位、无损伤的检测活细胞内蛋白质相互作用以及蛋白酶活性等；其基本原理是通过易于检测的荧光共振能量转移的效率信息来反映两分子团的距离信息，而距离接近到10nm之间是两分子相互作用或一分子的两个结构域因构象改变而相互靠近的有力证据。通过FRET效率的增强可检测分子间发生相互作用或构象改变而靠近；FRET效率的减弱可用于证明两分子远离因而失去相互作用，或证明一个分子的两个部分间因分子被切断或构象改变而相互远离。FRET主要可分为分子内FRET和分子间FRET，即单分子型FRET和双分子型FRET：前者指在一个分子上标记两个探针，检测这个分子自身发生的一些变化；后者指在不同的两个分子上分别标记供体和受体探针，检测这两个分子之间的相互作用，受几方面的影响，双分子型FRET不如单分子型FRET。因此，利用FRET原理将所要研究的目的蛋白和荧光蛋白连接在一起构建融合蛋白，令其在细胞中表达，在一定条件下就可以研究蛋白质、各种分子之间相互作用以及蛋白酶的活性了。但是在制作单分子型FRET生物传感器时，特有的能量转移有效距离使得在涉及能量转移体系时需要复杂的表面功能化、供受体荧光蛋白与目的蛋白之间的化学键和制备步骤，其中，接头序列(Linker)设计是基因融合技术能否成功的关键技术之一，即通过一段适当的核苷酸序列将不同的目的基因连接起来，使其在适当的生物体内表达成为一条单一的肽链，其中起连接作用的氨基酸称为Linker。融合蛋白中的两种成分能否分别形成正确的空间结构、更好的发挥生物学活性，与连接融合蛋白中两种成分的接头序列密切相关。重组生成的融合蛋白要求插入融合蛋白中的linker不能影响目的蛋白各自的功能，因此，Linker序列的设计和选择对融合基因的构建至关重要。由上述众多因素导致开发高灵敏度的单分子型生物传感器受到了较大限制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种检测uPA功能的FRET生物传感器及其构建方法与应用。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是，
本发明之一种检测uPA功能的FRET生物传感器，所述FRET生物传感器含有配体uPA特异底物的蛋白与荧光供体和荧光受体蛋白构建的融合蛋白的真核表达载体。
进一步，所述FRET生物传感器还含有pcDNA3.1(+)质粒基因序列。
进一步，所述配体uPA特异底物的蛋白由SED ID NO：1所示的氨基酸序列组成。
进一步，编码所述配体uPA特异底物的蛋白的碱基序列如SED IDNO：2所示。
进一步，所述荧光供体为ECFP；荧光受体为EYFP。
本发明之一种检测uPA功能的FRET生物传感器的构建方法，包括以下步骤：
(1)荧光供体蛋白和荧光受体蛋白的基因克隆、鉴定：根据荧光供、受体蛋白质粒的相应地基因序列设计两对引物P1和P2，P3和P4，并在P1的5’端添加HindIII酶切位点，P2的5’端添加BamHI，P3的5’端添加BamHI和所述配体uPA特异底物的蛋白的碱基序列、Linker碱基序列；在P4的5’端添加EcoR I酶切位点，克隆含有上下游片段的荧光供、受体的基因全长序列；
(2)FRET生物传感器的构建：将pcDNA3.1(+)和荧光供体的PCR产物分别进行Hind III和BamHI双酶切处理，并将荧光供体的PCR产物插入pcDNA3.1(+)中，获得中间重组子pcDNA3.1(+)-荧光供体；接着用BamH I和EcoR I双酶切中间重组子pcDNA3.1(+)-荧光供体和荧光受体体的PCR产物，并将荧光受体的PCR扩增产物插入中间重组子pcDNA3.1(+)-荧光供体，获得重组质粒载体uPA生物传感器，并通过PCR、酶切、测序验证克隆目的片段的准确性。
进一步，步骤(1)中，所述荧光供、受体蛋白质粒选自pECFP-C1、pEYFP-C1；相应地克隆ECFP的引物对P1和P2，如SED ID NO：3和如SED ID NO：4所示；相应地克隆EYFP的引物对P3和P4，如如SED IDNO：5和如SED ID NO：6所示。
本发明之一种检测uPA功能的FRET生物传感器在活细胞中检测uPA功能的应用。
本发明之检测uPA功能的FRET生物传感器将含有特异性uPA底物的蛋白加载至融合有两种荧光的载体上，由于两种荧光蛋白相对空间距离较近，因此应用显微镜可捕获到特定的荧光波长。但当本发明生物传感器与活性uPA蛋白发生分子作用时，活性uPA与特异性底物结合，导致两种荧光蛋白发生空间位移，此时显微镜下捕获的荧光波长发生改变，由此可以确定活软骨细胞中分子或蛋白之间的相互作用关系以及观察uPA的病理作用，而且可以明确活细胞下药物的作用、活细胞状态下治疗技术的应用等。
本发明转染软骨细胞，在活细胞工作站上动态观察ECFP-YFP两种荧光转移变化，也可观察不同刺激物作用后，软骨细胞中uPA生物传感器的荧光淬灭过程的动态变化，uPA分子的时间、空间变化效应，从而直观的检查到uPA在软骨退变中的具体作用。由此可见，本发明之检测uPA功能的FRET生物传感器具有操作简便、结果直观等特点。
附图说明
图1为构建uPA生物传感器载体主要部分结构示意图。其中CMVpromoter：CMV启动子；ECFP：增强表达青色荧光蛋白；Linker，EYFP：黄色荧光蛋白。
图2为uPA生物传感器工作原理图。
图3为uPA特异底物-pMDTM-18T中间重组子双酶切鉴定结果。其中，1：uPA特异底物-pMDTM-18T中间重组子Sph I和ECOR I双酶切；M：DNA maker III。
图4为uPA在软骨细胞中的FRET现象。(A)CFP通道的荧光图像；(B)YFP通道的荧光图像；(C)FRET通道的荧光图像。
图5为用计算机分析转染uPA生物传感器的软骨细胞在IL-1刺激下的FRET现象。
图6为质粒构建流程图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步加以说明。
实施例1：单分子型FRET生物传感器的构建：
1、uPA特异底物的构建：(编码多肽基因参考文献获得；表达载体PECFP-c1，PEYFP-c1，pcDNA3.1均购买所得；宿主DH5alpha本实验室保存；Cacl2热激法将基因导入宿主；抗体筛选选择性法收集转化体)
uPA底物为自主设计合成的11个氨基酸多肽。uPA特异底物的蛋白由GGSGRSANAKC，如SED ID NO：1所示的氨基酸序列组成；uPA特异底物的碱基序列GGC GGC UCC GGC CGA UCC GCC GAC GCC AAA UGC，如SED ID NO：2所示。
2、荧光供、受体基因克隆、鉴定：根据现有质粒pECFP-C1、pEYFP-C1的相应地ECFP、EYFP基因序列设计两对引物P1和P2，P3和P4；所述克隆ECFP的上下游引物P1：CCCAAGCTTATGGTGAGCAAGGGCGAGG，如SED ID NO：3所示，P2：CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGC(单下划直线分别表示HindIII酶切位点、BamHI酶切位点；所述克隆EYFP的上下游引物)，如SED ID NO：4所示；P3：
CGGGATCCAGCGGCAGGAGCGCCAACGCC GTGAGCAAGGGCGAGGAG，如SED ID NO：5所示，P4：GGAATTCTTAAGCTCGAGATCTGAGTCC(单下划直线分别表示BamHI酶切位点、EcoR I酶切位点，单下划曲线表示所述配体uPA特异底物的蛋白的碱基序列，双下划直线表示Linker碱基序列)，如SED ID NO：6所示。并在P1的5’端添加HindIII酶切位点，P2的5’端添加BamHI，P3的5’端添加BamHI和所述配体uPA特异底物的蛋白的碱基序列、Linker碱基序列(FPSVVLWLE-TGCCCG UCU GUU GUG CUC UGG CUA GAG)；在P4的5’端添加EcoR I酶切位点，克隆含有上下游片段的荧光供、受体的基因全长序列；
3、FRET生物传感器的构建：将pcDNA3.1(+)和ECFP的PCR产物分别进行Hind III和BamH I双酶切处理，并将ECFP的PCR产物插入pcDNA3.1(+)中，获得中间重组子pcDNA3.1(+)-ECFP；接着用BamH I和EcoR I双酶切中间重组子pcDNA3.1(+)-ECFP和EYFP的PCR产物，并将EYFP的PCR扩增产物插入中间重组子pcDNA3.1(+)-ECFP，获得重组质粒载体uPA生物传感器，如图6所示，并通过PCR、酶切、测序验证克隆目的片段的准确性。
实施例2：单分子型FRET生物传感器的荧光分析
培养SD大鼠软骨细胞，转染uPA生物传感器，当CFP于420nm激发光激发时，uPA底物两端分别与CFP和YFP融合，使uPA底物在没有被裂解前刚好可以发生FRET，此时检测到的就是YFP的发射波长为515nm的荧光，即可同时观察到ECFP、YFP以及FRET通道的荧光图像，见图2和图4；应用炎症因子IL-1作为诱导试剂刺激软骨细胞24小时后，软骨细胞分泌大量uPA，这些激活的uPA作用于uPA底物，使得于uPA底物裂解成两个片段后，FRET效应自然消失，因而检测到的是CFP的发射波长为485nm的荧光，见图2。由此可观察软骨细胞荧光变化过程，见图5。由图5可知，从16min开始激活的uPA作用于uPA底物，FRET效应开始减弱，直至24min时FRET效应彻底消失，之后uPA底物两端又逐渐恢复与CFP和YFP融合，从而明确软骨细胞分泌表达uPA的实时效果。相对于传统的蛋白检测技术，此方法更加直观、灵敏。

Claims (8)

1.一种检测uPA功能的FRET生物传感器，其特征在于，所述FRET生物传感器含有配体uPA特异底物的蛋白与荧光供体和荧光受体蛋白构建的融合蛋白的真核表达载体。
2.根据权利要求1所述的检测uPA功能的FRET生物传感器，其特征在于，所述FRET生物传感器还含有pcDNA3.1阳性质粒基因序列。
3.根据权利要求1或2所述的检测uPA功能的FRET生物传感器，其特征在于，所述配体uPA特异底物的蛋白由SED ID NO：1所示的氨基酸序列组成。
4.根据权利要求1或2所述的检测uPA功能的FRET生物传感器，其特征在于，编码所述配体uPA特异底物的蛋白的碱基序列如SED IDNO：2所示。
5.根据权利要求1～4之一所述的检测uPA功能的FRET生物传感器，其特征在于，所述荧光供体为ECFP；荧光受体为EYFP。
6.一种如权利要求1～5之一所述的检测uPA功能的FRET生物传感器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)荧光供体蛋白和荧光受体蛋白的基因克隆、鉴定：根据荧光供、受体蛋白质粒的相应地基因序列设计两对引物P1和P2，P3和P4，并在P1的5’端添加Hind III酶切位点，P2的5’端添加BamHI，P3的5’端添加BamHI和所述配体uPA特异底物的蛋白的碱基序列、Linker碱基序列；在P4的5’端添加EcoR I酶切位点，克隆含有上下游片段的荧光供、受体的基因全长序列；
(2)FRET生物传感器的构建：将pcDNA3.1(+)和荧光供体的PCR产物分别进行Hind III和BamH I双酶切处理，并将荧光供体的PCR产物插入pcDNA3.1(+)中，获得中间重组子pcDNA3.1(+)-荧光供体；接着用BamH I和EcoR I双酶切中间重组子pcDNA3.1(+)-荧光供体和荧光受体体的PCR产物，并将荧光受体的PCR扩增产物插入中间重组子pcDNA3.1(+)-荧光供体，获得重组质粒载体uPA生物传感器，并通过PCR、酶切、测序验证克隆目的片段的准确性。
7.根据权利要求6所述的检测uPA功能的FRET生物传感器的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述荧光供、受体蛋白质粒选自pECFP-C1、pEYFP-C1；相应地克隆ECFP的引物对P1和P2，如SED IDNO：3和如SED ID NO：4所示；相应地克隆EYFP的引物对P3和P4，如如SED ID NO：5和如SED ID NO：6所示。
8.根据权利要求1～5之一所述的检测uPA功能的FRET生物传感器在活细胞中检测uPA功能的应用。
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