CN106928372B - 乙肝重组抗原及其表达基因、构建方法、病毒样颗粒及其制备方法、应用与疫苗 - Google Patents

乙肝重组抗原及其表达基因、构建方法、病毒样颗粒及其制备方法、应用与疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种乙肝重组抗原及其表达基因、构建方法、病毒样颗粒及其制备方法、应用与疫苗，乙肝重组抗原由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸表达得到。本发明通过将乙型肝炎病毒的preS区域与流感病毒血凝素信号肽区以及流感病毒跨膜区和胞内区拼接在一起而得到的乙肝重组抗原表达基因，并将其成功表达后得到乙肝重组抗原，免疫原性较好，能够在对接种传统疫苗不能产生抗体的少数人(约5％～10％)人身上使免疫系统产生免疫应答。同时，基于preS区域对乙肝病毒的不可或缺的重要性，可以针对preS区域制备出适应人群更广的疫苗。能够对乙肝病毒起到预防感染和清除的作用，有潜力转化到医学上成为一种新颖的预防性和治疗性乙肝疫苗。

Description

乙肝重组抗原及其表达基因、构建方法、病毒样颗粒及其制备 方法、应用与疫苗
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种乙肝重组抗原及其表达基因、构建方法、病毒样颗粒及其制备方法、应用与疫苗。
背景技术
乙型肝炎作为人类主要传染性疾病之一，在全球范围内影响达3亿人之多。据调查，中国有约十分之一的人是乙型肝炎病毒携带者。乙型肝炎病毒感染可以引起人的急性和慢性肝炎，而肝炎可以发展成更严重的疾病，比如肝硬化和肝癌等。
乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)，简称乙肝病毒，属于嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)，其对人和猩猩有易感性。乙型肝炎病毒颗粒的表面存在三种抗原分子，分别是小蛋白(the small protein，S蛋白)，中蛋白(the middle protein，M蛋白)和大蛋白(the large protein，L蛋白)，它们锚定在病毒的脂质双分子层膜中。上述三种蛋白质都包含一段由226个氨基酸组成的肽段，称为乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surfaceantigen，HBsAg)。
目前，临床上使用的乙型肝炎病毒的疫苗主要成分是灭活的以S蛋白为主的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)，接种该疫苗(HBsAg)的大部分人可产生抗体并有效抵抗乙型肝炎病毒的感染。但是，依然有少数人(约5％～10％)接种该疫苗不能产生抗体。因此，传统的乙型肝炎病毒的疫苗的免疫原性较差。
发明内容
基于此，有必要针对传统的乙型肝炎病毒的疫苗的免疫原性较差的问题，提供一种免疫原性相对较好的乙肝重组抗原及其表达基因、构建方法、病毒样颗粒及其制备方法、应用与疫苗。
一种乙肝重组抗原，由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸表达得到。
一种乙肝重组抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种乙肝重组抗原的表达基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
一种乙肝重组抗原表达基因的构建方法，包括：将乙型肝炎病毒的preS序列分别与流感病毒血凝素的信号肽区，以及流感病毒血凝素的跨膜区和胞内区相连接，得到所述乙肝重组抗原表达基因；其中，所述流感病毒血凝素信号肽区的碱基序列如SEQ ID NO.3所示；其中，所述流感病毒血凝素的跨膜区和胞内区的碱基序列如SEQ ID NO.4所示；其中，所述乙型肝炎病毒的preS区域的碱基序列如SEQ ID NO.5所示；其中，所述乙肝重组抗原表达基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
一种乙肝重组抗原病毒样颗粒，包括乙肝重组抗原和流感病毒基质蛋白M1，所述乙肝重组抗原的表达基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述流感病毒基质蛋白M1的表达基因的碱基序列如SEQ ID NO.6所示。
一种乙肝重组抗原病毒样颗粒的制备方法，包括：将流感病毒的基质蛋白M1的表达基因的碱基序列插入第一表达载体，得到M1-表达载体质粒，其中，流感病毒的基质蛋白M1的表达基因的碱基序列如SEQ ID NO.6所示；将如权利要求3所述的乙肝重组抗原的表达基因插入第二表达载体，得到preS-HA-表达载体质粒；将所述preS-HA-表达载体质粒和所述M1-表达载体质粒共同转染至宿主细胞中，培养转染后的所述宿主细胞，产生乙肝重组抗原病毒样颗粒。
如上任一实施例中所述的乙肝重组抗原在制备乙肝防治药物领域和制备乙肝疫苗领域中的用途。
如上任一实施例中所述的乙肝重组抗原的表达基因在制备乙肝防治药物领域和制备乙肝疫苗领域中的用途。
如上任一实施例中所述乙肝重组抗原病毒样颗粒在制备乙肝防治药物领域和制备乙肝疫苗领域中的用途。
一种乙肝防治的疫苗，包括如上任一实施例中所述乙肝重组抗原病毒样颗粒。
本发明通过将乙型肝炎病毒的preS区域与流感病毒血凝素信号肽区以及流感病毒跨膜区和胞内区拼接在一起而得到的乙肝重组抗原表达基因，并将其成功表达后得到乙肝重组抗原，免疫原性较好，能够在对接种传统疫苗不能产生抗体的少数人(约5％～10％)人身上使免疫系统产生免疫应答。同时，基于preS区域对乙肝病毒的不可或缺的重要性，可以针对preS区域制备出适应人群更广的疫苗，即，既能在大部分人身上起到免疫应答，同时，也能在对传统疫苗不起反应的5％～10％比例的人身上使免疫系统产生免疫应答。还能够对乙肝病毒起到预防感染和清除的作用，有潜力转化到医学上成为一种新颖的预防性和治疗性乙肝疫苗。
附图说明
图1A为乙肝病毒表面蛋白的结构示意图；
图1B为乙肝病毒表面蛋白的蛋白结构示意图；
图2A为本发明的乙肝重组抗原表达基因构建策略图；
图2B为本发明的乙肝重组抗原表达基因构建流程图；
图3A为preS-HA-pCAGGS质粒、M1-pCAGGS质粒和preS-pET28b质粒的SDS-PAGE鉴定结果；
图3B为preS-pET28b质粒转染进大肠杆菌后所表达的preS蛋白SDS-PAGE鉴定结果；
图3C为preS多克隆抗体的SDS-PAGE鉴定结果；
图4为乙肝重组抗原病毒样颗粒的western blotting鉴定结果；
图5为乙肝重组抗原病毒样颗粒的透射电子显微镜分析结果；
图6A为qPCR实验检测乙肝重组抗原表达基因和流感病毒的基质蛋白M1序列的转录情况；
图6B为转染细胞后的免疫荧光成像；
图6C为转染细胞后的免疫荧光成像；
图7A为质粒转染后的细胞沉淀和上清中乙肝重组抗原的表达情况的Westernblot分析结果；
图7B为蔗糖密度梯度离心法所得各个组分样品的SDS-PAGE分析结果；
图7C为大肠杆菌中表达的preS蛋白和蔗糖密度梯度离心法所得各个组分样品的SDS-PAGE分析结果；
图7D为preS病毒样颗粒(preS VLP)的电镜透射结果；
图7E为40％蔗糖液中的基质蛋白M1和乙肝重组抗原的LC-MS/MS鉴定结果；
图8A为血清中anti-preS抗体滴度的ELISA法检测分析结果；
图8B为血清中anti-preS抗体滴度的ELISA法检测分析结果；
图8C为血清中anti-preS抗体滴度的ELISA法检测分析结果；
图8D为血清中anti-preS抗体滴度的ELISA法检测分析结果；
图9A为乙肝重组抗原病毒样颗粒引起的小鼠T细胞免疫反应结果；
图9B为乙肝重组抗原病毒样颗粒引起的小鼠T细胞免疫反应结果；
图9C为乙肝重组抗原病毒样颗粒引起的小鼠T细胞免疫反应结果；
图9D为乙肝重组抗原病毒样颗粒引起的小鼠T细胞免疫反应结果；
图9E为乙肝重组抗原病毒样颗粒引起的小鼠T细胞免疫反应结果；
图10A为小鼠肝组织中乙肝RNA的qPCR法检测分析结果；
图10B为小鼠肝组织中免疫组织化学染色结果；
图10C为小鼠肝组织中免疫组织化学染色结果；
图10D为小鼠肝组织中免疫组织化学染色结果；
图10E为小鼠肝组织中免疫组织化学染色结果；
图10F为小鼠血清中HBsAg检测分析结果；
图10G为小鼠血清中HBeAg检测分析结果；
图10H为小鼠血清中and anti-preS抗体滴度的ELISA检测分析结果；
图11A为小鼠脾淋巴细胞的T细胞分析结果；
图11B为小鼠脾淋巴细胞的T细胞分析结果；
图11C为小鼠脾淋巴细胞的T细胞分析结果；
图11D为小鼠脾淋巴细胞的T细胞分析结果；
图11E为小鼠脾淋巴细胞的T细胞分析结果；
图11F为小鼠肝淋巴细胞的T细胞分析结果。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
如本文所用的术语“乙型肝炎病毒的preS序列”，是表达乙型肝炎病毒(HepatitisB Virus,简称HBV)的preS的基因，这里的基因，更具体讲，是指DNA碱基序列。乙型肝炎病毒的preS是表达乙型肝炎病毒在其表面延伸出的一段肽段。请一并参阅图1A及图1B，乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,简称HBV)颗粒的表面存在三种抗原分子，分别是小蛋白(thesmall protein，S蛋白)，中蛋白(the middle protein，M蛋白)和大蛋白(the largeprotein，L蛋白)，它们锚定在病毒的脂质双分子层膜中，上述三种蛋白质都包含一段由226个氨基酸组成的肽段，称为HBsAg(hepatitis B surface antigen)。S蛋白全部由HBsAg组成。M蛋白在S蛋白的N端延伸出55个氨基酸肽段，这55个氨基酸组成的肽段称为preS2。L蛋白在M蛋白的基础上在N端继续延伸出119个氨基酸(基因型A和C)或者108个氨基酸(基因型D)，延伸出的肽段称为preS1。请一并参阅图1A及图1B，全长preSAg包括preS1和preS2两个部分。
如本文所用的术语“流感病毒血凝素”，是指血凝素突起(hemagglutinin,HA)，其作用是帮助病毒吸附到宿主细胞(被侵染细胞)的细胞膜上，并进一步侵入细胞。它是病毒致病的重要因素。不同毒株和亚型的流感病毒感染性不同，就是因为它们会有各自不同的HA糖蛋白突起(结构和抗原特性的不同)。呈柱状，能与人、鸟、猪豚鼠等动物红细胞表面的受体相结合引起凝血，故而被称作血凝素。血凝素蛋白水解后分为轻链和重链两部分，重链可以与宿主细胞膜上的唾液酸受体相结合，轻链则可以协助病毒包膜与宿主细胞膜相互融合。血凝素在病毒导入宿主细胞的过程中扮演了重要角色。
如本文所用的术语“VLP”，是指病毒样颗粒(Virus like particle，简称VLP)，在结构和形态上类似具有感染性的病毒，但由于它不包含病毒基因成分，因此没有传染性。表达病毒的结构蛋白，比如包膜或核衣壳，这些蛋白可自组装成病毒样颗粒。本身作为抗原的病毒样颗粒，由于其很高的免疫原性和安全性，病毒样颗粒有望成为新型病毒疫苗。病毒样颗粒可以引起更强大和广泛的免疫反应，分泌高水平的中和抗体来保护机体免受病毒感染。
如本文所用的，“有效剂量”一般指足以诱导免疫力、预防和/或改善乙肝的至少一种症状、和/或增强另一个剂量的疫苗的效力的本发明疫苗的量。有效剂量可以指足以延迟乙肝感染发作或使之最小化的疫苗的量。有效剂量还可以指在乙肝的治疗或管理中提供治疗益处的疫苗的量。此外，有效剂量是就单独或与其它疗法组合在乙肝病毒感染的治疗或管理中提供治疗益处的本发明疫苗而言的量。有效剂量还可以是足以增强受试者(例如人)自己针对后来与乙肝病毒接触的免疫应答的量。免疫力的水平可以通过例如测量中和性分泌抗体和/或血清抗体的量来加以监测，所述测量例如通过噬斑中和(plaqueneutralization)、补体结合(complement fixation)、酶联免疫吸附、或微中和(microneutralization)测定来进行。在疫苗的情况下，“有效剂量”是预防疾病或降低症状严重性的剂量。
如本文所用的，“表达载体”是能够促进纳入其中的核酸的表达和复制的载体，例如质粒。典型地，要表达的核酸与启动子和/或增强子“可操作地连接”，并受该启动子和/或增强子的转录调控。
目前以S蛋白为主的乙型肝炎HBsAg疫苗在约5％～10％比例的人身上不能引起免疫系统产生免疫应答。有研究(Glebe D,Urban S,Knoop EV,Cag N,Krass P,Grun S,Bulavaite A,Sasnauskas K,Gerlich WH.Mapping of the hepatitis B virusattachment site by use of infection-inhibiting preS1 lipopeptides and tupaiahepatocytes.Gastroenterology2005；129:234-245)表明preS1的2-38位氨基酸是人乙型肝炎病毒发挥附着和感染作用所必需的位点。preS2区域在病毒进入宿主细胞和病毒从胞浆中释放的过程中起着至关重要的作用，去除preS1区域的C末端和preS2的N末端，用这样缺失的乙型肝炎病毒基因组DNA感染肝细胞，不能分泌成熟的病毒颗粒(Le Seyec J,Chouteau P,Cannie I,Gugen-Guillouzo C,Gripon P.Role of the pre-S2 domain ofthe large envelope protein in hepatitis B virus assembly andinfectivity.J.Virol.1998；72:5573-5578)。
因此，preS区域在乙型肝炎病毒的生活周期中起着不可或缺的作用，对其进一步研究成为本发明的探索方向。更重要的是，在对S区域不起免疫反应的B10.S小鼠，当抗原分别加入preS2和全长preS时，可以引起免疫反应，分泌S-特异性抗体。进一步地，在对S区域和preS2区域均不起免疫反应的B10.M小鼠，当抗原加入preS1区域时，可以引起免疫反应，分泌S-特异性抗体和preS2-特异性抗体。因此，preS可以使不起反应的小鼠产生中和抗体。那么，preS VLP很可能使对经典乙肝疫苗不起免疫反应的5％～10％人产生中和抗体。
preS区域有望在不能对以S蛋白为主的乙型肝炎HBsAg疫苗起免疫应答的人群身上起作用。
本发明提供一种由乙型肝炎病毒的preS区域与流感病毒血凝素(haemagglutinin,HA)信号肽区以及流感病毒跨膜区和胞内区拼接在一起而得到的preS-HA融合基因，即为乙肝重组抗原的表达基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供一种乙肝重组抗原，由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸表达得到，例如，乙肝重组抗原的表达基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。又如，一种乙肝重组抗原，由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸表达得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种乙肝重组抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明通过将乙型肝炎病毒的preS区域与流感病毒血凝素信号肽区以及流感病毒跨膜区和胞内区拼接在一起而得到的preS-HA融合基因，并将其成功表达后得到preS-HA嵌合蛋白，即为乙肝重组抗原，免疫原性较好，能够在对传统的乙型肝炎病毒的疫苗不起反应的少数人身上使免疫系统产生免疫应答。同时，基于preS区域对乙肝病毒的不可或缺的重要性，可以针对preS区域制备出适应人群更广的疫苗，即，既能在大部分人身上起到免疫应答，同时，也能在对传统疫苗不起反应的5％～10％比例的人身上使免疫系统产生免疫应答。
能够理解，感染了乙肝病毒的患者体内，容易出现免疫耐受的情况。如何使preS区域能够更好地被机体识别，产生特异性较强的免疫反应以清除乙肝病毒或者被乙肝病毒感染了的细胞对于乙肝病毒的清除至关重要。perS区域虽然对乙肝病毒不可或缺，如何更好的将perS区域展示给免疫系统，如何使其能够更好的被展示到细胞膜的表面，以使preS区域能够更好地被机体识别是一个较为棘手的问题。
例如，将流感病毒血凝素信号肽区以及流感病毒的跨膜区和胞内区与乙型肝炎病毒的preS区域拼接，其中，流感病毒的跨膜区和胞内区作为一个整体，该整体与乙型肝炎病毒的preS区域拼接，又如，将乙型肝炎病毒的preS区域分别与该整体以及流感病毒血凝素信号肽区进行拼接；这样，基于流感病毒的易感性，一方面能够使perS区域能够较好地被展示到细胞膜的表面，另一方面，还可以表达出含量较高以及免疫原性较强的preS-HA嵌合蛋白，以促使机体能够产生更强烈的体液免疫反应和细胞免疫反应。
本实施例中，流感病毒为A/sw/Spain/53207/04，可以理解，本发明亦可采用其它流感病毒实现。
例如，本发明还提供一种乙肝重组抗原，其为preS-HA融合基因编码表达，其具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。将preS-HA融合基因转染至宿主细胞后，其得到较好的表达。或者说，乙肝重组抗原亦可理解为preS-HA嵌合蛋白。
本实施例中，通过将流感病毒血凝素HA的DNA分子进行PCR扩增，得到流感病毒血凝素信号肽区的碱基序列以及流感病毒跨膜区和胞内区的碱基序列。
本实施例中，流感病毒血凝素HA的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，流感病毒血凝素HA的DNA分子碱基序列如SEQ ID NO.8所示。
本实施例中，流感病毒血凝素信号肽区的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，流感病毒血凝素的跨膜区和胞内区的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。又如，流感病毒血凝素信号肽由流感病毒血凝素信号肽区表达。又如，流感病毒血凝素信号肽包括流感病毒血凝素的第1～20位氨基酸序列。又如，流感病毒血凝素的跨膜区和胞内区的氨基酸序列为流感病毒血凝素的第521-566位的氨基酸序列。其中，流感病毒血凝素的第1～20位氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示，流感病毒血凝素的第521-566位氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
在其中一个实施例中，所述流感病毒血凝素的跨膜区和胞内区的碱基序列的末端还连接有TAA的终止子，即，流感病毒血凝素的跨膜区和胞内区的碱基序列的末端GCATT后面还有TAA序列。
又如，本发明还提供如上preS-HA融合基因的构建方法，preS-HA融合基因的构建方法包括：将乙型肝炎病毒的preS序列分别与流感病毒血凝素的信号肽区，以及流感病毒血凝素的跨膜区和胞内区相连接，得到所述乙肝重组抗原表达基因；亦即，将乙型肝炎病毒的preS序列分别与流感病毒血凝素信号肽区和流感病毒血凝素的跨膜区和胞内区相连接；其中，流感病毒血凝素信号肽区的碱基序列如SEQ ID NO.3所示；其中，流感病毒血凝素的跨膜区和胞内区的碱基序列如SEQ ID NO.4所示；其中，乙型肝炎病毒的preS区域的碱基序列如SEQ ID NO.5所示。例如，preS-HA融合基因即为乙肝重组抗原表达基因。
本实施例中，流感病毒血凝素信号肽区为编码流感病毒血凝素的第1～20位氨基酸的DNA分子，流感病毒血凝素的第1～20位氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。本实施例中，流感病毒血凝素的跨膜区和胞内区为编码流感病毒血凝素的第521-566位氨基酸的DNA分子，流感病毒血凝素的第521-566位氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
如何使乙肝重组抗原能够在免疫耐受的情况下引起机体的免疫反应，本发明设计了一种乙肝重组病毒样颗粒，将乙肝重组抗原嵌合于流感病毒基质蛋白的表面，以使其具有更大的展示面积。这也从后续的实验中得以证实。
例如，本发明还提供一种乙肝重组抗原病毒样颗粒，包括流感病毒基质蛋白M1和乙肝重组抗原，其中，乙肝重组抗原的表达基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，流感病毒基质蛋白M1的表达基因的碱基序列如SEQ ID NO.6所示。乙肝重组抗原嵌合于流感病毒基质蛋白的表面。乙肝重组抗原病毒样颗粒简称为preS VLP。
例如，本发明还提供一种preS VLP的制备方法，preS VLP的制备方法包括：将流感病毒的基质蛋白M1的表达基因的碱基序列插入第一表达载体，得到M1-表达载体质粒，其中，流感病毒的基质蛋白M1的表达基因的碱基序列如SEQ ID NO.6所示；将如上任一实施例所述的preS-HA融合基因插入第二表达载体，得到preS-HA-表达载体质粒；将preS-HA-表达载体质粒和M1-表达载体质粒共同转染至宿主细胞中，培养转染后的宿主细胞，从而产生preS VLP。例如，preS VLP即为乙肝重组抗原病毒样颗粒。
为了增强对流感病毒颗粒的释放，本实施例中，将流感病毒基质蛋白M1的第41位氨基酸突变成为丙氨酸(Ala)，以增强对病毒性颗粒的释放，达到提高后续制备得到的preSVLP的产量的效果。
通过将M1-表达载体质粒和preS-HA-表达载体质粒共转染至宿主细胞中，能够更好地使preS-HA嵌合蛋白能够较好的被展示在细胞膜上，甚至分泌至细胞外，从而能够便于后续对preS VLP或者preS-HA嵌合蛋白的提取。同时，基于流感病毒基质蛋白的球状结构特性，可以使preS-HA嵌合蛋白结合在M1蛋白的表面，从而使得preS-HA嵌合蛋白具有更大的展示面积以展示给机体，以促使机体能够产生更强烈的体液免疫反应和细胞免疫反应。需要说明的是，preS-HA嵌合蛋白即为乙肝重组抗原。
具体实施例中，第一表达载体和第二表达载体可以相同，也可以相异。例如，第一表达载体和第二表达载体相同。
本实施例中，第一表达载体和第二表达载体为质粒载体。又如，质粒载体为pCAGGS载体，又如，质粒载体为pCAGGS载体，宿主细胞为293T细胞，这样，能够使preS-HA嵌合蛋白较好地表达。
需要说明的是，现有应用的perS蛋白，主要是由大肠杆菌中表达并纯化得到的。用于人体时，异源性强，安全隐患高。因此，有必要提供一种人源性的perS蛋白，以提高将其用做预防或治疗乙肝的药物或者疫苗时的安全性。通过将载体为pCAGGS载体，宿主细胞为293T细胞，能够获得人源性的preS-HA嵌合蛋白，以提高将其用做预防或治疗乙肝的药物或者疫苗时的安全性。
又一实施例中，质粒载体为pFastBac1载体，又如，质粒载体为pFastBac1baculovirus transfer vector plasmid载体，又如，载体为pFastBac1载体，宿主细胞为SF9细胞，这样，能够使preS-HA嵌合蛋白被大量表达，preS-HA嵌合蛋白的产量较高，便于生产和提纯。
例如，本发明还提供一种重组载体，该表达载体含有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。例如，重组载体为pCAGGS载体。又如，重组载体为pFastBac1载体。
例如，本发明还提供一种preS VLP(乙肝重组抗原病毒样颗粒)的制备方法，preSVLP的制备方法包括：将流感病毒的基质蛋白M1的表达基因的碱基序列插入第一表达载体，得到M1-表达载体质粒，其中，流感病毒的基质蛋白M1的表达基因的碱基序列如SEQ IDNO.6所示；将如上的preS-HA融合基因插入第二表达载体，得到preS-HA-表达载体质粒；将preS-HA-表达载体质粒和M1-表达载体质粒共同转染至宿主细胞中，培养转染后的宿主细胞，从而产生preS VLP。例如，第一表达载体和第二表达载体为pCAGGS，宿主细胞为293T细胞。又如，第一表达载体和第二表达载体为pFastBac1载体，宿主细胞为SF9细胞。
例如，本发明还提供一种preS VLP(乙肝重组抗原病毒样颗粒)，采用如上任一preS VLP的制备方法制备得到。
例如，本发明提供的preS-HA融合基因(乙肝重组抗原表达基因)在制备预防或治疗乙肝药物中的用途，即上述任一实施例所述preS-HA融合基因在制备预防或治疗乙肝药物中的用途或应用。基于基因疫苗或者DNA疫苗的技术，本发明提供的preS-HA融合基因有潜力或能够应用于预防或治疗乙肝药物或疫苗中。或者说，preS-HA融合基因有潜力或能够应用于在制备乙肝防治药物中。需要说明的是，疫苗也可以理解为药物，同时，对将preS-HA融合基因应用于细胞培养制剂过程中，亦可当作其为药物的用途，比如，将其应用于CAR-T细胞疗法中。
例如，本发明提供的preS-HA嵌合蛋白(乙肝重组抗原)在制备预防或治疗乙肝疫苗中的用途，即上述任一实施例所述preS-HA嵌合蛋白在制备预防或治疗乙肝疫苗中的用途或应用。本发明提供的preS-HA嵌合蛋白有潜力或能够应用于预防或治疗乙肝药物或疫苗中。或者说，preS-HA嵌合蛋白有潜力或能够应用于在制备乙肝防治疫苗中。
例如，本发明提供preS VLP(乙肝重组抗原病毒样颗粒)在制备预防或治疗乙肝药物中的用途，即上述任一实施例所述preS VLP。在制备预防或治疗乙肝药物中的用途或应用。本发明提供的preS VLP有潜力应用于预防或治疗乙肝药物或疫苗中。或者说，preS VLP有潜力应用于在制备乙肝防治疫苗中。
例如，本发明还提供一种预防或治疗乙肝的疫苗，包括如上乙肝重组抗原病毒样颗粒。又如，所述疫苗包括有效量如上preS VLP。例如，有效量为10微克。又如，有效量为0.0000001～0.5微克/g体重，此为从后期小鼠的实验推导出，以六周龄的小鼠体重约计20～30克计算。或者说，本发明还提供一种乙肝防治的疫苗，包括有效量的如上preS VLP。
本发明通过将乙型肝炎病毒的preS区域与流感病毒血凝素信号肽区以及流感病毒跨膜区和胞内区拼接在一起而得到的乙肝重组抗原表达基因，并将其成功表达后得到乙肝重组抗原，免疫原性较好，能够在对接种传统疫苗不能产生抗体的少数人(约5％～10％)人身上使免疫系统产生免疫应答。同时，基于preS区域对乙肝病毒的不可或缺的重要性，可以针对preS区域制备出适应人群更广的疫苗，即，既能在大部分人身上起到免疫应答，同时，也能在对传统疫苗不起反应的5％～10％比例的人身上使免疫系统产生免疫应答。还能够对乙肝病毒起到预防感染和清除的作用，有潜力转化到医学上成为一种新颖的预防性和治疗性乙肝疫苗。
下面结合具体实施例继续对本发明予以说明。
实施例1
1、质粒的构建
(1)、Pres-HA融合基因的构建
Pres-HA融合基因构建策略请见图2A及图2B。
从流感病毒血凝素的HA序列中获得流感病毒血凝素信号肽区以及流感病毒跨膜区和胞内区。其中，流感病毒血凝素的HA的碱基序列如SEQ ID NO.8所示，流感病毒血凝素信号肽区的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，流感病毒跨膜区和胞内区的碱基序列如SEQ IDNO.4所示。流感病毒血凝素信号肽区为编码流感病毒血凝素的第1～20位氨基酸的DNA分子，流感病毒血凝素的第1～20位氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。流感病毒血凝素的跨膜区和胞内区为编码流感病毒血凝素的第521-566位氨基酸的DNA分子，流感病毒血凝素的第521-566位氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。其中，流感病毒为A/sw/Spain/53207/04。
从乙肝病毒中获取preS区域的序列，乙型肝炎病毒的preS区域的碱基序列如SEQID NO.5所示，乙型肝炎病毒的preS区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
请参阅图2A，通过将乙型肝炎病毒的preS区域连接在流感病毒血凝素的信号肽区(singel peptide from HA)以及流感病毒跨膜区和胞内区(transmembrane domain andcytoplasmic tail of HA，HA TM/CT)之间，或者说，将乙型肝炎病毒的preS区域插入至流感病毒血凝素的信号肽区(singel peptide from HA)以及流感病毒跨膜区和胞内区(HATM/CT)之间，来制备preS-HA融合基因，其所表达的蛋白质作为抗原能够基于流感病毒血凝素较强的免疫原性，在体内刺激机体产生更强烈的免疫反应，使得机体产生针对preS的免疫反应，从而减少或者清除乙肝病毒。尤其需要说明的是，乙型肝炎病毒的preS区域能够较为方便地插入流感病毒血凝素的N端，使得preS-HA融合基因的制备较为便捷。更具体的，乙型肝炎病毒的preS区域能够较为方便地插入流感病毒血凝素流感病毒跨膜区和胞内区的N端，使得preS-HA融合基因的制备较为便捷。
通过PCR制备preS-HA融合基因。preS-HA融合基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，preS-HA融合基因表达的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
请参阅图2B，其为构建preS-HA融合基因的流程。Fragment1为流感病毒血凝素的信号肽区(signal peptide from HA)，其碱基序列如SEQ ID NO.3所示。Fragment2为乙型肝炎病毒的preS区域的碱基序列(sequence of preS)，其碱基序列如SEQ ID NO.5所示。Fragment3为流感病毒跨膜区和胞内区(transmembrane domain and cytoplasmic tailof HA)，其碱基序列如SEQ ID NO.4所示。其中，PCR引物如下：preS I、preS II、preS III、preS IV、preS V及preS VI，其中，preS I的碱基序列如SEQ ID NO.12所示，preS II的碱基序列如SEQ ID NO.13所示，preS III的碱基序列如SEQ ID NO.14所示，preS IV的碱基序列如SEQ ID NO.15所示，preS V的碱基序列如SEQ ID NO.16所示，preS VI的碱基序列如SEQID NO.17所示。
preSI为如图2B所示I，其为Fragment1正链的引物。preSII为如图2B所示II，其为Fragment1反链的引物。preS III为如图2B所示III，其为Fragment2正链的引物。preS IV为如图2B所示IV，其为Fragment2反链的引物。preS V为如图2B所示V，其为Fragment3正链的引物。preS VI为如图2B所示VI，其为Fragment3反链的引物。又如，preS I、preS III和preSV为正向引物，preS II、preS IV和preS VI为反向引物。例如，反链即为负链。
本实施例中，通过PCR反应制备preS-HA融合基因。例如，PCR反应包括：第一PCR反应、第二PCR反应、第三PCR反应、第四PCR反应、第五PCR反应及第六PCR反应。
通过第一PCR反应、第二PCR反应、第三PCR反应分别制备Fragment1、Fragment2和Fragment3。
第一PCR反应以流感病毒的血凝素HA序列或者pCAGGS-HA质粒为模版，以preSI为正链引物，以preSII为反链引物，扩增而得到Fragment1。其中，pCAGGS-HA质粒采用本实验室制备品，亦可采用其它来源的pCAGGS-HA质粒(例如，可由淼灵质粒平台采购，货号：VT1017)。流感病毒的血凝素HA的DNA分子的提取和获得可参照现有相关技术实现，本发明在此不再赘述。
第二PCR反应以乙肝病毒的preS序列或者pET28b-preS质粒为模版，以preSIII为正链引物，以preSIV为反链引物，扩增而得到Fragment2。其中，pET28b-preS质粒为本实验室之前制备得到(Lian M,Zhou X,Wei L,Qiu S,Zhou T,Li L,et al.Serum levels ofpreS antigen(HBpreSAg)in chronic hepatitis B virus infected patients.Virol J2007；4:93)，乙肝病毒的preS序列的提取和获得可参照现有技术实现，本发明在此不再赘述。又如，preS序列为adw subtype,Accession Number AGW20902。
第三PCR反应以流感病毒的血凝素HA序列或者pCAGGS-HA质粒为模版，以preSI为正链引物，以preSIV为反链引物，扩增而得到Fragment3。
第四PCR反应以Fragment1和Fragment2为模版，以preSI为正链引物，以preSIV为反链引物，扩增得到将Fragment1和Fragment2连接后的产物，即为Fragment4。例如，Fragment4为Fragment1和Fragment2连接后的产物。
第五PCR反应以Fragment2和Fragment3为模版，以preSIII为正链引物，以preSVI为反链引物，扩增得到将Fragment2和Fragment3连接后的产物，即为Fragment5。或者可以理解为，Fragment5为Fragment2和Fragment3连接后的产物。
第六PCR反应以Fragment4和Fragment5为模版，以preSI为正链引物，以preSVI为反链引物，扩增得到将Fragment4和Fragment5连接后的产物，即为Fragment6。例如，Fragment6为Fragment4和Fragment4连接后的产物。Fragment6即为preS-HA融合基因。
本实施例中，PCR反应的体系为：DNA模版1μl，10μM的正链引物1μl，10μM的反链引物1μl，双蒸水22μl，2×Pfu PCR StarMix 25μl。具体在各PCR反应中，DNA模版为各PCR反应中的模版，当各PCR反应中有两个模版时，则两个模版分别为0.5μl。
当然，本反应体系的2×Pfu PCR StarMix也可以是其它的Taq酶、dNTP、Mg2+、缓冲液替代。
本实施例中，PCR扩增程序为：95℃持续5min，扩增循环步骤，72℃持续5min，4℃持续30min。
其中，扩增循环步骤的一个循环依次包括：95℃持续30s、50℃持续30s和72℃持续60s，可以根据需要设置扩增循环的次数。例如，扩增循环的次数为30次。
通过上述PCR反应，即能够制备得到preS-HA融合基因。
本实施例中，将第六PCR反应的产物跑胶，即可纯化得到纯度较高的preS-HA融合基因。
当然，在第一PCR反应、第二PCR反应、第三PCR反应、第四PCR反应、第五PCR反应及第六PCR反应中，可以将其PCR反应产物直接用来跑胶，纯化后得到目标产物后再进行下一步反应，也可以直接PCR反应产物直接用于下一步反应，只是使得后续的纯化步骤变得较为繁琐。
(2)、preS-HA-pCAGGS质粒的构建
本实施例中，将preS-HA融合基因插入质粒pCAGGS上，从而制得preS-HA-pCAGGS质粒。在反应中，将pCAGGS使用SacI和XmaI酶切，在将Fragment6连接在质粒pCAGGS上。其中，SacI的酶切位点为GAGCTC，XmaI的酶切位点为CCCGGG。
一实施例中，还对Fragment6使用SacI和XmaI酶切，其中，SacI的酶切位点为GAGCTC，XmaI的酶切位点为CCCGGG。
其中，pCAGGS的酶切操作的反应体系为：按50μl的体系计：pCAGGS溶液43μl、10×Buffer 5μl、SacI酶1μl和XmaI酶1μl。酶切操作的反应条件为：37℃酶切过夜。又如，过夜是指反应时间为4小时～18小时。待酶切操作之后得到pCAGGS酶切液，将pCAGGS酶切液65℃水浴20min，灭活内切酶SacI和XmaI，得到酶切后的pCAGGS。
其中，Fragment6的酶切操作的反应体系为：按50μl的体系计：Fragment6溶液43μl、10×Buffer 5μl、SacI酶1μl和XmaI酶1μl。酶切操作的反应条件为：37℃酶切过夜。又如，过夜是指4小时～18小时。待酶切操作之后得到Fragment6酶切液，将Fragment6酶切液65℃水浴20min，灭活内切酶SacI和XmaI，得到酶切后的Fragment6。
将酶切后的pCAGGS和酶切后的Fragment6进行连接操作，得到preS-HA-pCAGGS质粒。
其中，连接操作的反应体系为：10μl连接反应体系计：T4连接酶1μl，10×T4Buffer 1μl，酶切后的pCAGGS 1μl，酶切后的Fragment6或者融合基因preS-HA 7μl。连接操作的反应在37℃持续2h。
(3)、M1-pCAGGS质粒的构建
将流感病毒的基质蛋白M1序列插入pCAGGS空载，形成一个M1-pCAGGS质粒。其中，流感病毒的基质蛋白M1的碱基序列如SEQ ID NO.6所示，或者说，其由如SEQ ID NO.6所示的核苷酸所表达，M1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，为了增强对流感病毒颗粒的释放，本实施例中，将M1的第41位氨基酸突变成为了丙氨酸(Ala)，以增强对病毒性颗粒的释放，达到提高后续制备得到的preS VLP的产量的效果。其中，流感病毒的基质蛋白M1序列编码的基质蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
本实施例子中，质粒pCAGGS的酶切位点是SacI(GAGCTC)和XmaI(CCCGGG)。其中，流感病毒为A/sw/Spain/53207/04。
2、将质粒转染进入293T细胞
将质粒M1-pCAGGS和质粒preS-HA-pCAGGS共转染至293T细胞中共表达蛋白，这些蛋白可自组装成preS病毒样颗粒，即为preS VLP。
一实施例中，在共转染操作中，使用聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)转染法。
为了检测将质粒pCAGGS-M1和pCAGGS-preS-HA转染至293T细胞中后，preS VLP蛋白是否表达，采用如下方法：当将质粒pCAGGS-M1，pCAGGS-preS-HA，或两个质粒同时被转染至293T细胞后，细胞中的总RNA用QIAGEN RNeasy Mini Kit提取，来分析M1和preS-HA的转录情况。
3、制备preS多克隆抗体
为了检测preS VLP的表达，可以用preS多克隆抗体作为一抗，通过westernblotting进行检测。
首先，构建preS-PET28b质粒，将preS区域插入至PET28b质粒中，形成preS-PET28b质粒，将preS-PET28b质粒转染中大肠杆菌(E.Coli)中，使preS-PET28b质粒于E.Coli中表达preS蛋白。然后收集培养后的大肠杆菌，用buffer(50mM Tris-HCl,PH8.0,500mM NaCl)重悬，超声破菌，18000rpm离心30min，收集上清液，将上清液上样到Ni柱，使用buffer(50mMTris-HCl,PH8.0,500mM NaCl,500mM imidazole)洗脱，并收集100％洗脱峰，得到preS浓缩液，将preS浓缩液经阳离子交换柱和分子筛进一步纯化，得到纯度较高的preS。
preS-PET28b质粒的构建过程以及preS-PET28b质粒转染进大肠杆菌中表达的preS蛋白的具体纯化过程请参见文献(Lian M,Zhou X,Wei L,Qiu S,Zhou T,Li L,etal.Serum levels of preS antigen(HBpreSAg)in chronic hepatitis B virusinfected patients.Virol J 2007；4:93)。
将纯化的preS蛋白作为抗原，免疫新西兰白兔，经过3～4次免疫之后，使用抗原亲和纯化的方法获得针对preS蛋白的特异性多克隆抗体，即为preS多克隆抗体。
4、表达和纯化preS病毒样颗粒疫苗
将M1-pCAGGS质粒和preS-HA-pCAGGS质粒两个质粒使用聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)转染法转染入293T细胞。将转染后的293T细胞使用含有10％FBS(fetal bovine serum，胎牛血清)的DMEM培养基培养72小时后，将培养液4℃,5000rpm～6000rpm离心15min，去除细胞碎片，收集上清液。将上清液于4℃,22000rpm～25000rpm超速离心3个小时，得到沉淀，弃上清。将沉淀用buffer(1.5％Triton X-100,20mM Tris,150mMNaCl,2mM DTT,pH 7.5)重悬后得到重悬液，将重悬液上样到5％～50％蔗糖梯度离心管中，其中，该蔗糖梯度由buffer(20mM Tris,150mM NaCl,pH7.5)制备而成。将上样后的5％～50％蔗糖梯度离心管于40000rpm，4℃，离心6.5小时。收集PreS VLP所处梯度带，于4℃，33000rpm超速离心5小时去蔗糖，即得到纯化preS病毒样颗粒疫苗，即为preS VLP。然后采用Western blotting鉴定preS VLP。
其中，在转染后使用荧光免疫检验法检测M1-pCAGGS质粒和preS-HA-pCAGGS质粒是否转入293T细胞中，转染后，并将293T细胞培养48小时之后，使用4％的多聚甲醛(paraformaldehyde)固定细胞后，将细胞分成两组，第一组使用0.2％TritonX-100的通透剂处理5分钟，第二组不使用通透剂进行处理。将两组细胞使用含有5％羊血清的PBS封闭后，使用preS多克隆抗体对细胞进行4℃过夜孵化。孵化后，使用Alexa 488-Conjugated goat anti-rabbit secondary antibody对细胞第二次孵化，第二次孵化为在37℃的温度下孵化1小时。将经过第二次孵化后的细胞使用PBS清洗后，使用DAPI染色10分钟，之后将其上样到载玻片上进行荧光检测。使用Zeiss 510激光共聚焦显微镜100倍下随机取样观察。
其中，M1和preS-HA的表达进一步通过液相色谱、质谱联用(LC-MS/MS)来进行分析。将梯度离心后收集的含有M1基质蛋白和preS-HA嵌合蛋白的40％的蔗糖，将其进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，使用考马斯亮蓝R250进行染色，将考马斯亮蓝R250染色后的凝胶切掉，对切出的凝胶使用含有胰蛋白酶(Promega,enzyme:protein＝1:50(wt/wt))的碳酸氢铵缓冲液对其消化，消化温度37℃，消化时间为12小时，碳酸氢铵缓冲液的浓度为25mM。将经过胰蛋白酶消化后的样品重新溶解在含有2％乙腈和0.1％甲酸的溶液中，并将其上样到ChromXP C18(3μm,)中的奈米微粒捕集柱上，线上的分离和脱盐操作使用溶剂A在2μL/min的流速下持续10分钟，其中溶剂A包括体积比为98：2：0.1的水、乙腈和甲酸，溶剂B包括体积比为2：98：0.1的水、乙腈和甲酸。然后在分析柱(75μm x 15cm C18-3μmChromXPEksigent)使用5-35％的乙腈(含有0.1％的甲酸)梯度洗脱60分钟，之后将洗脱液使用液相色谱、质谱联用(LC-MS/MS)进行分析，液相色谱、质谱联用(LC-MS/MS)分析系统使用Triple TOF 5600System(AB SCIEX,Concord,ON)装有Nanospray III source(ABSCIEX,Concord,ON)。数据的获得通过使用2.5kV的离子喷涂电压、30PSI的气帘气、5PSI的雾化气体及界面加热温度到150℃而获得。MS中使用质谱扫描操作，使用IDA在250毫秒获得扫描数据，在90毫秒的离子扫描下收集多达25个产物，收集的条件为超过150个/秒计数阈值以及在+2到+4的充电状态下。动碰撞能量设置适用于所有前体离子碰撞诱导的解离，动态排除被设定为1/2峰宽(～12s)，数据分析中，文件通过ProteinPilot 5处理。搜索是针对本地数据库包括M1和preS-HA嵌合蛋白序列下进行，使用默认设置。最终获得M1和preS-HA的氨基酸序列。
4、透射电子显微镜观察preS VLP超微结构
将400目碳膜铜网于纯化的preS VLP溶液中漂浮浸泡2分钟，铜网用buffer(20mMTris,pH 7.4,120mM KCl)清洗，用1％磷钨酸负染色，染色数分钟后，用滤纸吸干染液，在透射电子显微镜下观察preS VLP的超微结构。从图5及图7D可以证实，PreS VLP为包含一个球形的包膜颗粒，在颗粒外缘有刺突样结构。这表明了乙肝重组抗原被成功嵌合于流感病毒基质蛋白的表面，即，成功将preS-HA嵌合蛋白包装在VLP的表面，以使其有更多被展示的表面积，以使其进入机体后以带来更强烈的免疫反应。
5、疫苗接种实验
将上述制备得到的preS VLP用于小鼠实验。
其目的是通过检测中和抗体水平以及细胞内免疫反应来评估preS VLP疫苗的免疫原性。
将6到8周雌性Balb/c小鼠随机分为5组，每组6只小鼠。即，空白对照一组，肌注preS蛋白+佐剂一组，肌注preS蛋白一组，肌注preS VLP+佐剂一组和肌注preS VLP一组。其中，preS蛋白为preS-PET28b质粒转染进大肠杆菌所表达。
各小组分别于第0天、22天，给各小组的老鼠后肢肌内注射，空白对照组小鼠于后肢肌内注射100μl PBS，其他小组在加与不加氢氧化铝佐剂情况下，分别于后肢肌内注射10μg preS蛋白、10μg preS VLP疫苗。
分别于第30天、第52天、第70天、第90天、第112天采血，用于测定中和抗体滴度。
第67天时，各组取一只小鼠将小鼠处死，取脾脏分离淋巴细胞用于评价淋巴细胞增殖反应。取每组小鼠未分离的脾细胞悬浮液，调整细胞数为(1～2)×106/mL，加入96孔培养板中，(1～2)×105细胞/100μl/孔，每组设3孔。于37℃与HBV preS抗原(5μg/mL)孵育4天，每孔加入氚标记胸腺嘧啶核苷([3H]-胸苷)继续培养12小时。根据氚标记胸腺嘧啶核苷的渗入率测定T细胞增殖水平。试验结果以刺激指数(stimulation index，SI)表示。
第70天时，通过水动力注射1.3拷贝乙肝病毒基因组的质粒(10μg)来制备乙肝病毒复制模型，第77天，收集肝组织用于检测乙肝RNA或免疫组织化学染色或分析T细胞反应。并分别于第70、72、74和77天，采血制备血清样品，用于检测HBsAg、HBeAg、HBcAg以及anti-preS中和抗体。
(1)、ELISA法测定小鼠血清中的抗体滴度
采用ELISA法测定血清的抗体滴度。血清为疫苗接种实验中所采集的血液中的血清。
取200μl血清样品，适当稀释，分别加到含有preS多克隆抗体的磁珠的各个孔中。室温孵育18小时后，超纯水清洗磁珠除去未结合的抗体。磁珠与biotin-tagged preS和peroxidase-conjugated rabbit anti-biotin于40℃水浴孵育2小时。清洗，磁珠被转移到各个试验管中，将300μl o-phenylenediamine·2HCl加入到各个管中。室温孵育30分钟，加入1ml 1M H2SO4终止反应，于492nm:600nm双波长检测吸光度。图8A至图8D可以证实，preSVLP具有更高的免疫原性，即使preS VLP没有使用任何佐剂。
(2)、ELISPOT法测定T细胞反应
CD4+和CD8+T细胞反应通过干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素2(IL-2)等细胞因子染色试验来评估。使用小鼠淋巴细胞分离液从脾脏中分离得到淋巴细胞。
通过酶联免疫斑点试验(ELISPOT试验)测定小鼠IFN-γ分泌性T细胞、TNF-α分泌性T细胞和IL-2分泌性T细胞的数量。图9A至图9D可以证实，preS VLP可以引起很强的具有清除乙肝病毒作用的preS-特异性CD8+T细胞。
(3)、淋巴细胞增殖试验
淋巴细胞增殖和分化是机体免疫应答过程的一个重要阶段。检测淋巴细胞增殖水平可以评估免疫小鼠后，小鼠免疫功能的变化。取每组小鼠未分离的脾细胞悬浮液，调整细胞数为1～2×106个/mL，加入96孔培养板中，1～2×105细胞/100μl/孔，每组设3孔。于37℃与HBV preS抗原(5μg/mL)孵育4天，每孔加入氚标记胸腺嘧啶核苷([3H]-胸苷)继续培养12小时。根据氚标记胸腺嘧啶核苷的渗入率测定T细胞增殖水平。试验结果以刺激指数(stimulation index，SI)表示。图11A至图11F的实验结果可以证实，preS VLP的保护效果与记忆T细胞反应相关，表明preS VLP能够引起很强的anti-preS中和抗体和preS-特异性T细胞反应，可以起到预防感染的作用，有潜力转化到医学上成为一种新颖的预防性或治疗性乙肝疫苗。
6、治疗性疫苗接种试验
为了进一步探讨preS VLP是否可以成为一种治疗性疫苗，对HBV感染小鼠模型进行疫苗接种试验。
雌性，6～8周，C57BL/6小鼠，于小鼠尾静脉水动力注射10μg pAAV/HBV1.2plasmid DNA(包含HBV全长基因组DNA)可制备HBV感染模型。
第3天、5天和7天，空白对照组小鼠于后肢肌内注射100μl PBS，其他小组在加与不加氢氧化铝佐剂情况下，分别于后肢肌内注射10μg preS蛋白、10μg preS VLP疫苗。即，空白对照一组，肌注preS蛋白+佐剂一组，肌注preS蛋白一组，肌注preS VLP+佐剂一组和肌注preS VLP一组。例如，给各小组注射的时间为第3天、5天和7天。
分别于第10天和17天采血，测定Anti-preS，Anti-HBsAg，谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)，HBeAg，HBsAg和HBV DNA。第17天，将小鼠处死，取脾脏，分离淋巴细胞，分别用于测定T细胞反应和淋巴细胞增殖反应。第17天，取小鼠肝脏，用于检测HBcAg+肝细胞的百分率。
试验结果说明如下。
请参阅图3A，其为质粒构建后的SDS-PAGE鉴定结果，成功构建preS-HA-pCAGGS质粒、Flu M1-pCAGGS质粒和preS-pET28b质粒。
请参阅图3B，其为preS-pET28b质粒转染进大肠杆菌后表达并纯化得到的preS蛋白的SDS-PAGE鉴定结果，可以看出，成功纯化得到preS蛋白。该preS蛋白为preS-pET28b质粒转染如大肠杆菌中，表达并纯化得到preS蛋白。
请参阅图3C，其为preS多克隆抗体SDS-PAGE鉴定结果，成功制备preS多克隆抗体。抗体纯化后纯度在95％以上。
请参阅图4，其为preS VLP的western blotting鉴定结果。由此可见，成功表达和纯化preS VLP。
请参阅图5，其为preS VLP透射电子显微镜分析结果。结果显示，PreS VLP为包含一个球形的包膜颗粒，在颗粒外缘有刺突样结构。这表明了乙肝重组抗原被成功嵌合于流感病毒基质蛋白的表面，即，成功将preS-HA嵌合蛋白包装在VLP的表面，以使其有更多被展示的表面积，以使其进入机体后以带来更强烈的免疫反应。
其参阅图6A、图6B及图6C，其中的结果为preS VLP的构建与表达的验证结果。
例如，本实施例设计了preS病毒样颗粒(preS VLP)，即流感病毒的基质蛋白M1和血凝素HA的跨膜区与胞内区形成纳米颗粒骨架，与HA融合的乙肝病毒preS抗原被展示在纳米颗粒的表面。HA的信号肽被加到preS序列的N端，该信号肽在嵌合蛋白表达时被移除了。此外，通过将M1蛋白的第41位脯氨酸被突变成丙氨酸，以增强病毒样颗粒的释放。当pCAGGS-M1质粒，pCAGGS-preS-HA质粒，或两个质粒同时被转染至293T细胞，细胞中的总RNA用QIAGEN RNeasy Mini Kit提取，来分析M1和preS-HA的转录情况。请参阅图6A，qPCR结果表明转染48小时后，M1和preS-HA基因均有发生转录。请一并参阅图6B和图6C，其为细胞免疫荧光染色实验结果图，当共转染两个pCAGGS质粒至293T细胞，即将preS-HA-pCAGGS质粒和M1-pCAGGS质粒共转染至293T细胞时，通过细胞免疫荧光染色实验可检测到细胞膜上preS抗原的表达。在图6B中，293T细胞被pCAGGS-M1质粒转染，或者被pCAGGS-preS-HA质粒转染,或被pCAGGS-M1质粒和pCAGGS-preS-HA质粒同时转染后，细胞没有经过通透化处理，细胞核用DAPI染色，preS抗原用anti-preS sera反应，再用Alexa488-Conjugatedgoat anti-rabbit secondary antibody检测preS抗原的表达情况。图6C中的细胞与图6B中细胞处理步骤的一致，除了细胞在染色前用Triton X-100进行通透化处理。需要说明的是，图6B、图6C中颜色较深的对应发蓝光，即黑色对应蓝光，图6B、图6C中颜色较浅的对应绿光，即灰色对应绿光。
从图6B及图6C可以看出，只使用anti-preS时，只有preS-HA和M1蛋白共表达时，preS才能被展示在细胞膜外。而在使用Triton X-100进行通透化处理后，可以见到细胞内也大量表达出了preS-HA嵌合蛋白。这与preS-HA嵌合蛋白/preS-HA嵌合蛋白的构建一致，因为HA的跨膜区使preS-HA嵌合蛋白维持在细胞膜上。当M1蛋白没有共表达时，preS-HA嵌合蛋白不能将preS抗原展示在细胞膜外，因为用Triton X-100进行透膜化处理后检测不到preS的表达。同时从图6A中的Western blot实验也证明了293T细胞中preS-HA的表达。并且，从图6B及6C可以看出，只有当M1共表达时，才能检测到上清中preS-HA的存在，这表明M1对于preS-HA从293T细胞中分泌出去是必需的。也就是说，通过将pCAGGS-M1质粒和pCAGGS-preS-HA质粒共转染于293T细胞中后，M1的表达可以促使preS-HA嵌合蛋白被分泌至细胞外，在培养293T细胞的上清液中即可检测到preS-HA嵌合蛋白。
请一并参阅图7A、图7B、图7C、图7D及图7E，其为preS VLP的纯化和特征的鉴定结果。
293T细胞被转染pCAGGS-M1和pCAGGS-preS-HA，将转染后的293T细胞培养72小时后，收集培养基，低速离心去除细胞沉淀，取上清，高速离心浓缩得到病毒样颗粒沉淀，将病毒样颗粒沉淀用PBS重悬，上样至20-60％的蔗糖密度梯度溶液，于beckman SW41Ti转子，30000rpm，4℃，离心3小时。然后收集40％蔗糖液组分。
其中，图7A为Western blot分析质粒转染后的细胞沉淀和上清中preS-HA的表达情况，可以看出pCAGGS-M1和pCAGGS-preS-HA在上清液中都有检测出。图7B为SDS-PAGE分析蔗糖密度梯度离心法所得各个组分样品，可以看出，主要的蛋白组分在40％蔗糖液中。图7C为Western blot分析结果显示，左边第一列是大肠杆菌中表达的preS蛋白，第二列和第三列是蔗糖液组分中的preS-HA。图7D为电镜结果展示preS病毒样颗粒(preS VLP)，放大倍数为11,000×，其中的黑点即为preS病毒样颗粒，黑点较大的为多个preS病毒样颗粒聚集下的影像。图7E为LC-MS/MS鉴定40％蔗糖液中的M1和preS-HA，得出的M1序列和preS-HA序列，其中，多肽可信度:gray,no match；red,>0and<50％；yellow,>＝50％and<95％；green,>＝95％。需要说明的是，图7E中鉴定出的序列未划线部分对应gray，一条下划线部分对应red，两条下划线部分对应yellow，三条下划线部分对应green。
将40％蔗糖液组分进行分析。从图7B及图7C可以看出，通过SDS-PAGE和westernblot实验，检测到preS-HA嵌合蛋白的表达。从图7D可以看出，负染色电镜结果显示样品中含有病毒样颗粒。样品进一步通过LC-MS/MS进行检测。从图7E可以看出，质谱鉴定到的M1序列占其全长序列的90％以上。然而，只鉴定到2个高可信度的(>＝95％)preS-HA肽段，这可能是因为preS发生了糖基化修饰。上述数据表明包含M1和preS-HA的病毒样颗粒被成功纯化得到。
请一并参阅图8A至图8D、图9A至图9D，其为免疫preS VLP的实验结果。
请一并参阅图8A、图8B、图8C及图8D，将采集小鼠血制备到的血清样品，所有血清被稀释100倍，并通过ELISA法检测anti-preS抗体滴度。ELISA板用1μg/mL preS VLP包被用于检测30天免疫反应的总IgG。ELISA板用5μg/mL重组preS包被用于检测30天及90天的总IgG、IgG1及IgG2a。从图8A及图8B可以看出，相比于重组preS蛋白，preS VLP能够促进机体产生更多的总IgG。从图8C可以看出，相比于重组preS蛋白，preS VLP能够促进机体产生更多的总IgG1。从图8D可以看出，相比于重组preS蛋白，preS VLP能够促进机体产生更多的总IgG2a。实验数据表明相比于重组preS蛋白，preS VLP具有更高的免疫原性，即使preS VLP没有使用任何佐剂。尤其是，preS VLP引起很高水平的总IgG包括anti-preS IgG1(Th2isotype)和IgG2a(Th1isotype)。
请参阅图9A、图9B、图9C及图9D，T细胞反应在诱导体液免疫中扮演重要角色，同时对治疗性乙肝疫苗也是起着不可或缺的作用。为了评估preS-特异性T细胞反应的产生，第67天时，各组取一只小鼠并将其杀死，小鼠脾淋巴细胞被分离和培养。用preS-特异性T细胞表位多肽(请参阅表1)刺激6小时后，T细胞被用来分析CD4,CD8和INF-γ的表达情况。从图9A、图9B、图9C及图9D可以看出，在免疫preS VLP的小鼠中,CD4+和CD8+T细胞的水平比免疫重组preS蛋白的高。CD8+T细胞或CD4+T细胞的数量与INF-γ+CD8+T细胞或INF-γ+CD4+T细胞的数量一致。INF-γ的分泌，通常被认为是控制和清除乙肝病毒复制的关键，INF-γ的分泌用ELISPOT法分析。结果显示，当小鼠被免疫preS VLP时，preS-特异性INF-γ的表达量更高(图9E)。这表明preS VLP可以引起很强的具有清除乙肝病毒作用的preS-特异性CD8+T细胞。
表1
Epitope Residues Amino acid sequence
1 preS1 10-19 PLGFFPDHQL
2 preS1 41-56 WPAANQVGVGAFGPGL
3 preS2 109-134 MQWNSTAFHQALQDPRVRGLYLPAGG
同时，这也说明，preS-HA嵌合蛋白或者preS VLP能够引起较为强烈的细胞免疫反应，既能作为疫苗，同时，也能应用在细胞免疫治疗之中，即，将preS-HA融合基因、preS-HA嵌合蛋白或者preS VLP用作刺激T细胞从初始T细胞开始特异性分化并成熟的刺激物。考虑到近年来较为盛行的DNA疫苗，因此，preS-HA融合基因也有作为基因疫苗的潜力。
请参考图10A至图10H，其中的结果可以证实，免疫preS VLP可以起到预防保护和治疗的作用。
第70天时，通过水动力注射1.3拷贝乙肝病毒基因组的质粒(10μg)来制备乙肝病毒复制模型。第77天，收集肝组织用于检测乙肝RNA或免疫组织化学染色或分析T细胞反应。HBV RNA拷贝数用qPCR法检测，从图10A可以看出，免疫preS VLP的小鼠中HBV RNA的水平比免疫重组preS蛋白的明显低很多。通过进一步的染乙肝核心抗原的肝组织切片的实验结构表明，请一并参阅图10B、图10C、图10D及图10E，免疫preS VLP的小鼠中HBcAg阳性的肝细胞几乎被清除干净，而免疫重组preS蛋白的小鼠中HBcAg阳性的肝细胞仍然数量较多。第70，72，74和77天，采血制备血清样品。从图10F可以看出，HBsAg水平在preS VLP免疫小鼠中几乎检测不到，而免疫重组preS蛋白小鼠的在第74天上升到较高水平。从图10G可以看出，HBeAg水平在preS VLP免疫小鼠中也是几乎检测不到，而免疫重组preS小鼠的在第74天先稍微上升然后再降低。从图10H可以看出，HBsAg和HBeAg的清除与anti-preS中和抗体的产生相一致。因此，免疫preS VLP可以控制和清除乙肝病毒的复制。
请参考图11A至图11F，从图中的结果可以证实，preS VLP的保护效果与记忆T细胞反应相关。
既然CD8T细胞反应在乙肝病毒的清除过程中扮演重要角色，T细胞记忆反应用流式细胞术进行检测。从图11A、图11B、图11C及图11D可以看出，免疫preS VLP小鼠中，CD8+T细胞和CD4+T细胞的数量明显高于对照组和免疫重组preS蛋白组，INF-γ+CD8+T细胞或INF-γ+CD4+T细胞的数量也同样较高。值得注意的是，免疫preS VLP小鼠中CD8+T细胞的数量明显高于免疫preS组，揭示preS VLP可以激活具有清除病毒作用的记忆T细胞。此外，小鼠脾淋巴细胞(图11E)和肝淋巴细胞(图11F)中的T细胞记忆反应也通过IFN-γELISPOT实验来检测。从图11E及图11F可以看出，免疫preS VLP小鼠中preS-特异性T细胞反应明显强于免疫重组preS组，表明preS-特异性T细胞介导感染肝细胞中乙肝病毒的清除。总而言之，preSVLP引起很强的anti-preS中和抗体和preS-特异性T细胞反应，可以起到预防感染的作用，有潜力转化到医学上成为一种新颖的预防性或治疗性乙肝疫苗。
通过实施例1可以看出，本发明所提供的preS-HA融合基因能够在预防或治疗乙肝的疫苗或者药物中应用。
通过实施例1中的细胞免疫荧光染色实验可以证实，本发明所提供的preS-HA融合基因能够被转入宿主细胞中表达。并且结合对照组中的重组preS实验，可以证实本发明所提供的preS-HA融合基因所表达的嵌合蛋白相对于对比组，能够清除和控制乙肝病毒。
通过实施例1的小鼠实验也可以推导出，preS-HA融合基因(乙肝重组抗原表达基因)、preS-HA嵌合蛋白(乙肝重组抗原)及preS VLP(乙肝重组抗原病毒样颗粒)有潜力应用于预防、控制或清除乙肝病毒中。
因此，本发明所提供的preS-HA融合基因和蛋白，能够对乙肝病毒起到预防感染和清除的作用，还能够对接种HBsAg疫苗后不能产生抗体产生免疫应答，有潜力转化到医学上成为一种新颖的预防性和治疗性乙肝疫苗。同时，基于小鼠实验的注射剂量，可以推导出preS VLP(乙肝重组抗原病毒样颗粒)的有效量为10微克。又或者说，以六周龄的小鼠体重约计20～30克计算，将上述10微克除以体重，可以推导出有效量为0.0000001～0.5微克/g体重。这样，有望提供一种乙肝防治的疫苗组合物疫苗，包括有效量的如上preS VLP。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京大学深圳研究生院
<120> 乙肝重组抗原及其表达基因、构建方法、病毒样颗粒及其制备方法、应用与
疫苗
<130> 乙肝重组抗原及其表达基因、构建方法、病毒样颗粒及其制备方法、应用与
疫苗
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 678
<212> DNA
<213> 乙肝病毒、流感病毒
<400> 1
atggaagcaa aattgtttgt attattctgt gcattcactg cactgaaagc tatggggacg 60
aatctttctg ttcccaaccc tctgggattc tttcccgatc atcagttgga ccctgcattc 120
ggagccaact caaacaatcc agattgggac ttcaacccca tcaaggacca ctggccagca 180
gccaaccagg taggagtagg agcattcggg ccagggctca cccctccaca cggcggtatt 240
ttggggtgga gccctcaggc tcagggcata ttgaccacag tgtcaacaat tcctcctcct 300
gcctccacca atcggcagtc aggaaggcag cctactccca tctctccacc tctaagagac 360
agtcatcctc aggccatgca gtggaattcc actgccttcc accaagctct gcaggatccc 420
agagtcaggg gtctgtatct tcctgctggt ggctccagtt caggaacagt aaaccctgct 480
ccgaatattg cctctcacat ctcgtcaatc tccgcgagga ctggggaccc tgtgacgaac 540
aaactagaat cagtgggagt tcatcagatt ttggcgatct actccacagt cgccagttcc 600
ctggtattgc tagtctccct gggggcaatc agcttctgga tgtgctctaa tgggtcattg 660
caatgcagaa tatgcatt 678
<210> 2
<211> 226
<212> PRT
<213> 乙肝病毒，流感病毒
<400> 2
Met Glu Ala Lys Leu Phe Val Leu Phe Cys Ala Phe Thr Ala Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro
20 25 30
Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp
35 40 45
Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val
50 55 60
Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile
65 70 75 80
Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr
85 90 95
Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr
100 105 110
Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp
115 120 125
Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly
130 135 140
Leu Tyr Leu Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala
145 150 155 160
Pro Asn Ile Ala Ser His Ile Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp
165 170 175
Pro Val Thr Asn Lys Leu Glu Ser Val Gly Val His Gln Ile Leu Ala
180 185 190
Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Gly
195 200 205
Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile
210 215 220
Cys Ile
225
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 流感病毒
<400> 3
atggaagcaa aattgtttgt attattctgt gcattcactg cactgaaagc t 51
<210> 4
<211> 138
<212> DNA
<213> 流感病毒
<400> 4
aaactagaat cagtgggagt tcatcagatt ttggcgatct actccacagt cgccagttcc 60
ctggtattgc tagtctccct gggggcaatc agcttctgga tgtgctctaa tgggtcattg 120
caatgcagaa tatgcatt 138
<210> 5
<211> 489
<212> DNA
<213> 乙肝病毒
<400> 5
atggggacga atctttctgt tcccaaccct ctgggattct ttcccgatca tcagttggac 60
cctgcattcg gagccaactc aaacaatcca gattgggact tcaaccccat caaggaccac 120
tggccagcag ccaaccaggt aggagtagga gcattcgggc cagggctcac ccctccacac 180
ggcggtattt tggggtggag ccctcaggct cagggcatat tgaccacagt gtcaacaatt 240
cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggaaggcagc ctactcccat ctctccacct 300
ctaagagaca gtcatcctca ggccatgcag tggaattcca ctgccttcca ccaagctctg 360
caggatccca gagtcagggg tctgtatctt cctgctggtg gctccagttc aggaacagta 420
aaccctgctc cgaatattgc ctctcacatc tcgtcaatct ccgcgaggac tggggaccct 480
gtgacgaac 489
<210> 6
<211> 759
<212> DNA
<213> 流感病毒
<400> 6
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctttcta tcatcccgtc gggccccctc 60
aaagccgaga tcgcgcagag actggaaggt gtttttgcag ggaagaacac agatcttgag 120
gctctcatgg agtggctaaa gacaagaccg atcctgtcac ctctgactaa gggaattctg 180
ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtt 240
caaaatgctc taaacggaaa tggggaccct aataacatgg atagagcagt caaattatac 300
aagaagctaa aaagggaaat aacattccat ggggccaagg aagtgtcact aagctactca 360
actggtgctc ttgccagttg catgggcctc atatacaata gaatgggaac agtgaccaca 420
gaagctgctt ttggcctagt gtgtgccact tgtgagcaga tcgctgattc acagcatcgg 480
tcacacagac aaatggctac taccaccaac ccactaatca ggcatgaaaa cagaatggta 540
ctggctagca ctactgctaa ggctatggaa cagatggctg gatcgagtga acaggcagca 600
gaggccatgg aggttgcaag tcagactagg cagatggtgc atgcaatgag aacaattggg 660
acacatccca gctccagtgc cggtctgaaa gatgaccttc ttgaaaattt gcaggcctac 720
cagaaacgga tgggagtgca gatgcaacgg ttcaagtga 759
<210> 7
<211> 566
<212> PRT
<213> 流感病毒
<400> 7
Met Glu Ala Lys Leu Phe Val Leu Phe Cys Ala Phe Thr Ala Leu Lys
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Val Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Ile Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asn Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Asn Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Asn Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly
65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Asp Leu Leu Leu Thr Ala Asn Ser Trp Ser Tyr Ile
85 90 95
Ile Glu Thr Ser Asn Ser Lys Asn Gly Ala Cys Tyr Pro Gly Glu Phe
100 105 110
Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Thr Val Ser Ser Phe
115 120 125
Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Ala Thr Ser Trp Pro Asn His Glu
130 135 140
Thr Thr Lys Gly Thr Thr Val Ala Cys Ser His Ser Gly Ala Asn Ser
145 150 155 160
Phe Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Ile Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro
165 170 175
Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Asn Lys Gly Lys Glu Val Leu Val
180 185 190
Ile Trp Gly Val His His Pro Pro Thr Asp Ser Asn Gln Gln Thr Leu
195 200 205
Tyr Gln Asn Asn His Thr Tyr Val Ser Val Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr
210 215 220
Gln Arg Phe Thr Pro Glu Ile Val Ala Arg Pro Lys Val Arg Glu Gln
225 230 235 240
Ala Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Asp Gln Gly Asp Thr
245 250 255
Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp His Ala Phe
260 265 270
Ala Leu Asn Lys Gly Ser Ser Ser Gly Ile Met Met Ser Asp Ala His
275 280 285
Val His Asn Cys Thr Thr Lys Cys Gln Thr Pro His Gly Ala Leu Lys
290 295 300
Ser Asn Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Ile Thr Ile Gly Glu Cys
305 310 315 320
Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Gln Leu Arg Met Ala Thr Gly Leu Arg
325 330 335
Asn Ile Pro Ser Thr Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly
340 345 350
Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr
355 360 365
His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser
370 375 380
Thr Gln Ile Ala Ile Asp Gly Ile Ser Asn Lys Val Asn Ser Val Ile
385 390 395 400
Glu Lys Met Asn Ile Gln Phe Thr Ser Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn
405 410 415
Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe
420 425 430
Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Ile Leu Leu Glu Asn
435 440 445
Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Phe Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu
450 455 460
Lys Val Lys Ser Gln Leu Arg Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly
465 470 475 480
Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val
485 490 495
Lys Asn Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Arg Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu
500 505 510
Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Val Gly Val His
515 520 525
Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu
530 535 540
Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu
545 550 555 560
Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565
<210> 8
<211> 1701
<212> DNA
<213> 流感病毒
<400> 8
atggaagcaa aattgtttgt attattctgt gcattcactg cactgaaagc tgacaccatt 60
tgtgtaggct atcatgctaa caattccaca gacactgtcg acacaatact ggagaagaat 120
gtgactgtta cccattcagt taatttacta gaaaacagcc acaatggaaa actctgcagc 180
ctgaatggaa aagccccctt acaactgggg aactgcaacg tagcaggatg gatccttggc 240
aacccagaat gtgacttgct gctcacagcg aattcgtggt cttacataat agagacttca 300
aattcaaaaa atggagcatg ctatcctgga gaattcgctg attatgagga attaagggag 360
cagctgagta cagtttcttc atttgaaaga tttgaaattt tcccaaaagc aacctcatgg 420
ccaaatcatg agacaaccaa aggtaccaca gttgcatgct cccactctgg agccaacagt 480
ttttatcgga acttgctatg gatagtaaaa aagggaaact cctatcctaa gctcagcaag 540
tcatacacaa acaacaaagg aaaagaagtg cttgtaatct ggggagtgca tcaccctccg 600
actgacagta atcaacaaac cctctaccag aataatcaca catatgtttc agttggatca 660
tcaaaatact accaaaggtt cacaccagaa atagtagcca gacctaaagt cagagagcaa 720
gcgggcagaa tgaattatta ttggacacta ttagatcaag gagacaccat aacctttgaa 780
gccacgggga atttaatagc accatggcat gcatttgcat tgaataaggg ctctagttct 840
ggaattatga tgtcggatgc tcatgttcac aattgcacta caaagtgcca aactcctcat 900
ggggctttga aaagcaatct tccttttcag aatgtacatc ccatcactat tggagaatgc 960
cccaaatatg ttaaaagcac ccaactaaga atggcaacag gattaaggaa tatcccctct 1020
acccaatcca gaggactttt tggggcaatt gccggattca ttgaaggagg atggacagga 1080
atgatagatg gatggtatgg atatcaccat caaaatgagc agggatctgg ttacgcagca 1140
gatcagaaaa gtacacaaat cgcaattgat gggatcagca acaaagtaaa ctcagtaatt 1200
gaaaaaatga acattcaatt tacttcagtg ggcaaggagt tcaataatct agagaaaagg 1260
attgagaatt tgaataaaaa ggtcgatgat ggatttttgg atgtatggac atataacgct 1320
gagttactca ttttgctcga gaacgaaaga accctagatt tccatgactt taacgtgaaa 1380
aatttatatg aaaaggtcaa atcacaactg agaaacaatg ccaaggaaat cggtaatggc 1440
tgttttgagt tctatcacaa atgtgataat gaatgcatgg aaagcgtaaa gaatggcaca 1500
tataattatc ccagatattc agaagaatcc aaattgaata gagaggaaat agacggggtg 1560
aaactagaat cagtgggagt tcatcagatt ttggcgatct actccacagt cgccagttcc 1620
ctggtattgc tagtctccct gggggcaatc agcttctgga tgtgctctaa tgggtcattg 1680
caatgcagaa tatgcattta a 1701
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 流感病毒
<400> 9
Met Glu Ala Lys Leu Phe Val Leu Phe Cys Ala Phe Thr Ala Leu Lys
1 5 10 15
Ala
<210> 10
<211> 46
<212> PRT
<213> 流感病毒
<400> 10
Lys Leu Glu Ser Val Gly Val His Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr
1 5 10 15
Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe
20 25 30
Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
35 40 45
<210> 11
<211> 163
<212> PRT
<213> 乙肝病毒
<400> 11
Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp
1 5 10 15
His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp
20 25 30
Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly
35 40 45
Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu
50 55 60
Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile
65 70 75 80
Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro
85 90 95
Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn
100 105 110
Ser Thr Ala Phe His Gln Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu
115 120 125
Tyr Leu Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro
130 135 140
Asn Ile Ala Ser His Ile Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro
145 150 155 160
Val Thr Asn
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cgagctcatg gaagcaaaat tgt 23
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tcgtccccat agctttcagt 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
actgaaagct atggggacg 19
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
attctagttt gttcgtcac 19
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tgtgacgaac aaactagaat 20
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tccccccggg ttaaatgcat attctg 26
<210> 18
<211> 252
<212> PRT
<213> 流感病毒
<400> 18
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Ile Pro
1 5 10 15
Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Gly Val Phe
20 25 30
Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Ala Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr
35 40 45
Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe
50 55 60
Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val
65 70 75 80
Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Arg Ala
85 90 95
Val Lys Leu Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala
100 105 110
Lys Glu Val Ser Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met
115 120 125
Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Thr Val Thr Thr Glu Ala Ala Phe
130 135 140
Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg
145 150 155 160
Ser His Arg Gln Met Ala Thr Thr Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu
165 170 175
Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met
180 185 190
Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala Ser Gln
195 200 205
Thr Arg Gln Met Val His Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Ser
210 215 220
Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asp Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr
225 230 235 240
Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys
245 250

Claims (12)

1.一种乙肝重组抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种乙肝重组抗原的表达基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种乙肝重组抗原表达基因的构建方法，其特征在于，包括：
将乙型肝炎病毒的preS序列分别与流感病毒血凝素的信号肽区，以及流感病毒血凝素的跨膜区和胞内区相连接，得到所述乙肝重组抗原表达基因；
其中，所述流感病毒血凝素信号肽区的碱基序列如SEQ ID NO.3所示；
其中，所述流感病毒血凝素的跨膜区和胞内区的碱基序列如SEQ ID NO.4所示；
其中，所述乙型肝炎病毒的preS区域的碱基序列如SEQ ID NO.5所示；
其中，所述乙肝重组抗原表达基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
4.一种乙肝重组抗原病毒样颗粒，其特征在于，由乙肝重组抗原和流感病毒基质蛋白M1组成，所述乙肝重组抗原的表达基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述流感病毒基质蛋白M1的表达基因的碱基序列如SEQ ID NO.6所示。
5.一种乙肝重组抗原病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括：
将流感病毒的基质蛋白M1的表达基因的碱基序列插入第一表达载体，得到M1-表达载体质粒，其中，流感病毒的基质蛋白M1的表达基因的碱基序列如SEQ ID NO.6所示；
将如权利要求2所述的乙肝重组抗原的表达基因插入第二表达载体，得到preS-HA-表达载体质粒；
将所述preS-HA-表达载体质粒和所述M1-表达载体质粒共同转染至宿主细胞中，培养转染后的所述宿主细胞，产生乙肝重组抗原病毒样颗粒。
6.根据权利要求1所述的乙肝重组抗原在制备乙肝防治药物的 用途。
7.根据权利要求1所述的乙肝重组抗原在制备乙肝疫苗中的用途。
8.根据权利要求2所述的乙肝重组抗原的表达基因在制备乙肝防治药物中的用途。
9.根据权利要求2所述的乙肝重组抗原的表达基因在制备乙肝疫苗中的用途。
10.根据权利要求4所述乙肝重组抗原病毒样颗粒在制备乙肝防治药物中的用途。
11.根据权利要求4所述乙肝重组抗原病毒样颗粒在制备乙肝疫苗中的用途。
12.一种乙肝防治的疫苗，其特征在于，包括如权利要求4所述乙肝重组抗原病毒样颗粒。
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