CN106924141B - 一种应用于美白领域的菠萝叶提取物的制备方法 - Google Patents

一种应用于美白领域的菠萝叶提取物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种应用于美白领域的菠萝叶提取物的制备方法，本发明提供一种菠萝叶提取物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)取干燥菠萝叶，粉碎后，加入溶剂中，于40‑50℃条件下浸泡提取2‑4次，每次提取时间为6‑8小时，菠萝叶与溶剂的质量体积比(kg/L)为1：5‑20；(2)将步骤(1)中每次浸泡提取得到的浸提液合并，得到提取液，过滤除去固体残渣，得滤液；(3)步骤(2)中得到的滤液经减压浓缩除去有机溶剂后，加入水使其分散，接着用石油醚萃取2‑4次；(4)将步骤(3)萃取后的石油醚相进行合并，减压浓缩后，干燥得所述菠萝叶提取物。

Description

一种应用于美白领域的菠萝叶提取物的制备方法
技术领域
本发明属于天然提取领域，具体涉及一种菠萝叶醇提取物的乙醚萃取物及其制备方法与抑制酪氨酸酶的用途。
背景技术
黑色素(melanin)主要由人体的黑色素细胞产生，它能减少紫外线对皮肤的伤害；然而黑色素的异常蓄积会造成色素沉着过度，容易引起雀斑、老年斑、黑斑病等。研究者发现酪氨酸酶在黑色素的生物合成过程中有重大作用。在黑色素生物合成过程中，酪氨酸酶起着十分重要的催化作用。酪氨酸酶能够促进L-酪氨酸转化为L-多巴，L-多巴又经过氧化而转化为多巴醌，多巴醌多聚生成黑色素。目前主要通过以下两个途径达到抑制生成的黑色素：一个是阻止黑色素的生成(抑制酪氨酸酶的活性)；另一途径是促使已生成的色素排出体外。其中，前者效果较好，是目前研究的重点。
菠萝叶具有很高的综合开发价值，已有文献报道，从叶片中提取的纤维，是一种优异的天然抗菌纺织原料；提取纤维后的叶的渣还可以开发饲料、沼气和有机肥，实现综合利用。但目前尚未有关于其抑制酪氨酸酶活性的报道，其有望作为美白剂应用与美白化妆品领域。
发明内容
本发明提供一种菠萝叶提取物，其特征在于所述菠萝叶提取物由如下方法制备，所述方法包括如下步骤：
(1)取干燥菠萝叶，粉碎后，加入溶剂中，于40-50℃条件下浸泡提取2-4次，每次提取时间为6-8小时，菠萝叶与溶剂的质量体积比(kg/L)为1：5-20；
(2)将步骤(1)中每次浸泡提取得到的浸提液合并，得到提取液，过滤除去固体残渣，得滤液；
(3)步骤(2)中得到的滤液经减压浓缩除去有机溶剂后，加入水使其分散，接着用石油醚萃取2-4次；
(4)将步骤(3)萃取后的石油醚相进行合并，减压浓缩后，干燥得所述菠萝叶提取物。
步骤(1)中所述溶剂选自甲醇-乙醇-异丙醇混合溶剂，三者体积比为甲醇：乙醇：异丙醇＝3：6：1；步骤(3)中水的用量为步骤(1)中有机溶剂体积的1/3至1/2；石油醚的用量为水体积的1-3倍；步骤(4)中所述的干燥为烘干或喷雾干燥。
本发明提供菠萝叶提取物对酪氨酸酶具有很强的抑制作用，可用于化妆品领域作为美白剂，天然无刺激。本发明有效解决了菠萝加工产生的副产物——菠萝叶资源浪费、对环境造成污染的问题。
本发明提供一种菠萝叶提取物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)取干燥菠萝叶，粉碎后，加入溶剂中，于40-50℃条件下浸泡提取2-4次，每次提取时间为6-8小时，菠萝叶与溶剂的质量体积比(kg/L)为1：5-20；
(2)将步骤(1)中每次浸泡提取得到的浸提液合并，得到提取液，过滤除去固体残渣，得滤液；
(3)步骤(2)中得到的滤液经减压浓缩除去有机溶剂后，加入水使其分散，接着用石油醚萃取2-4次；
(4)将步骤(3)萃取后的石油醚相进行合并，减压浓缩后，干燥得所述菠萝叶提取物。
步骤(1)中所述溶剂选自甲醇-乙醇-异丙醇混合溶剂，三者体积比为甲醇：乙醇：异丙醇＝3：6：1；步骤(3)中水的用量为步骤(1)中有机溶剂体积的1/3至1/2；石油醚的用量为水体积的1-3倍；步骤(4)中所述的干燥为烘干或喷雾干燥。
本发明提供一种菠萝叶提取物在制备美白剂中的用途。
本发明提供一种菠萝叶提取物在抑制酪氨酸酶方面的应用。
本发明所述的菠萝叶与溶剂的质量体积比(kg/L)为1：5-20是指单次浸泡提取时每千克菠萝叶使用5-20L溶剂。
附图说明
图1黑色素的吸光值与温度(A-T)图
图2黑色素的吸光值与反应时间(A-t)图
图3黑色素的吸光值与L-酪氨酸物质的量浓度(A-C)图
图4黑色素的吸光值与L-酪氨酸用量(A-V)图
图5黑色素的吸光值与土豆质量/缓冲溶液体积图
图6菠萝叶提取物GC-MS图
图7菠萝叶提取物浓度与酪氨酸酶抑制率的关系图
图8熊果苷酵素浓度与酪氨酸酶抑制率的关系图
具体实施方案
本发明中涉及的酪氨酸酶是可按文献的方法(李好样，吕海燕，董金龙.马铃薯中酪氨酸酶的提取及其活性的研究[J].光谱实验室，2008，25(6)：1040-1043)从土豆中提取的；或按下列方法提取：将土豆洗净削皮，切块后放置于冰箱冷冻层，冷冻过夜。需用时取出称重，与相应比例的缓冲溶液[土豆质量：缓冲溶液体积＝1：5(g/mL)]共置于搅拌机中搅拌；将所得溶液进行离心，离心速率为4000r/min，离心时长为5min，取上清液为实验所用(即土豆提取液)。
本发明所述的缓冲溶液为pH＝6.86的混合磷酸盐缓冲溶液。
本发明从菠萝的不同部位(果皮、果肉、叶)中提取出酵素，测定其对土豆中酪氨酸酶活性的抑制作用，通过计算抑制率来反映抑制作用。用熊果苷作为阳性对照，比较IC50的大小(任红荣，单承莺，姜洪芳，等.香水莲花提取物抑制酪氨酸酶活性的研究[J].天然产物研究与开发，2011，23(06)：1122-1126；叶孝兆，龚盛昭，廖国俊，等.当归提取物对酪氨酸酶的抑制作用[J].日用化学工业，2010，40(02)：98-100)。
抑制率计算公式：[1-(T2-T1)/(C2-C1)]×100％
C1表示只有底物(土豆提取液和缓冲溶液的混合溶液)的吸光度值，C2表示含有底物和L-酪氨酸的吸光度值，C2-C1表示在扣除底物的吸光度后生成的黑色素的吸光度值。T1表示含有底物和样品的吸光度值，T2表示含有底物、L-酪氨酸和样品的吸光度值，T2-T1表示经过样品的抑制，在扣除样品和底物的吸光度后剩余的黑色素的吸光度值。
实施例1酪氨酸酶促进L-酪氨酸生成黑色素的最佳活性条件的确定
(1)温度对酪氨酸酶最佳活性的影响
取10mL干净干燥的棕色容量瓶8个，分为4组，每组2个，分别标记为C1和C2。按照表1加入各试液：
表1体系组成及各试剂加入量
Figure BDA0001256406660000031
Figure BDA0001256406660000041
按照上表给4组容量瓶加入对应量的缓冲溶液和L-酪氨酸溶液作为反应体系的底物，然后加入对应量的土豆提取液，将4组溶液分别置于0℃、10℃、30℃、40℃下，反应35min后，立即进行吸光度的测量(测量波长为475nm为最好)。如图1。
(2)体系反应时间对酪氨酸酶最佳活性的影响
取100mL干净干燥的棕色容量瓶两个，标记为C1和C2，按照表2加入各试液：
表2体系组成及各试剂加入量
Figure BDA0001256406660000042
按照上表给2个容量瓶加入对应量的缓冲溶液和L-酪氨酸溶液作为反应体系的底物，然后加入对应量的土豆提取液，将容量瓶置于10℃水浴，每隔5min测量一个吸光度，反应总时长为90min(测量波长为475nm)。如图2。
(3)L-酪氨酸物质的量浓度对酪氨酸酶最佳活性的影响
用电子天平准确称取0.0181g的L-酪氨酸粉末，用缓冲溶液溶解定容于100ml的容量瓶中,可得1mmol/L的L-酪氨酸溶液。
取6个10mL干净干燥的容量瓶，分别加入上述溶液1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL，用缓冲溶液定容至刻度线，即得物质的量浓度分别为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L的L-酪氨酸溶液。
另取10mL干净干燥的棕色容量瓶12个，分为6组，每组2个，分别标记为C1和C2。按照表3加入各试液：
表3体系组成及各试剂加入量
Figure BDA0001256406660000043
Figure BDA0001256406660000051
按照上表给4组容量瓶加入对应量的缓冲溶液和不同物质的量浓度的L-酪氨酸溶液作为反应体系的底物，然后加入对应量的土豆提取液。将容量瓶置于10℃水浴，反应35min后，立即测量吸光度(测量波长为475nm)。如图3。
(4)L-酪氨酸用量对酪氨酸酶最佳活性的影响
取10个10mL干净干燥的容量瓶，分为5组，每组2个，分别标记为C1和C2。按照表4加入各试液：
表4体系组成及各试剂加入量
Figure BDA0001256406660000052
表中x为1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL，对应y为8.0mL、7.5mL、
7.0mL、6.5mL、6.0mL，向5组容量瓶加入对应量的缓冲溶液和不同量的L-酪氨酸溶液(浓度为0.3mmol/L)作为反应体系的底物，然后加入对应量的土豆提取液。将容量瓶置于10℃水浴，反应35min后，立即测量吸光度(测量波长为475nm)。如图4。
(5)土豆质量与缓冲溶液体积比对酪氨酸酶最佳活性的影响
取10个10mL干净干燥的容量瓶，分为5组，每组2个，分别标记为C1和C2。按照表4加入各试液：
表5体系组成及各试剂加入量
Figure BDA0001256406660000053
土豆提取液中土豆质量与缓冲溶液体积比(g/mL)分别为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5。向5组容量瓶加入对应量的缓冲溶液和L-酪氨酸溶液(浓度为0.3mmol/L)作为反应体系的底物，然后加入对应量的土豆提取液。将容量瓶置于10℃水浴，反应35min后，立即测量吸光度(测量波长为475nm)。如图5。
经确定酪氨酸酶促进L-酪氨酸生成黑色素的最佳活性条件：温度10℃，反应时间35min，L-酪氨酸物质的量浓度为0.3mmol/L，L-酪氨酸的体积用量为2.5mL，制备土豆提取液时土豆质量与缓冲溶液的体积比为1：4。
实施例2
(1)取干燥菠萝叶1kg，粉碎后，加入甲醇-乙醇-异丙醇混合溶剂5L(三者体积比为3：6：1)，于40-50℃条件下浸泡提取4次，每次提取时间为6小时；
(2)将步骤(1)中每次浸泡提取得到的浸提液合并，得到提取液，过滤除去固体残渣，得滤液；
(3)步骤(2)中得到的滤液经减压浓缩除去有机溶剂后，加入2.5L水使其分散，接着用石油醚萃取2次，每次使用石油醚5L；
(4)将步骤(3)萃取后的石油醚相进行合并，减压浓缩后，喷雾干燥得菠萝叶提取物3.9g(GC-MS如图6)。
实施例3
(1)取干燥菠萝叶3kg，粉碎后，加入甲醇-乙醇-异丙醇混合溶剂60L(三者体积比为3：6：1)，于40-50℃条件下浸泡提取2次，每次提取时间为8小时；
(2)将步骤(1)中每次浸泡提取得到的浸提液合并，得到提取液，过滤除去固体残渣，得滤液；
(3)步骤(2)中得到的滤液经减压浓缩除去有机溶剂后，加入20L水使其分散，接着用石油醚萃取4次，每次使用石油醚20L；
(4)将步骤(3)萃取后的石油醚相进行合并，减压浓缩后，喷雾干燥得菠萝叶提取物13.7g。
实施例4
按照文献的方法(中草药，第46卷第7期第949-954页)
称取干燥菠萝叶20kg，粉碎后用95％乙醇(5L)室温下浸泡提取3次，浸泡时间分别为5、7、7d，合并提取液减压浓缩得乙醇提取物1.0kg，将乙醇提取物用水(5L)分散后，先用石油醚萃取4次(每次使用5L石油醚)、醋酸乙酯萃取4次(每次使用5L乙酸乙酯)，将石油醚相、乙酸乙酯相即水相分别浓缩、干燥得到石油醚部位32g，乙酸乙酯部位310g，水相部位105g。
实施例5
按照专利CN 104523463 A的方法得到菠萝叶丙酮提取物。
将500.0g洗净、烘干、粉碎的菠萝叶，用10L丙酮50℃超声90min，功率为144W，频率为25Hz。过滤，滤渣重复提取2次，合并3次滤液在50℃下减压浓缩，浓缩液冷冻干燥，制得11.21g的干燥提取物。
经HPLC分析，实施例2和实施例3制备得到的菠萝叶提取物的HPLC图出峰情况一致性在93％，其与实施例4制备的石油醚部位的出峰一致性较差，相似性仅为52％，与乙酸乙酯部位和水相部位一致性更差，仅为8％-15％；与实施例5的菠萝叶丙酮提取物出峰一致性也较差，相似性仅为33％。
实施例6
在实施例1确定的酪氨酸酶促进L-酪氨酸生成黑色素的最佳活性条件下，分别测试实施例2制备得到的菠萝叶提取物对酪氨酸酶活性的影响，以熊果苷作为阳性对照。
(1)菠萝叶提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用
取1个25mL干净干燥的容量瓶，精确称量25mg的实施例2的菠萝叶提取物固体样品，用缓冲溶液溶解定容于容量瓶中，可得浓度为1mg/mL的样品溶液。
另取6个10mL干净干燥的容量瓶，每个容量瓶中分别加入上述样品溶液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL，用缓冲溶液定容至刻度线，可得质量浓度分别为0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.20mg/mL、0.25mg/mL、0.30mg/mL的6瓶溶液，贴上标签标记。
再取24个10mL干净干燥的容量瓶，分为6组，每组4个，分别标记为C1、C2、T1、T2。按照表6加入各试液：
表6体系组成及各试剂加入量
Figure BDA0001256406660000071
按照上表给6组容量瓶加入对应量的缓冲溶液和L-酪氨酸溶液(浓度为0.3mmol/L)作为反应体系的底物，然后加入对应量的土豆提取液(土豆质量与缓冲溶液体积比为1:4)，不同组中T1和T2中加入不同浓度的等量的样品溶液。将容量瓶置于10℃水浴，反应35min后，立即测量吸光度(测量波长为475nm)。如图7，当石油醚萃取物的浓度由0.05mmol/L增加到0.20mmol/L时，石油醚萃取物对酪氨酸酶的抑制率在逐渐升高，当石油醚萃取物的浓度增到0.20mmol/L时，此时石油醚萃取物对酪氨酸酶的抑制率为90％，但是当石油醚萃取物的浓度大于0.2mmol/L时，随着石油醚萃取物浓度的增加石油醚萃取物对酪氨酸酶的抑制率不再增加，在抑制率上升部分，半数抑制浓度为0.08mg/mL，即IC50＝0.08mg/mL。
(2)熊果苷对酪氨酸酶活性的抑制作用
取1个25mL干净干燥的容量瓶，精确称量0.25g的熊果苷固体样品，用缓冲溶液溶解定容于容量瓶中，可得浓度为10mg/mL的样品溶液。
另取9个10mL干净干燥的容量瓶，每个容量瓶中分别加入上述溶液0.5mL、0.8mL、1.0mL、1.5mL、1.8mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL，用缓冲溶液定容至刻度线，可得质量浓度分别为0.5mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、1.8mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3.0mg/mL、3.5mg/mL的9瓶溶液，贴上标签标记。
再取36个10mL干净干燥的容量瓶，分为9组，每组4个，分别标记为C1、C2、T1、T2。按照表7加入各试液：
表7体系组成及各试剂加入量
Figure BDA0001256406660000081
按照上表给9组容量瓶加入对应量的缓冲溶液和L-酪氨酸溶液(浓度为0.3mmol/L)作为反应体系的底物，然后加入对应量的土豆提取液(土豆质量与缓冲溶液体积比为1:4)，不同组中T1和T2中加入不同浓度的等量的样品溶液。将容量瓶置于10℃水浴，反应35min后，立即测量吸光度(测量波长为475nm)。如图8，在酪氨酸酶活性最佳条件下，当浓度为0.5mg/mL～2.0mg/mL之间时，样品对酶活性的抑制率随浓度的增大而增大，并在浓度为2.0mg/mL时达到最大，此时的抑制率为61.68％；当浓度为2.0mg/mL～3.5mg/mL之间时，抑制率随浓度的增大而减小。在抑制率上升部分，半数抑制浓度为1.55mg/mL，即IC50＝1.55mg/mL。
实施例7
按照本发明实施例6中的方法，对实施例4制备的石油醚部位、乙酸乙酯部位和水相部位以及实施例5制备的菠萝叶丙酮提取物进行测试酪氨酸酶抑制活性，结果发现水相部位、菠萝叶丙酮提取物在浓度为5mg/mL时，其对酪氨酸酶抑制率不足20％；石油醚部位在浓度为5mg/mL时，其对酪氨酸酶抑制率不足50％；而乙酸乙酯部位在浓度为1mg/mL时，其对酪氨酸酶显示出一定的激活作用，激活率为15％。

Claims (2)

1.一种应用于美白领域的菠萝叶提取物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)取干燥菠萝叶，粉碎后，加入溶剂中，于40-50oC条件下浸泡提取2-4次，每次提取时间为6-8小时，菠萝叶与溶剂的质量体积比kg/L为1：5-20；
(2)将步骤(1)中每次浸泡提取得到的浸提液合并，得到提取液，过滤除去固体残渣，得滤液；
(3)步骤(2)中得到的滤液经减压浓缩除去有机溶剂后，加入水使其分散，接着用石油醚萃取2-4次；
(4)将步骤(3)萃取后的石油醚相进行合并，减压浓缩后，干燥得所述菠萝叶提取物；
步骤(1)中所述溶剂选自甲醇-乙醇-异丙醇混合溶剂，三者体积比为甲醇：乙醇：异丙醇＝3：6：1；
步骤(3)中水的用量为步骤(1)中有机溶剂体积的1/3至1/2；石油醚的用量为水体积的1-3倍。
2.权利要求1所述的菠萝叶提取物的制备方法，其特征在于步骤(4)中所述的干燥为烘干或喷雾干燥。
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