CN106916866A - 一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了生物医药技术领域的一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，该博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法的具体步骤如下：S1：单孢子溶液制备；S2：耐性菌株培育；S3：耐性菌株摇瓶发酵；S4：选取抑菌圈较大的菌株进行复筛；S5：发酵培养种子液制备；S6：摇床培养种子液；S7：真空干燥，本发明提高了博来霉素的生产周期，进一步的提高其产量，并简化了发酵培养基的成分，降低了生产成本，且制备出的博来霉素能够展现出更好的活性和更低的毒性。

Description

一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体为一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法。
背景技术
博来霉素为广谱抗肿瘤药，对鳞癌，包括头颈部、皮肤、食道、肺、宫颈、阴茎和甲状腺等癌肿以及恶性淋巴瘤等有效，对脑瘤、恶性黑色素瘤和纤维肉瘤等也具有一定疗效。博来霉素有独特的分子结构和生物活性，能够介导激活氧分子，并选择性的引起单链和双链DNA的断裂从而抑制肿瘤细胞的DNA合成和复制。此外，博来霉素还可以选择性的裂解RNA从而抑制蛋白质的合成。博来霉素的活性机理决定了其不会抑制骨髓造血系统和免疫系统，因此对人体白细胞，机体免疫功能和造血系统等的副作用较为轻微。博来霉素属于细胞周期非特异性药物，从上世纪80年代其被开发成一种重要的有效抗肿瘤药物，在临床上广泛应用。目前博来霉素一般与其他抗肿瘤药物或辅助药物联合应用，以降低其毒性和获得更好的抗肿瘤效果。
博来霉素自被发现后便因其强效的抗肿瘤活性迅速成为治疗多种肿瘤的特效化疗药物，近年来博来霉素族抗生素在抗病毒研究中的应用，更加拓宽了其应用范围。但是博来霉素导致的剂量依赖性肺纤维化以及一些肿瘤细胞逐渐形成的耐药性极大的限制了其临床应用和推广。因此，合成新型的高效低毒的博来霉素族衍生物一直都是开发博来霉素类抗肿瘤药物的关键和热点。虽然博来霉素的化学合成已经完成，但是通过传统化学修饰获取少量的博来霉素衍生物并未展示出更好的活性和更低的毒性，同时博来霉素及其复杂的分子结构也导致相关的合成过程繁琐且效率低下，无法满足临床研究的需要和工业化生产的应用。为此，我们提出了一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法投入使用，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，以解决上述背景技术中提出的通过传统化学修饰获取少量的博来霉素衍生物并未展示出更好的活性和更低的毒性，同时博来霉素及其复杂的分子结构也导致相关的合成过程繁琐且效率低下，无法满足临床研究的需要和工业化生产的应用的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，该博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法的具体步骤如下：
S1：在轮枝链霉菌菌种的新鲜斜面加入10ml无菌水，刮下白色孢子层后，所得的悬浮液经过滤后振荡2min，制得单孢子溶液；
S2：利用滴定管吸取10ml单孢子溶液于无菌平板中，采用紫外线照射后，将其均匀涂布于无菌平板中培养，制备出耐性菌株；
S3：将耐性菌株接种至含有发酵培养基的三角瓶中，摇瓶发酵；
S4：将发酵后产生的发酵液经过过滤后用微量注射器各取上清液15μL，并滴于圆形层析滤纸小片上，且纸片贴在鉴定菌的培养板上，在37℃环境下培养14～20h，并取抑菌圈较大者进行复筛；
S5：利用HPLC色谱分析方法选取目标产物生产能力较高的菌株，并转接于发酵培养基中，装液量为50mL的三角瓶，在30℃、170r·min-1的条件下摇床培养60～70h，得到作为发酵培养的种子液；
S6：以10％接种量将所得种子液接种到发酵培养基中进行摇床培养，发酵体系为300mL三角瓶装液量为50mL，在30℃、200r·min-1的条件下摇床培养6d；
S7：发酵结束后，收集发酵液，用10倍体积甲醇振荡浸提24h后，将甲醇浸提液放入真空干燥箱中烘干后既得。
优选的，所述步骤S2中，在采用紫外线照射时，紫外线发光光源为30W，260A，紫外线光源的照射距离为30cm。
优选的，所述步骤S3中，发酵培养基为淀粉、糊精、大豆粉、葡萄糖、玉米浆、黄豆粉、酵母粉、硫酸铜和硫酸锌的混合物，其PH值为6.5～7.0。
优选的，所述步骤S4中，鉴定菌为枯草杆菌。
优选的，所述步骤S5中，在采用HPLC定量分析中，液相色谱条件为色谱柱YWG，C18，10μm，250×4.6mm。
优选的，所述步骤S7中，真空干燥箱的功率为3～5KW，烘干温度为90～110℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提高了博来霉素的生产周期，进一步的提高其产量，并简化了发酵培养基的成分，降低了生产成本，且制备出的博来霉素能够展现出更好的活性和更低的毒性。
附图说明
图1为本发明制备流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，该博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法的具体步骤如下：
S1：在轮枝链霉菌菌种的新鲜斜面加入10ml无菌水，刮下白色孢子层后，所得的悬浮液经过滤后振荡2min，制得单孢子溶液；
S2：利用滴定管吸取10ml单孢子溶液于无菌平板中，采用紫外线照射后，将其均匀涂布于无菌平板中培养，制备出耐性菌株，在采用紫外线照射时，紫外线发光光源为30W，260A，紫外线光源的照射距离为30cm；
S3：将耐性菌株接种至含有发酵培养基的三角瓶中，摇瓶发酵，发酵培养基为淀粉、糊精、大豆粉、葡萄糖、玉米浆、黄豆粉、酵母粉、硫酸铜和硫酸锌的混合物，其PH值为6.5～7.0；
S4：将发酵后产生的发酵液经过过滤后用微量注射器各取上清液15μL，并滴于圆形层析滤纸小片上，且纸片贴在鉴定菌的培养板上，在37℃环境下培养14～20h，并取抑菌圈较大者进行复筛，鉴定菌为枯草杆菌；
S5：利用HPLC色谱分析方法选取目标产物生产能力较高的菌株，并转接于发酵培养基中，装液量为50mL的三角瓶，在30℃、170r·min-1的条件下摇床培养60～70h，得到作为发酵培养的种子液，在采用HPLC定量分析中，液相色谱条件为色谱柱YWG，C18，10μm，250×4.6mm；
S6：以10％接种量将所得种子液接种到发酵培养基中进行摇床培养，发酵体系为300mL三角瓶装液量为50mL，在30℃、200r·min-1的条件下摇床培养6d；
S7：发酵结束后，收集发酵液，用10倍体积甲醇振荡浸提24h后，将甲醇浸提液放入真空干燥箱中烘干后既得，真空干燥箱的功率为3～5KW，烘干温度为90～110℃。
在菌种选育过程中，在含有博来霉素和前体的斜面培养基中，随着博来霉素、前体浓度的增加，菌落变小并丧失产生孢子的能力，但是把此菌落转移到不含有博来霉素和前体的斜面培养基中培养，则恢复产孢子的能力，对于博来霉素产生菌而言，其斜面的培养时间以7～8天为宜，种龄为48hr，发酵周期为8天时，博来霉素的产量较高。博来霉素结构的多肽部分由许多氨基酸结合而成，并且从博来霉素的摇床发酵的代谢曲线可以看出，初级代谢与次级代谢阶段区分明显，在发酵培养基中，利用糊精作碳源代替部分淀粉，可使培养液的黏度大为下降，有利于溶氧浓度的提高，进而促进博来霉素的合成，另外通过对培养条件的正交实验，以50mL装量并于30℃培养，菌体产博来霉素的能力相对较强。
在博来霉素的发酵过程中，胺基类化合物可结合进入博来霉素结构，构成博来霉素的末端胺基，不同种类的有机氮源，因为含有不同的胺基类化合物，既可直接影响发酵单位的高低，也影响发酵产物中博来霉素的组分。在发酵培养基中，玉米浆可提高博来霉素A5的相对产量。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，其特征在于：该博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法的具体步骤如下：
S1：在轮枝链霉菌菌种的新鲜斜面加入10ml无菌水，刮下白色孢子层后，所得的悬浮液经过滤后振荡2min，制得单孢子溶液；
S2：利用滴定管吸取10ml单孢子溶液于无菌平板中，采用紫外线照射后，将其均匀涂布于无菌平板中培养，制备出耐性菌株；
S3：将耐性菌株接种至含有发酵培养基的三角瓶中，摇瓶发酵；
S4：将发酵后产生的发酵液经过过滤后用微量注射器各取上清液15μL，并滴于圆形层析滤纸小片上，且纸片贴在鉴定菌的培养板上，在37℃环境下培养14～20h，并取抑菌圈较大者进行复筛；
S5：利用HPLC色谱分析方法选取目标产物生产能力较高的菌株，并转接于发酵培养基中，装液量为50mL的三角瓶，在30℃、170r·min-1的条件下摇床培养60～70h，得到作为发酵培养的种子液；
S6：以10％接种量将所得种子液接种到发酵培养基中进行摇床培养，发酵体系为300mL三角瓶装液量为50mL，在30℃、200r·min-1的条件下摇床培养6d；
S7：发酵结束后，收集发酵液，用10倍体积甲醇振荡浸提24h后，将甲醇浸提液放入真空干燥箱中烘干后既得。
2.根据权利要求1所述的一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，在采用紫外线照射时，紫外线发光光源为30W，260A，紫外线光源的照射距离为30cm。
3.根据权利要求1所述的一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，其特征在于：所述步骤S3中，发酵培养基为淀粉、糊精、大豆粉、葡萄糖、玉米浆、黄豆粉、酵母粉、硫酸铜和硫酸锌的混合物，其PH值为6.5～7.0。
4.根据权利要求1所述的一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，其特征在于：所述步骤S4中，鉴定菌为枯草杆菌。
5.根据权利要求1所述的一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，其特征在于：所述步骤S5中，在采用HPLC定量分析中，液相色谱条件为色谱柱YWG，C18，10μm，250×4.6mm。
6.根据权利要求1所述的一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，其特征在于：所述步骤S7中，真空干燥箱的功率为3～5KW，烘干温度为90～110℃。
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