CN106889173A - 一种具有抑菌活性的菱角壳黄酮提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种具有抑菌活性的菱角壳黄酮提取物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及一种具有抑菌活性的菱角壳黄酮提取物及其制备方法和应用。本发明采用较低温度提取菱角壳黄酮，以超声预处理破坏菱角壳组织细胞壁，再采用大孔吸附树脂柱层析纯化，尽可能的保留了提取物的抑菌活性，通过大孔吸附树脂的富集，菱角壳黄酮纯度高，所得菱角壳黄酮提取物，具有明显抑菌效果。该技术方案有机试剂的使用量小，安全无毒，可用于天然抑菌剂的开发。
Description
技术领域
本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及一种具有抑菌活性的菱角壳黄酮提取物及其制备方法和应用。
背景技术
菱角既是传统食品也是传统的药材，具有抗肿瘤、增强免疫力等保健功效。菱角广泛种植于我国南方各省，菱角壳一般都作为废弃物丢掉，其中大量的功效物质未得到利用，造成资源浪费和环境污染。菱角壳富含多酚、多糖、黄酮和生物碱等有效物质，功能物质制备开发极具市场前景。其中的菱角壳黄酮提取物具有较好的抗氧化、抑菌等效果。从菱角壳中获取高效、经济安全的天然抑菌成分，较传统化学抑菌剂相比，来源广泛，廉价，具有较好的开发前景。
有关菱角及其应用的报道和专利已有不少，但关于菱角壳黄酮提取物的研究报道和专利较少。通过文献查阅，公开号为CN103689603A的中国专利公开了“一种富含膳食纤维和黄酮的泮塘五秀营养粉丝及其制备方法”，该专利涉及一种将源自茭白的优良膳食纤维和源自菱角壳的黄酮类化合物同时加入营养粉丝中，获得一种富含膳食纤维和黄酮的营养粉丝。公开号为CN105343141A的中国专利公开了“一种菱角壳提取物的咀嚼片的制备方法”，该专利涉及一种将菱角壳经水煮提取、浓缩后醇沉处理后，浓缩制得菱角壳提取物浸膏。将菱角壳提取物浸膏及辅料，制粒，干燥整粒后加入硬脂酸镁制得咀嚼片。公开号为CN105147747A的中国专利公开了“一种菱角壳提取物的颗粒剂的制备方法”，该专利涉及将一种将水提、浓缩后的提取液，醇沉，取上清液浓缩制得菱角壳提取物浸膏。将菱角壳提取物浸膏和辅料经挤压制粒，干燥后制得颗粒剂成品。该颗粒剂对小白鼠具有明显的抗氧化、抗肿瘤、降糖及保肝护肝等药理作用。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种具有抑菌活性的菱角壳黄酮提取物及其制备方法和应用。通过本发明的技术方案所得到的菱角壳黄酮提取物具有很好的抑菌效果，可作为天然抑菌剂应用于肉质食品加工。
本发明提供的技术方案如下：
一种具有抑菌活性的菱角壳黄酮提取物的制备方法，包括以下步骤：
1)提取
将菱角壳粉末进行乙醇溶液的浸提，分离得到提取液和菱角壳粉末，再对菱角壳粉末重复进行乙醇溶液的浸提1～2次，合并各次的提取液，过滤，减压浓缩至无乙醇，得到菱角壳黄酮粗提液，其中：乙醇溶液的浸提为将菱角壳粉末与质量分数为50～80％的乙醇溶液按照重量比1:20～1:30混合，超声处理，然后55～65℃恒温浸提2～3小时；
2)吸附
调节所述菱角壳黄酮粗提液的浓度至3.0～10.0mg/mL，进行大孔吸附树脂柱层析；
3)洗脱
吸附平衡后，以质量分数为60～80％的乙醇溶液为洗脱剂对大孔吸附树脂柱进行洗脱，收集洗脱液；
4)浓缩
浓缩所述洗脱液，即得浸膏状菱角壳黄酮提取物。
优选的，具有抑菌活性的菱角壳黄酮提取物的制备方法包括以下步骤：
1)提取
将菱角壳粉末进行乙醇溶液的浸提，分离得到提取液和菱角壳粉末，再对菱角壳粉末重复进行乙醇溶液的浸提1～2次，合并各次的提取液，过滤，减压浓缩至无乙醇，得到菱角壳黄酮粗提液，其中：乙醇溶液的浸提为将菱角壳粉末与质量分数为50～80％的乙醇溶液按照重量比1:20～1:30混合，超声处理，然后55～60℃恒温浸提2～3小时；
2)吸附
调节所述菱角壳黄酮粗提液的浓度至5.0～10.0mg/mL，进行大孔吸附树脂柱层析；
3)洗脱
吸附平衡后，以质量分数为60～80％的乙醇溶液为洗脱剂对大孔吸附树脂柱进行洗脱，收集洗脱液；
4)浓缩
浓缩所述洗脱液，即得浸膏状菱角壳黄酮提取物。
具体的，步骤1)中：
菱角壳粉末为过40目筛的干燥粉末；
超声处理处理2～4min；
减压浓缩的处理温度为45～55℃。
具体的，步骤2)中：菱角壳黄酮粗提液的上样体积为3.5～6倍柱体积，吸附流速为0.4～0.6倍柱体积/h(0.65～0.95mL/min)。
具体的，步骤3)中：洗脱剂的洗脱流速为0.4～0.6倍柱体积/h(0.65～0.95mL/min)，洗脱剂的洗脱体积为3～4倍柱体积。
具体的，步骤4)中：以减压浓缩进行洗脱液的浓缩，减压浓缩的温度为45～55℃。
本发明所提供的具有抑菌活性的菱角壳黄酮提取物的制备方法工艺简单，实现了较低温度提取菱角壳黄酮，配合大孔吸附树脂柱层析纯化，最大程度保留提取物的抑菌活性。
本发明还提供了根据上述具有抑菌活性的菱角壳黄酮提取物的制备方法制备得到的菱角壳黄酮提取物。
具体的，总黄酮的含量为33.1～38.7wt％。
本发明还提供了上述菱角壳黄酮提取物的应用，作为抑菌剂。
具体的，作为冷鲜鸭肉的抑菌剂。
优选的，作为假单胞菌、金黄色葡萄球菌和/或腐败西瓦氏菌的抑菌剂
通过本发明所得的菱角壳黄酮提取物对假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果较好，其抑菌的MIC可低至3.125mg/mL；经过菱角壳黄酮提取物处理后的鸭肉与10℃度条件下储存可明显抑制假单胞菌的生长。
发明与现有技术相比具有以下有益效果：
1)本发明制备工艺简单，采用较低温度提取菱角壳黄酮，再采用大孔吸附树脂柱层析纯化，尽可能的保留了提取物的抑菌活性，通过大孔吸附树脂的富集，菱角壳黄酮纯度高达38.7％，具有明显抑菌效果，而常规热提法所得菱角壳黄酮纯度只有15％。此方法也避免了大量有机试剂的使用，安全无毒。可用于天然抑菌剂的开发。
2)本发明先以超声预处理破坏菱角壳组织细胞壁，更有利于黄酮成分的提取，使低温浸提的时间大大缩短。
3)本发明菱角壳黄酮的提取和浓缩温度均控制在55℃以下，比高温浸提更利于有效成分的活性。
附图说明
图1是不同温度下本发明所提供的菱角壳黄酮纯化物处理鸭肉后鸭肉中假单胞菌菌落数的变化图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：
菱角壳黄酮提取物浸膏的制备：
1)提取：去干燥粉碎过40目筛的菱角壳和50％的乙醇溶液按1:20混合，超声处理2min，然后55℃恒温浸提3小时后分离提取液，重复以上操作提取2次，合并提取液，过滤，45℃减压浓缩至无乙醇，得菱角壳黄酮粗提液；
2)吸附：调节菱角壳黄酮提取液浓度为5.0mg/mL，进行AB-8大孔吸附树脂柱层析；吸附流速为0.5倍柱体积/h，吸附体积为3倍柱体积；
3)洗脱：以洗脱流速0.8mL/min，70％乙醇溶液为洗脱液进行洗脱，洗脱液体积为3柱体积，收集洗脱液；
4)浓缩：浓缩洗脱液，在50℃条件下减压浓缩，即得菱角壳黄酮浸膏，其纯度为33.1％。
实施例2
菱角壳黄酮提取物浸膏的制备：
1)提取：去干燥粉碎过40目筛的菱角壳和80％的乙醇溶液按1:30混合，超声处理1min，然后50℃恒温浸提2小时后分离提取液，重复以上操作提取3次，合并提取液，过滤，50℃减压浓缩至无乙醇，得菱角壳黄酮粗提液；
2)吸附：调节菱角壳黄酮提取液浓度为3.0mg/mL，进行AB-8大孔吸附树脂柱层析；吸附流速为1倍柱体积/h，吸附体积为4倍柱体积，
3)洗脱：以洗脱流速1.8mL/min，60％乙醇溶液为洗脱液进行洗脱，洗脱液体积为4柱体积，收集洗脱液；
4)浓缩：浓缩洗脱液，在50℃条件下减压浓缩，即得菱角壳黄酮浸膏，其纯度为35.6％。
将所得菱角壳提取采用抑菌圈实验及二倍稀释法检测其对于假单胞菌，金黄色葡萄球菌均具有很好的抑菌效果。菱角壳黄酮提取物处理后的鸭肉与10℃条件下储存可明显抑制假单胞菌的生长。
实施例3
菱角壳黄酮提取物浸膏的制备：
1)提取：去干燥粉碎过40目筛的菱角壳和65％的乙醇溶液按1:25混合，超声处理2min，然后60℃恒温浸提2小时后分离提取液，重复以上操作提取3次，合并提取液，过滤，50℃减压浓缩至无乙醇，得菱角壳黄酮粗提液；
2)吸附：调节菱角壳黄酮提取液浓度为3.0mg/mL，进行AB-8大孔吸附树脂柱层析；吸附流速为0.8倍柱体积/h，吸附体积为1.5倍柱体积，
3)洗脱：以洗脱流速0.8mL/min，70％乙醇溶液为洗脱液进行洗脱，洗脱液体积为3.5柱体积，收集洗脱液；
4)浓缩：浓缩洗脱液，在50℃条件下减压浓缩，即得菱角壳黄酮浸膏，其纯度为38.7％。
实验例：
抑菌试验
针对菱角壳提取所得黄酮提取物具有明显的抑菌作用
实验材料：
样品：本抑菌试验的菱角壳黄酮提取物由实施例2制备
供试菌种：
假单胞菌，金黄色葡萄球菌，腐败西瓦氏菌，热杀索丝菌
试剂：NA培养基、MH培养基
器材：超净工作台：苏州华宏净化技术有限公司。高压灭菌锅：西安常仪生化科技有限公司。电热恒温培养箱型：上海精宏。芬兰Bioscreen全自动分析仪：上海谓载商贸发展有限公司。漩涡仪：上海书俊仪器设备有限公司。
试验方法：
1.平板抑菌试验：
将已灭菌的琼脂培养基倒入培养皿内，每皿15mL(下层)待其凝固；将已灭菌的5mL培养基冷却到50℃左右混入100μL菌悬液，将混有菌的培养基加到已凝固的培养基上层待其凝固；在已凝固的培养基表面上垂直放入牛津杯，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙；在牛津杯内加入200μL浓度为50mg/mL经0.22μm无菌滤头处理的样液，勿使其外溢，无菌水做空白；加完样液后于30℃培养24h，观察结果，量取直径，以出现的抑菌圈大小为判定标准，直径小于8mm为无抑菌作用。
2.最低抑菌浓度(MIC)测定
分别称取菱角壳黄酮粗提物、纯化物粉末各0.25g，无菌水为溶剂，采用2倍稀释法稀释为25、12.5、6.25、3.125、1.563mg/mL 5个浓度梯度的样品溶液，分别加入各培养基中。将受试菌菌悬液接种于各试管中，摇床培养，酵母菌、乳酸菌于37℃培养48h，其它菌于30℃培养24h，以完全无菌生长的最高稀释度为最低抑菌浓度，考察菱角壳黄酮提取物的抑菌性能。
3.鸭肉上菱角壳黄酮对假单胞菌菌落数的影响
新鲜宰杀的净膛鸭肉浸泡在配置好的浓度为2.5mg/mL菱角壳黄酮纯化物中10min后，沥干，进行气调包装后，放置于0、5、10、15、20℃的恒温培养箱中贮藏。隔天测定菱角壳黄酮纯化物处理的鸭肉中假单胞菌的生长状况。
试验结果：
1.样品浓度为50mg/mL时对受试菌抑菌结果见表1：
表1菱角壳黄酮提取物的抑菌活性
菱壳黄酮粗提取物、纯化物对假单胞菌、金黄色葡萄球菌、腐败西瓦氏菌和热杀索丝菌抑制作用均较好，纯化物对假单胞和金黄色葡萄球菌的效果尤为突出，抑菌圈直径高达47.01±0.43mm和45.06±0.35mm。
2.菱角壳黄酮提取物最低抑菌浓度结果见下表表2：
表2菱角壳黄酮粗提物、纯化物最低抑菌浓度(MIC)
菱角壳黄酮粗提取物、纯化物对假单胞菌、金黄色葡萄球菌和腐败西瓦氏菌有较强的抑制作用。表2实验结果表明：菱角壳黄酮粗和纯化物对假单胞菌的最低抑菌浓度为3.125mg/mL，菱角壳黄酮纯化物对金黄色葡萄球菌、腐败西瓦氏菌和热杀索丝菌的抑菌效果显著优于粗提物。
3.菱角壳黄酮纯化物处理过的鸭肉基质对假单胞菌的生长有影响
如图1所示，菱角壳黄酮纯化物对假单胞菌初始菌落数具有很好的抑制作用。在整个储藏过程中，0℃条件下，鸭肉中假单胞菌增殖较平缓；5℃时，假单胞菌增殖速度加快的不显著；10℃时假单胞菌繁殖增长较0、5℃迅速；15、20℃条件下，假单胞菌繁殖速度，但在后期贮藏过程中，20℃时生长趋势趋于平缓，没有明显增加。总体而言，菱角壳黄酮纯化物对鸭肉中假单胞菌增殖在常温区具有理想的抑制作用，可作为天然抑菌剂应用于工业化生产。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种具有抑菌活性的菱角壳黄酮提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取
将菱角壳粉末进行乙醇溶液的浸提，分离得到提取液和菱角壳粉末，再对菱角壳粉末重复进行乙醇溶液的浸提1～2次，合并各次的提取液，过滤，减压浓缩至无乙醇，得到菱角壳黄酮粗提液，其中：乙醇溶液的浸提为将菱角壳粉末与质量分数为50～80％的乙醇溶液按照重量比1:20～1:30混合，超声处理，然后55～65℃恒温浸提2～3小时；
2)吸附
调节所述菱角壳黄酮粗提液的浓度至3.0～10.0mg/mL，进行大孔吸附树脂柱层析；
3)洗脱
吸附平衡后，以质量分数为60～80％的乙醇溶液为洗脱剂对大孔吸附树脂柱进行洗脱，收集洗脱液；
4)浓缩
浓缩所述洗脱液，即得浸膏状菱角壳黄酮提取物。
2.根据权利要去1所述的具有抑菌活性的菱角壳黄酮提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取
将菱角壳粉末进行乙醇溶液的浸提，分离得到提取液和菱角壳粉末，再对菱角壳粉末重复进行乙醇溶液的浸提1～2次，合并各次的提取液，过滤，减压浓缩至无乙醇，得到菱角壳黄酮粗提液，其中：乙醇溶液的浸提为将菱角壳粉末与质量分数为50～80％的乙醇溶液按照重量比1:20～1:30混合，超声处理，然后55～60℃恒温浸提2～3小时；
2)吸附
调节所述菱角壳黄酮粗提液的浓度至5.0～10.0mg/mL，进行大孔吸附树脂柱层析；
3)洗脱
吸附平衡后，以质量分数为60～80％的乙醇溶液为洗脱剂对大孔吸附树脂柱进行洗脱，收集洗脱液；
4)浓缩
浓缩所述洗脱液，即得浸膏状菱角壳黄酮提取物。
3.根据权利要求1或2所述的具有抑菌活性的菱角壳黄酮提取物的制备方法，其特征在于，步骤1)中：
菱角壳粉末为过40目筛的干燥粉末；
超声处理处理2～4min；
减压浓缩的处理温度为45～55℃。
4.根据权利要求1或2所述的具有抑菌活性的菱角壳黄酮提取物的制备方法，其特征在于，步骤2)中：菱角壳黄酮粗提液的上样体积为3.5～6倍柱体积，吸附流速为0.4～0.6倍柱体积/h。
5.根据权利要求1或2所述的具有抑菌活性的菱角壳黄酮提取物的制备方法，其特征在于，步骤3)中：洗脱剂的洗脱流速为0.4～0.6倍柱体积/h，洗脱剂的洗脱体积为3～4倍柱体积。
6.根据权利要求1或2所述的具有抑菌活性的菱角壳黄酮提取物的制备方法，其特征在于，步骤4)中：以减压浓缩进行洗脱液的浓缩，减压浓缩的温度为45～55℃。
7.一种根据权利要求1至6任一所述的具有抑菌活性的菱角壳黄酮提取物的制备方法制备得到的菱角壳黄酮提取物。
8.根据权利要求7所述的菱角壳黄酮提取物，其特征在于：总黄酮的含量为33.1～38.7wt％。
9.一种根据权利要求7或8所述的菱角壳黄酮提取物的应用，其特征在于：作为抑菌剂。
10.根据权利要求9所述的菱角壳黄酮提取物的应用，其特征在于：
作为冷鲜鸭肉的抑菌剂；
或者，作为假单胞菌、金黄色葡萄球菌和/或腐败西瓦氏菌的抑菌剂。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20170627 |