CN106885851A - 一种基于手性定量分析技术的红茶产地判别方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于茶叶判别技术领域，具体涉及一种基于手性定量分析技术的红茶产地判别方法。其包括以下步骤：1）不同产地红茶中手性萜类化合物的含量测定；2）不同产地红茶的PLS‑DA模型的建立及验证；3）未知红茶样品的产地预测。采用本发明所述方法可在绿色环保无污染的情况下实现不同产地红茶的快速、有效鉴别，其正判率达95%以上，且分析结果为量化数值，排除了人为干扰因素，在目前日益重视的茶叶原产地保护领域有着广阔的应用前景。

Description

一种基于手性定量分析技术的红茶产地判别方法

技术领域

本发明属于茶叶判别技术领域，具体涉及一种基于手性定量分析技术的红茶产地判别方法。

背景技术

红茶历来是国际茶叶市场的主流产品，约占世界茶叶贸易量的75%。红茶产区分布极广，尤其在印度、斯里兰卡和中国南部等地区红茶生产在农业经济占据重要地位。中国是世界上最早发明和加工红茶的国家，红茶产地更是遍布大江南北，涉及云南、四川、重庆、湖北、湖南、福建、广东、广西、海南、江西、浙江、安徽、江苏、台湾等14个省、自治区、直辖市。不同产地的红茶在风味品质上有较大的差异，受喜爱程度自然因人而异，价格上亦参差不齐。在利益的驱使下，有部分不法商家低价收购其它产地的茶叶以次充好，从中谋取巨额利益，给原产地的名优红茶产业发展造成了较大的负面影响。近年来，各地名优红茶纷纷申请原产地保护，但由于分析技术上的局限性，目前主要的判定手段主要依靠感官审评技术。然而，感官审评技术对评茶员的经验资历有着极高的要求，且耗时耗力，不适合商业运作上大批量的样品分析。另一方面，感官审评技术虽然可以直观反映样品的品质特性，但其品质特性受审评人员主观因素干扰较大，难以实现统一标准化。因此，急需一种客观且可操作性强的分析检测方法来实现红茶产地的精确判别，以促进标准化管理，健全追溯管理体系，从而保证红茶产业的持续健康发展。

茶叶香气是评价茶叶品质优劣的重要指标之一，其实质是成百上千种芳香物质以不同浓度组合对人类嗅觉神经综合作用的结果。由于品种、气候及环境等多种因素的综合影响，不同产地的茶叶在香气组成上往往也有较大差异。因此，可以考虑利用不同产地红茶的特征性香气成分的含量建立相应预测模型，从而通过量化数据实现产地判别的目的。然而，由于茶叶香气化合物繁多复杂，化学性质各异，全组分香气物质的定性定量方法一直是相关学术领域研究的难点，目前已报道的分析方法虽较成熟，但在实际操作上繁琐复杂，费时较长，不适用于大批量茶样分析。另一方面，由于茶叶的基质效应，茶叶香气中存在多种干扰性成分，在很大程度上会影响预测模型的聚类效果，难以实现将众多茶样按产地分类的目的。因此，若能采用关键差异性香气成分来组建不同产地红茶的预测模型，不仅可以大量缩减分析工作量，更可以提高预测模型的准确性。

挥发性萜类化合物是红茶香气的关键组成，具有宜人的香气及较低的香气阈值，对成茶香气品质有着重要影响。挥发性萜类化合物往往含有1个甚至多个手性碳原子，存在香气特性完全不同的对映异构体，如S-(+)-芳樟醇具有甜香及橙花香，香气阈值为7.4 μg•L^-1，R-(-)-芳樟醇具有木香和类似薰衣草的香气特征，香气阈值为0.8 μg•L^-1；S-(-)-柠檬烯呈现柠檬香气，而R-(+)-柠檬烯则具有松脂气味。鉴于不同产区的红茶在香气品质上存在较大差异，其香气中萜类化合物对映异构体比例及含量也很可能会具有一定的地域特征性，非常适合作为茶叶产地判别模型的关键变量。然而，由于过去分析手段的限制及缺乏对茶叶中手性化合物的科学认知，目前还未有基于手性定量分析技术的茶叶产地判别方法的相关文献或专利报道。

偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）是一种用于判别分析的多变量统计分析方法，其原理是对不同处理样本（如观测样本、对照样本）的特性分别进行训练，产生训练集，并检验训练集的可信度。PLS-DA是近年来应用实际需要而产生和发展的一个具有广泛使用性的新型多元统计分析方法，是多元线性回归、主成分分析和典型相关分析的有机结合。采用该统计方法，在构造因素时考虑到了辅助矩阵以代码形式提供的类成员信息，因此具有高效的预测及鉴别能力。目前，在茶叶产地鉴别领域还未有用手性定量分析技术结合PLS-DA的相关报道。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明旨在提供一种客观、可量化且便捷的红茶产地判别方法。本发明采用手性定量分析技术，仅需查明茶叶香气中若干种常见手性萜类化合物的含量，通过PLS-DA分析即可实现不同产地红茶的快速、有效鉴别。

本发明采用的技术方案如下：

1）不同产地红茶中手性萜类化合物的含量测定

收集各不少于5个的不同产地的红茶样品，测定芳樟醇、芳樟醇氧化物（A、B、C、D）、α-松油醇、4-萜品醇、柠檬烯及α-紫罗兰酮对映异构体在红茶中的含量，根据茶叶产地对茶叶进行分组，依次按列发布所获得的萜类化合物对映异构体含量，导入EXCEL电子表格中；

2）不同产地红茶的PLS-DA模型的建立及验证

将萜类化合物对映异构体的含量数据导入Simca-p 11.5软件，选择校正集样本，以萜类化合物含量矩阵为自变量，产地分类信息为观察变量，建立校正集的偏最小二乘法判别分析PLS-DA模型；对已建立的PLS-DA模型进行置换检验试验，验证模型是否存在“过拟合”现象；将验证集里的茶叶样品代入到PLS-DA模型中，检验其判别准确率；

3）未知红茶样品的产地预测

依照步骤1）对未知产地的红茶样品中手性萜类化合物进行定量分析，将数据导入已建立的PLS-DA预测模型中，依照步骤2）代入已建立的红茶产地判别模型中，计算该茶样在每个Class中的分类变量值Y_predict，当某Class中的Y_predict＞0.5，且偏差＜0.5，则判定该红茶属于该Class对应的产地。

进一步的，所述步骤1）具体包括以下步骤：

a）手性萜类化合物的定量工作曲线绘制

采用手性气相色谱-质谱联用技术分离芳樟醇、芳樟醇氧化物（A、B、C、D）、4-萜品醇、α-松油醇、柠檬烯及α-紫罗兰酮等挥发性萜类化合物标准品的相应对映异构体，记录每个化合物的保留时间、特征峰离子及定量离子；配置一系列不同浓度梯度的上述化合物的混合溶液，分别取10 μL于已预处理过的空白茶样中，顶空固相微萃取法结合手性气质联用技术分析空白茶样中挥发出的混合标准品；建立各萜类化合物对映异构体浓度与定量离子峰面积间的线性方程，从而绘制出芳樟醇、芳樟醇氧化物（A、B、C、D）、4-萜品醇、α-松油醇、柠檬烯及α-紫罗兰酮对映异构体的定量工作曲线；

b）不同产地中红茶样品中手性萜类化合物的含量测定

采用与步骤a）相同的顶空固相微萃取条件萃取不同产地红茶的香气成分，依照与步骤a）相同的GC-MS方法分析红茶中的香气成分；利用步骤a）中记录的特征峰离子及保留时间定性出不同茶叶中含有的目标萜类化合物对映异构体，并记录其定量离子峰面积；将峰面积分别代入到步骤a）建立的工作曲线，从而计算出芳樟醇、芳樟醇氧化物（A、B、C、D）、α-松油醇、4-萜品醇、柠檬烯及α-紫罗兰酮对映异构体在不同产地红茶中的含量；将获得的数据按产地分类导入EXCEL表。

进一步的，所述步骤2）具体包括以下步骤：

a）将所有茶叶样品分为两个子集，大部分样本用于建立校正集参与建模，且校正集样本需涵盖所有的茶叶产地；剩下的小部分样本用于验证模型的准确性，作为验证集；

b）将含有手性萜类化合物含量的EXCEL数据表导入Simca-p 11.5软件，将校正集里的样本按产地分类，设为class 1-n，其中n为产地数，任意设定数字对应的产地；

c）将已知的不同产地红茶的萜类化合物含量矩阵设为自变量X，产地分类信息设为观察变量Y，通过该软件的自动拟合功能，建立PLS-DA模型；

d）对获得的PLS-DA模型进行精制，若某样本不在95%的置信区间内，则说明该样本代表性不足，应舍去该样本并对校正集进行重新拟合；拟合参数R²Y及Q²越接近1，说明该模型的预测能力越强；

e）对已建立校正集的PLS-DA模型进行200次置换检验试验，测试通过累计交叉有效性Q²为负值则说明该模型无过拟合现象，模型的可靠度高，可进行下一步的验证集样本验证；

f）使用分析软件里的预测功能，将验证集里的茶叶样品代入到已建立的PLS-DA模型中，软件自动计算验证集样品在已按产地分好的Class中的各分类变量值Y_predict；当Y_predict＞0.5，且偏差＜0.5，判定待测样本属于该类；当Y_predict＜0.5，且偏差＜0.5，判定样本不属于该类；当偏差＞0.5，表明该分类模型不稳定；若验证集中茶样的产地正确判别率达90%以上，证明该PLS-DA分类模型具有较高的预测准确度和预测稳定性。

进一步的，所述顶空固相微萃取方法为：准确称取样品1.00 g至250 mL顶空萃取瓶中，加入10.0 mL沸水冲泡，放入50 ºC水浴锅平衡5.0 min，然后插入装有DVB/CAR/PDMS萃取头的手动SPME手柄在50 ºC水浴条件下顶空萃取，萃取时间为40 min，取出后立即插入GC-MS进样口中解吸附3.0 min，同时启动仪器收集数据；

所述手性GC-MS分析方法：仪器型号：Agilent 7890A-5975C气质联用仪；气相条件：CP7500CP-Cyclodextrin为手性色谱柱；进样口温度为220 ºC，传输线温度为250 ºC；进样量为1.0 μL，分流进样，分流比为10:1；载气为高纯度氦气：纯度≥99.99％，流速为1.2 mL/min；柱温箱采用程序升温：50 ºC保持2 min，然后以2 ºC/min升到150 ºC保持10 min，再以4 ºC/min升到180 ºC保持5 min；质谱条件：电子轰击离子源；电子能量-70 eV；离子源温度220 ºC；质量扫描范围m/z 33-600 u。

本发明具有以下有益效果：1）在分析方法上首次将手性气相色谱技术运用于红茶的产地判别领域，仅需测定茶叶中数十种手性挥发性组分的含量即可建立预测模型，操作简便且排除人为因素干扰，客观反映各红茶的产地信息；2）目标物（手性萜类化合物）的提取方法方便快捷，绿色环保：仅需1克茶样和少量纯净水即可完成，避免了珍贵茶叶样品的浪费，同时对环境不造成污染；3）建模过程操作简单，仅需将目标茶样的数据信息导入simca-p软件，通过软件自动拟合即可生成其特定的分类信息表，避免了人为计算失误的风险；4）该模型预测能力强，能有效判别出多类（4类以上）红茶的产地信息。

附图说明

图1为不同产地茶叶的PLS-DA聚类效果图；

图2为PLS-DA的验证模型图；

图3为验证集样本在每个Class中的分类变量值列表图。

具体实施方式

以下结合实例及附图来对本发明做进一步的解释说明。本实例仅用于具体说明该方法，而并非对本发明的范围进行限制，任何依照本发明的教导所做出的改动或改进，均属于本发明的保护范围。

实施例1：广东英德红茶、安徽祁门红茶、云南滇红及斯里兰卡红茶的产地判别：通过对各红茶中手性萜类化合物的含量进行PLS-DA建模，从而预测出红茶的相应产地信息。

具体操作步骤：

1）收集广东英德红茶、安徽祁门红茶、云南滇红及斯里兰卡锡兰红茶各20个。

2）手性萜类化合物定量标准曲线的建立

购买市售的R-芳樟醇、芳樟醇消旋体、呋喃型芳樟醇氧化物（A、B混合物）、吡喃型芳樟醇氧化物（C、D混合物）、S-4-萜品醇、4-萜品醇消旋体、R-α-松油醇、α-松油醇消旋体、R-柠檬烯、柠檬烯消旋体及α-紫罗兰酮标准品，对上述标准品进行手性GC-MS分析，记录保留时间，确定相应特征离子峰和定量离子峰。

分析方法如下：仪器型号：Agilent 7890A-5975C气质联用仪（美国Agilent公司）。气相条件：CP7500CP-Cyclodextrin（50 m×0.25 mm×0.25 μm，美国Agilent公司）为手性色谱柱；进样口温度为220 ºC，传输线温度为250 ºC；进样量为1.0 μL，分流进样，分流比为10:1；载气为高纯度氦气（纯度≥99.99％），流速为1.2 mL/min；柱温箱采用程序升温：50 ºC保持2 min，然后以2 ºC/min升到150 ºC保持10 min，再以4 ºC/min升到180 ºC保持5min。质谱条件：电子轰击离子源；电子能量-70 eV；离子源温度220 ºC；质量扫描范围m/z33-600 u。

配置一系列浓度范围（参考范围：1 ng/g-1 μg/g，浓度梯度不少于5个）的R-芳樟醇、呋喃型芳樟醇氧化物（A、B混合物）、吡喃型芳樟醇氧化物（C、D混合物）、S-4-萜品醇、R-α-松油醇、R-柠檬烯及α-紫罗兰酮的混合标准品溶液（溶剂为色谱级无水乙醚），分别添加10 μL到已处理过的空白茶样中（挥发性物质已通过旋转蒸发仪真空蒸发），通过HS-SPME萃取香气成分后进行手性GC-MS进行分析，建立以上化合物的定量离子峰面积与浓度间的线性方程。使用该分析方法建立的线性方程，线性相关系数高达0.99以上。

在建立了上述工作曲线之后，采用相同萃取条件和GC-MS分析方法对待建模的茶样进行分析，根据特征离子峰定性目标化合物，将定量离子峰面积带入相应线性方程，计算出目标萜类化合物在茶样中的含量。将获得的化合物含量数据依照茶叶产地逐一排序，导入EXCEL表。

茶样处理条件：准确称取样品1.00 g至自制的250 mL顶空萃取瓶中，加入10.0 mL沸水冲泡，放入50 ºC水浴锅平衡5.0 min，然后插入装有DVB/CAR/PDMS萃取头的手动SPME手柄在50 ºC水浴条件下顶空萃取，萃取时间为40 min，取出后立即插入GC-MS进样口中解吸附3.0 min，同时启动仪器收集数据。

3）四个产地红茶的PLS-DA模型的建立

将所有茶叶样品（80个）分为两个子集，63个样本用于建立校正集参与建模，包括16个英德红茶、15个祁门红茶、16个滇红及16个锡兰红茶；剩下的17个样本用于验证模型的准确性，作为验证集。

将步骤2）里得到的EXCEL数据表导入Simca-p 11.5软件，将校正集里的样本按产地分类，所有英德红茶归入Class 1，所有滇红归入Class 2，所有锡兰红茶归入Class 3，所有祁门红茶归入Class 4；选择PLS-DA分析模式，通过该软件的自动拟合（Autofit）功能，建立PLS-DA模型，该模型包含5个主成分，且获得的PLS-DA模型具有较好的模型解释率和预测率：R²Y = 0.923, Q² = 0.827；通过得分图（Score Scatter Plot）发现所有参与建模的样本均分布在95%的置信区间内，且不同产地的茶叶均能得到良好的聚类效果（图1）。

为避免过拟合现象，对已建立的PLS-DA模型进行200次置换检验试验，建立验证模型，如图2所示，四个Class的R²Y值构成的回归线截距分别为0.450, 0.433, 0.415,0.402，Q²Y构成的回归线截距为-0.546, -0.585, -0.547, -0.649，所有通过随机排序计算得到的R²(cum)和Q²(cum)值均小于原始值，Q²回归直线与Y轴的截距均小于0。以上的数据充分说明了所建立的产地判别模型不存在过拟合现象，模型较为可靠。

打开软件的预测功能（Prediction）选项中的Classification，软件自动生成所有样本在每个Class内的分类变量值Y_predict，发现所有的茶样在其归属的Class内Y_predict＞0.5，且偏差＜0.5，反之在其它Class里Y_predict无限接近于0，说明该模型的回判率高达100%，进一步说明该模型具有优异的预测能力。

4）已建立PLS-DA判别模型的验证集验证

打开预测功能（Prediction）选项中的Specify功能，将验证集里的17个样本代入到PLS-DA模型的观察变量中；打开软件的预测功能（Prediction）选项中的Classification，软件自动生成所有验证集样本在每个Class内的分类变量值（Y_predict）；如图3所示，大部分样本的Y_predict＞0.5，且偏差＜0.5（显绿色），而仅有1个样本即Dianhong-1（滇红）的Y_predict虽然大于0.5，但其偏差＞0.5，说明其分类不够准确（显橙红色），由此证明验证集里的4类红茶大部分可归属至正确的Class中，其准确率高达95%，说明该模型具有较高的判别准确率和判别稳定性。

5）未知红茶样品的产地预测

委托专业人士购买具有代表性的红茶样品，且事先不透露其产地信息给操作人员，按其按照说明书步骤1-4进行操作，并预测其产地归属。实验结果表明，未知样本仅在Class 1内的Y_predict = 1.004598（>0.5）,偏差为0.108222（<0.5）,因此判定其产地归属为广东英德。经购买人证实未知茶样为英德红茶，证明该预测准确，再一次证明所建模型的准确性高，具有广阔的应用前景。

综上所述，采用手性定量分析技术，仅需获得芳樟醇、芳樟醇氧化物（A、B、C、D）、4-萜品醇、α-松油醇、柠檬烯及α-紫罗兰酮9种萜类化合物对映异构体的含量数据，结合偏最小二乘法判别分析法即可建立不同产地红茶的判别模型。本实施例中提到的模型参数及数据处理方法仅适用于以上所述的四个产地的红茶样品，若有更多的产地或不同的产地分类，建模思路与本发明基本一致，可参照本发明中的判别方法进行建模，所产生的功能未超出本发明的技术方案范围时，均属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种基于手性定量分析技术的红茶产地判别方法，其特征包括以下步骤：

1）不同产地红茶中手性萜类化合物的含量测定

收集各不少于5个的不同产地的红茶样品，测定芳樟醇、芳樟醇氧化物（A、B、C、D）、α-松油醇、4-萜品醇、柠檬烯及α-紫罗兰酮对映异构体在红茶中的含量，根据茶叶产地对茶叶进行分组，依次按列发布所获得的萜类化合物对映异构体含量，导入EXCEL电子表格中；

2）不同产地红茶的PLS-DA模型的建立及验证

将萜类化合物对映异构体的含量数据导入Simca-p 11.5软件，选择校正集样本，以萜类化合物含量矩阵为自变量，产地分类信息为观察变量，建立校正集的偏最小二乘法判别分析PLS-DA模型；对已建立的PLS-DA模型进行置换检验试验，验证模型是否存在“过拟合”现象；将验证集里的茶叶样品代入到PLS-DA模型中，检验其判别准确率；

3）未知红茶样品的产地预测

依照步骤1）对未知产地的红茶样品中手性萜类化合物进行定量分析，将数据导入已建立的PLS-DA预测模型中，依照步骤2）代入已建立的红茶产地判别模型中，计算该茶样在每个Class中的分类变量值Y_predict，当某Class中的Y_predict＞0.5，且偏差＜0.5，则判定该红茶属于该Class对应的产地。

2.根据权利要求1所述的一种基于手性定量分析技术的红茶产地判别方法，其特征在于所述步骤1）具体包括以下步骤：

a）手性萜类化合物的定量工作曲线绘制

采用手性气相色谱-质谱联用技术分离芳樟醇、芳樟醇氧化物（A、B、C、D）、4-萜品醇、α-松油醇、柠檬烯及α-紫罗兰酮等挥发性萜类化合物标准品的相应对映异构体，记录每个化合物的保留时间、特征峰离子及定量离子；配置一系列不同浓度梯度的上述化合物的混合溶液，分别取10 μL于已预处理过的空白茶样中，顶空固相微萃取法结合手性气质联用技术分析空白茶样中挥发出的混合标准品；建立各萜类化合物对映异构体浓度与定量离子峰面积间的线性方程，从而绘制出芳樟醇、芳樟醇氧化物（A、B、C、D）、4-萜品醇、α-松油醇、柠檬烯及α-紫罗兰酮对映异构体的定量工作曲线；

b）不同产地中红茶样品中手性萜类化合物的含量测定

采用与步骤a）相同的顶空固相微萃取条件萃取不同产地红茶的香气成分，依照与步骤a）相同的GC-MS方法分析红茶中的香气成分；利用步骤a）中记录的特征峰离子及保留时间定性出不同茶叶中含有的目标萜类化合物对映异构体，并记录其定量离子峰面积；将峰面积分别代入到步骤a）建立的工作曲线，从而计算出芳樟醇、芳樟醇氧化物（A、B、C、D）、α-松油醇、4-萜品醇、柠檬烯及α-紫罗兰酮对映异构体在不同产地红茶中的含量；将获得的数据按产地分类导入EXCEL表。

3.根据权利要求1所述的一种基于手性定量分析技术的红茶产地判别方法，其特征在于所述步骤2）具体包括以下步骤：

a）将所有茶叶样品分为两个子集，大部分样本用于建立校正集参与建模，且校正集样本需涵盖所有的茶叶产地；剩下的小部分样本用于验证模型的准确性，作为验证集；

b）将含有手性萜类化合物含量的EXCEL数据表导入Simca-p 11.5软件，将校正集里的样本按产地分类，设为class 1-n，其中n为产地数，任意设定数字对应的产地；

c）将已知的不同产地红茶的萜类化合物含量矩阵设为自变量X，产地分类信息设为观察变量Y，通过该软件的自动拟合功能，建立PLS-DA模型；

d）对获得的PLS-DA模型进行精制，若某样本不在95%的置信区间内，则说明该样本代表性不足，应舍去该样本并对校正集进行重新拟合；拟合参数R²Y及Q²越接近1，说明该模型的预测能力越强；

e）对已建立校正集的PLS-DA模型进行200次置换检验试验，测试通过累计交叉有效性Q²为负值则说明该模型无过拟合现象，模型的可靠度高，可进行下一步的验证集样本验证；

f）使用分析软件里的预测功能，将验证集里的茶叶样品代入到已建立的PLS-DA模型中，软件自动计算验证集样品在已按产地分好的Class中的各分类变量值Y_predict；当Y_predict＞0.5，且偏差＜0.5，判定待测样本属于该类；当Y_predict＜0.5，且偏差＜0.5，判定样本不属于该类；当偏差＞0.5，表明该分类模型不稳定；若验证集中茶样的产地正确判别率达90%以上，证明该PLS-DA分类模型具有较高的预测准确度和预测稳定性。

4.根据权利要求2所述的一种基于手性定量分析技术的红茶产地判别方法，其特征在于所述顶空固相微萃取方法为：准确称取样品1.00 g至250 mL顶空萃取瓶中，加入10.0 mL沸水冲泡，放入50 ºC水浴锅平衡5.0 min，然后插入装有DVB/CAR/PDMS萃取头的手动SPME手柄在50 ºC水浴条件下顶空萃取，萃取时间为40 min，取出后立即插入GC-MS进样口中解吸附3.0 min，同时启动仪器收集数据；

所述手性GC-MS分析方法：仪器型号：Agilent 7890A-5975C气质联用仪；气相条件：CP7500CP-Cyclodextrin为手性色谱柱；进样口温度为220 ºC，传输线温度为250 ºC；进样量为1.0 μL，分流进样，分流比为10:1；载气为高纯度氦气：纯度≥99.99％，流速为1.2 mL/min；柱温箱采用程序升温：50 ºC保持2 min，然后以2 ºC/min升到150 ºC保持10 min，再以4 ºC/min升到180 ºC保持5 min；质谱条件：电子轰击离子源；电子能量-70 eV；离子源温度220 ºC；质量扫描范围m/z 33-600 u。