CN106868159B

CN106868159B - 一种用于鉴定番茄萼片形态的ssr分子标记、引物及应用

Info

Publication number: CN106868159B
Application number: CN201710165646.9A
Authority: CN
Inventors: 梁燕; 刘婧仪; 张颜; 吴浪; 赵贵叶
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2017-03-20
Filing date: 2017-03-20
Publication date: 2020-12-08
Anticipated expiration: 2037-03-20
Also published as: CN106868159A

Abstract

本发明公开了一种鉴定番茄萼片形态的SSR分子标记引物，为：正向引物：TGGAAAGAAGCAGTAGCATTG；反向引物：CAACGAACATCCTCCGTTCT。同时本发明还公开了SSR分子标记及鉴定番茄萼片形态的方法。该SSR分子标记适用于番茄外观形态种质资源的遗传评价、种质鉴定及分子标记辅助育种研究，重复性好、可靠性高。为培育出新型外观形态的番茄新品种提供行之有效的鉴定方法，从而增加鲜食番茄外观多样性及美观度，同时本发明为番茄外观形态种质资源的遗传评价提供新的依据。

Description

一种用于鉴定番茄萼片形态的SSR分子标记、引物及应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于鉴定番茄萼片形态的SSR分子标记、引物及应用。

背景技术

番茄是目前世界上栽培和消费最广泛的蔬菜作物，萼片是番茄花和果实的重要组成部分，也是重要的商品品质之一。健康平整的萼片不仅能够体现出果实的新鲜度、增加其美观度，而且在贮运过程中平展的萼片有助于减少果实在运输过程中的机械损伤，从而保证其良好的外观品质、增加其商品价值，所以萼片形态特征的研究显得尤为重要。

一般番茄萼片形态有基平、上翘、直立、上卷四种类型，我们发现了一种新的番茄萼片包被形态，该形态进一步提升了番茄的商品品质。但番茄萼片包被形态的遗传规律还不是很清楚，控制形态基因的遗传定位也有待深入研究。SSR分子标记技术是研究植物分子遗传水平差异的一项重要技术，根据PCR扩增产物的条带数、片段大小可以找到有差异的基因组EST。

但是，并没有相关文献报道用于鉴定番茄萼片形态的SSR分子标记。

发明内容

本发明提供的一种用于鉴定番茄萼片形态的SSR分子标记、引物及应用，适用于番茄外观形态种质资源的遗传评价、种质鉴定及分子标记辅助育种研究，重复性好、可靠性高。

本发明提供了一种用于鉴定番茄萼片形态的SSR分子标记引物，所述SSR分子标记引物的序列如下：

正向引物：5’-TGGAAAGAAGCAGTAGCATTG-3’；

反向引物：5’-CAACGAACATCCTCCGTTCT-3’。

本发明还提供了一种利用上述SSR分子标记引物扩增得到的用于鉴定番茄萼片形态的SSR分子标记，所述SSR分子标记为SEQ ID NO.3核苷酸序列和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，其中SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列是：5’-TGGAAAGAAGCAGTAGGCATTGTAAAGAAGAAACATCTAGATATACTCTAGAATAACTAAAACCCTGTTTTCTCTTTCCTTTTTTCTTCTTCTTCTTCTCTCTCTCTACTGTTCCGTCGTCTGCTCATTTTTATCTTTCAGTATGAGTAAGGAGAAAGAACGGAGGATGTTCGTTG-3’；

SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列是：

5’-TGGAAAGAAGCAGTAGGCATTGTAAAGAAGAAACATCTAGATATACTCTAGAATAACTAAAACCCTGTTTTCTCTTTCCTTTTTTCTTCTTCTTCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTACTGTTCCGTCGTCTGCTCATTTTTATCTTTCAGTATGAGTAAGGAGAAAGAACGGAGGATGTTCGTTG-3’。

本发明的还提供了上述用于鉴定番茄萼片形态的SSR分子标记引物在番茄分子标记辅助选择中的应用。

本发明的还提供了上述用于鉴定番茄萼片形态的SSR分子标记在番茄分子标记辅助选择中的应用

本发明的还提供了一种应用上述SSR分子标记引物鉴定番茄萼片形态的方法，包括以下步骤：

步骤1，提取待检测番茄材料的基因组DNA；

步骤2，PCR扩增：

a.反应体系：10μL体系，各组分物质的含量分别为:1μL模板DNA、0.5μL所述正向引物、0.5μL所述反向引物、5μL 2×TaqMasterMix、ddH₂O补齐10μL，混匀，离心；

b.扩增程序：包括第一循环程序和第二循环程序，其中第一循环程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min；55-70℃退火45s，每个循环退火温度降低0.5℃；72℃延伸45s；20个循环后进行第二循环程序；

第二循环程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min；45-60℃退火45s，每个循环退火温度降低0.5℃；72℃延伸45s；15个循环；72℃延伸7min；最后4℃保存；

步骤3，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：

将步骤2的扩增产物与等体积的上样缓冲液混合，95℃变性5min，之后在DNA测序电泳仪上进行6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，65W条件下电泳1.5小时，电泳结束后，进行银染，并观察扩增结果；

其中，银染时使用的银染液配方为：1gAgNO₃、100ml无水乙醇、10ml冰醋酸加超纯水定容至1L；

步骤4，结果判断：扩增结果中如果能够检测到176bp、184bp两条带，则待检测中含有萼片包被突变体的概率为95％以上。

本发明的目的是针对已有序列但功能未知的番茄SSR分子标记，利用新发现的番茄萼片包被突变体及其野生型材料，利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，开发出能有效鉴定番茄萼片形态的SSR分子标记。

本发明SSR分子标记差异性分析，筛选到鉴定番茄萼片形态的分子标记，找到新型遗传背景番茄材料在分子遗传水平的多样性，掘出SSR32分子标记的功能，为番茄外观形态育种提供资源，该SSR分子标记适用于番茄外观形态种质资源的遗传评价、种质鉴定及分子标记辅助育种研究，重复性好、可靠性高。为培育出新型外观形态的番茄新品种提供行之有效的鉴定方法，从而增加鲜食番茄外观多样性及美观度，同时本发明为番茄外观形态种质资源的遗传评价提供新的依据。

附图说明

图1是待检测番茄萼片包被野生型及番茄萼片包被突变体的外观图；

其中，图1A为萼片包被野生型的外观图，图1B为番茄萼片包被突变体的外观图；

图2是本发明SSR分子标记在待检测番茄材料中的扩增结果；

其中，M泳道为Mark，1-10号泳道分别为10个番茄萼片包被野生型样品，11-20号泳道分别为10个番茄萼片包被突变体样品。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供的一种鉴定番茄萼片形态的SSR分子标记引物，其序列如下：

正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，为：

5’-TGGAAAGAAGCAGTAGCATTG-3’；

反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，为：

5’-CAACGAACATCCTCCGTTCT-3’。

本发明SSR分子标记引物信息如表1所示。

表1SSR分子标记引物信息

标记	SSR
		染色体	2
图位(cM)	58
		重叠基因	Solyc02g082140.2
正向引物	5’-TGGAAAGAAGCAGTAGCATTG-3’
		反向引物	5’-CAACGAACATCCTCCGTTCT-3’

本发明还提供了一种利用上述SSR分子标记引物扩增得到的用于鉴定番茄萼片形态的SSR分子标记，所述SSR分子标记为SEQ ID NO.3核苷酸序列和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，其中SEQ ID NO.3核苷酸序列是：

5’-TGGAAAGAAGCAGTAGGCATTGTAAAGAAGAAACATCTAGATATACTCTAGAATAACTAAAACCCTGTTTTCTCTTTCCTTTTTTCTTCTTCTTCTTCTCTCTCTCTACTGTTCCGTCGTCTGCTCATTTTTATCTTTCAGTATGAGTAAGGAGAAAGAACGGAGGATGTTCGTTG-3’。

SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列是：

具体按照以下方法鉴定番茄萼片形态：

一、番茄材料种植

本研究使用的番茄材料为本研究组得到的番茄萼片包被野生型及番茄萼片包被突变体，其外观视图见图1，图1A为萼片包被野生型的外观图，图1B为番茄萼片包被突变体的外观图，萼片包被突变体为萼片向下弯曲、包裹果实生长，萼片包被野生型为萼片平展生长。上述番茄材料定植于西北农林科技大学园艺学院试验大棚内，每份材料定植12株，株距35cm，行距60cm。

二、鉴定番茄萼片形态

步骤1，提取待检测番茄材料的基因组DNA；

采用改良CTAB法提取待检测番茄材料的基因组DNA，所述改良CTAB法参考DNA提取文献的记载，所述DNA提取文献的出处为：孙亚东.2012.番茄果实主要品质性状的动态变化及QTL定位.[博士学位论文].杨陵：西北农林科技大学。

步骤2，PCR扩增：

a.反应体系：10μL体系，各组分物质的含量分别为:1μL模板DNA、0.5μL正向引物、0.5μL反向引物、5μL 2×TaqMasterMix、ddH₂O补齐10μL，混匀，离心，

其中，正向引物的序列为TGGAAAGAAGCAGTAGCATTG(SEQ ID NO.1所示)，

反向引物的序列为CAACGAACATCCTCCGTTCT(SEQ ID NO.2所示)；

其中模板DNA是待检测番茄材料的基因组DNA，浓度为30ng/μL，正向引物和反向引物的浓度均为10μmol/L。

b.扩增程序：

利用降落(Touchdown)PCR，包括第一循环程序和第二循环程序，其中第一循环程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min；55-70℃退火45s，每个循环退火温度降低0.5℃；72℃延伸45s；20个循环后进行第二循环程序；

步骤3，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：

将步骤2的扩增产物与等体积的上样缓冲液混合，95℃变性5min，之后在DNA测序电泳仪上进行6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，65W条件下电泳1.5小时，电泳结束后，进行银染，并观察扩增结果；具体步骤如下：

步骤3.1，电泳试剂配制：

(1)0.5mol/LEDTA(pH8.0)配制：18.61g EDTA加蒸馏水80ml，磁力搅拌，用10mol/LNaOH(或固体NaOH)调节溶液至pH＝8.0，最终定容至100ml，121℃、25min高压灭菌，备用。

(2)10×TBE配制：108g Tris、55g硼酸、40ml的0.5mol/LEDTA(pH8.0)、加水定容至1L；

1×TBE缓冲液配制：10×TBE稀释10倍；

(3)6％聚丙烯酰胺凝胶配制：57g丙烯酰胺、3g甲叉双丙烯酰胺、100ml 10×TBE、420.24g尿素、加水定容至1L，加热搅拌溶解。滤纸过滤，4℃避光保存。

(4)凝胶的上样缓冲液(Loading Buffer)配制：49ml去离子甲酰胺、1ml 0.5mol/LEDTA(pH8.0)、0.05g二甲苯青FF、0.05g溴酚蓝，混匀。

(5)10％过硫酸铵：1g过硫酸铵，加水定容至10ml，4℃保存。

(6)0.5％亲和硅烷：亲和硅烷15μL、冰醋酸15μL、无水乙醇3mL，混匀，现配现用。

(7)2％剥离硅烷：49ml氯仿(分析纯)、1ml剥离硅烷，混匀，室温保存。

步骤3.2，银染试剂配制

(1)银染液配方为：1gAgNO₃、100ml无水乙醇、10ml冰醋酸加超纯水定容至1L；

(2)显影液的配方为：30g氢氧化钠、10ml甲醛、2L蒸馏水，混匀。

步骤3.3，具体操作

步骤3.3.1，扩增产物变性：PCR扩增产物中加入5μL上样缓冲液，95℃变性5min后立即置于冰上待用；

步骤3.3.2，变性聚丙烯酰胺凝胶制备

(1)玻璃板清洗：用洗涤剂将玻璃板洗净，用自来水彻底冲洗，用酒精擦净，晾干，必要时用KOH/甲醇溶液清洗板上的旧污渍。

(2)长板涂上0.5％亲和硅烷3mL，用纸巾涂抹均匀，晾干。短板涂上2％剥离硅烷mL，用纸巾涂抹均匀，晾干。在玻璃板边缘放置边条，合上两块玻璃板使两个涂抹硅烷面相对朝内，用夹子夹住两块玻璃板边缘，放置于实验台上，使灌胶口一侧略翘起。

(3)凝胶制备：将6％聚丙烯酰胺凝胶60ml、TEMED 50μL、10％APS 500μL置于灌胶瓶中，充分混匀。

(4)灌胶:把胶沿灌胶口缓缓灌入两玻璃板空隙间，防止出现气泡，灌胶完毕后在灌胶口插入梳子，梳齿朝外，插入梳子时需注意防止气泡产生。凝胶聚合1h以上。

步骤3.3.3，电泳

(1)取下玻璃板上的铁夹，将胶板安装在电泳槽内，利用1×TBE缓冲液将上下槽加满。下槽缓冲液高度应刚好没过胶的下边缘，上槽液缓冲液高度应刚好没过短板上沿。

(2)用洗耳球吹净点样孔，轻轻地将梳齿插入加样孔，向下推至刚好穿透凝胶表面。

(3)取2-5μL变性后的扩增产物加样于点样孔，65W功率电泳1.5h，电泳槽为北京六一厂DYCZ-20E DNA序列分析电泳槽，至溴酚蓝染料到底时电泳结束。

(4)回收电泳缓冲液，取下玻璃板平放置于桌面，小心将两块玻璃分开。

步骤3.3.4，银染

(1)漂洗：将带胶的长板放入蒸馏水中，胶面朝上，漂洗两次去除电泳缓冲液。

(2)改良银染：将玻璃板放入银染液中，胶面朝上，轻遥振荡约15min，直至二甲苯青颜色褪去，取出玻璃板用蒸馏水漂洗2次。

(3)显影：将玻璃板放入显影液中，缓慢振荡约7-10min，直至出现清晰条带。取出玻璃板用水冲洗，用数码相机对凝胶进行照相。

步骤4，结果判断：扩增结果中如果能够检测到176bp、184bp两条带，则待检测中含有萼片包被突变体的概率为95％以上；

其中176bp条带的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，184bp条带的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。

我们分别对10个番茄萼片包被样品和10个番茄萼片包被突变体样品进行电泳实验，结果如图2所示，其中，M泳道为Mark，1-10号泳道分别为10个番茄萼片包被野生型样品，11-20号泳道分别为10个番茄萼片包被突变体样品。由图2可以明显看出，1-10号泳道只有176bp一条带，而11-20号泳道有176bp、184bp两条带，番茄萼片包被突变体的检出率为100％，大于95％。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 西北农林科技大学园艺学院

<120> 一种用于鉴定番茄萼片形态的SSR分子标记、引物及应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tggaaagaag cagtagcatt g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caacgaacat cctccgttct 20

<210> 3

<211> 176

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tggaaagaag cagtaggcat tgtaaagaag aaacatctag atatactcta gaataactaa 60

aaccctgttt tctctttcct tttttcttct tcttcttctc tctctctact gttccgtcgt 120

ctgctcattt ttatctttca gtatgagtaa ggagaaagaa cggaggatgt tcgttg 176

<210> 4

<211> 184

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tggaaagaag cagtaggcat tgtaaagaag aaacatctag atatactcta gaataactaa 60

aaccctgttt tctctttcct tttttcttct tcttcttctc tctctctctc tctctactgt 120

tccgtcgtct gctcattttt atctttcagt atgagtaagg agaaagaacg gaggatgttc 180

gttg 184

Claims

1.一种用于鉴定番茄萼片形态的SSR分子标记，其特征在于，所述用于鉴定番茄萼片形态的SSR分子标记为SEQ ID NO.3核苷酸序列和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，以待检测番茄材料的基因组DNA为模板，如果扩增得到SEQ ID NO.3所示序列，则番茄萼片为基平形态，如果扩增得到SEQ ID NO.4所示序列，则番茄萼片为包被形态，其中，

SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列是：

5’-TGGAAAGAAGCAGTAGGCATTGTAAAGAAGAAACATCTAGATATACTCTAGAATAACTAAAACCCTGTTTTCTCTTTCCTTTTTTCTTCTTCTTCTTCTCTCTCTCTACTGTTCCGTCGTCTGCTCATTTTTATCTTTCAGTATGAGTAAGGAGAAAGAACGGAGGATGTTCGTTG-3’；

SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列是：

5’-TGGAAAGAAGCAGTAGGCATTGTAAAGAAGAAACATCTAGATATACTCTAGAATAACTAAAACCCTGTTTTCTCTTTCCTTTTTTCTTCTTCTTCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTACTGTTCCGTCGTCTGCTCATTTTTATCTTTCAGTATGAGTAAGGAGAAAGAACGGAGGATGTTCGTTG-3’；

所述分子标记SSR分子标记可应用于检测萼片包被突变体。

2.根据权利要求1所述的用于鉴定番茄萼片形态的SSR分子标记在番茄分子标记辅助选择中的应用。