CN106857501A - 用于保存大鼠肝匀浆s9的储存液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液及其制备方法，每1L所述储存液中，原料组分包括：200～260mL丙三醇、300～400mL聚乙二醇、0.5～2mmol氯化钙和15～25mmol Tris‑HCl，余量为水；制备方法包括如下步骤：将氯化钙加入Tris‑HCl缓冲液中，待混合均匀后加入其他原料组分，搅拌均匀，得到储存液。本发明提供的保存大鼠肝匀浆S9的储存液，可以在保证大鼠肝匀浆S9活性基本不变的前提下，延长大鼠肝匀浆S9的保存时间，从而避免在使用的过程中反复的冻融而影响其活性；且本发明提供的保存大鼠肝匀浆S9的储存液的制备方法简单，生产成本低。

Description

用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物技术领域，具体涉及一种用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液及其制备方法。

背景技术

大鼠肝匀浆S9是肝匀浆液的去线粒体上清液，包含了大量的CYPs等药物代谢酶，主要用于研究化合物的代谢和药物药物相互作用。目前国内外保存S9主要是保存于液氮或-80℃冰箱中，然而在具体使用的过程中，反复的冻融会造成酶的活性大大降低，从而不利于大鼠肝匀浆S9的充分利用。因此，需要研究开发新型的用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液，以便能够在相对较高的温度长时间保存大鼠肝匀浆S9，而且能够保证原有的活性。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液及其制备方法，以在保证大鼠肝匀浆S9活性基本不变的前提下，延长大鼠肝匀浆S9的保存时间，从而避免在使用的过程中反复的冻融而影响其活性；制备方法简单，生产成本低。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

第一方面，本发明提供了一种用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液，其原料组分按重量份计，包括：200～260mL丙三醇、300～400mL聚乙二醇、0.5～2mmol氯化钙和15～25mmolTris-HCl，余量为水。

在本发明的进一步实施方式中，原料组分还包括：35～50g二十碳五烯酸和14～18g乳糖酸。

在本发明的进一步实施方式中，Tris-HCl的pH值为7.4；水为去离子水。

在本发明的进一步实施方式中，聚乙二醇的相对分子质量为7500～8500。

第二方面，本发明提供了上述用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液的制备方法，包括如下步骤：将氯化钙加入Tris-HCl中，待混合均匀后加入其他原料组分，搅拌均匀，得到储存液。

第三方面，本发明提供了用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液在保存大鼠肝匀浆S9中的应用，包括如下步骤：将大鼠肝匀浆S9和储存液以(1.0～1.2):1的体积比混合均匀，然后于-20℃～4℃的条件下保存。

第四方面，本发明提供了制备上述大鼠肝匀浆S9的诱导剂，诱导剂的原料组分按重量份计包括：苯巴比妥4～7重量份、β-萘黄酮2～4重量份和磺吡酮15～20重量份。

在本发明的进一步实施方式中，诱导剂的原料组分还包括川穹提取物6～8重量份；川穹提取物的制备方法包括如下步骤：将粉碎至60～100目的川穹和质量分数为60％～70％的乙醇水溶液以1:(8～10)的质量比混合均匀，然后在70～80℃下浸泡10～12h，浸泡的pH值为4.6～5.2；将浸泡得到的产物在35～40℃下超声提取5～8h，将超声提取得到的产物过滤，收集滤液并进行脱色处理；将脱色处理后的产物浓缩成相对密度为1.05～1.25的浸膏，得到川穹提取物。

第五方面，本发明提供了利用上述诱导剂诱导制备大鼠肝匀浆S9的方法，包括如下步骤：S1：将诱导剂用0.9％氯化钠注射液配制成诱导剂质量浓度为30～35mg/mL的混合溶液；S2：将混合溶液对大鼠按每天每只2.0～2.5mL/kg腹腔注射，连续注射3～4d后断头处死；其中，在处死前12h禁食不禁水；S3：在无菌条件下取出大鼠肝脏，去除肝脏的结缔组织后洗涤剪碎，然后采用组织匀浆器制成肝匀浆；S4：将肝匀浆离心，收集上清液，即为大鼠肝匀浆S9。

第六方面，本发明提供了采用上述诱导制备大鼠肝匀浆S9的方法制备得到的大鼠肝匀浆S9。

本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：(1)本发明提供的保存大鼠肝匀浆S9的储存液，可以在保证大鼠肝匀浆S9活性基本不变的前提下，延长大鼠肝匀浆S9的保存时间，从而避免在使用的过程中反复的冻融而影响其活性；(2)本发明提供的保存大鼠肝匀浆S9的储存液中，包括聚乙二醇，聚乙二醇MW 8000是一大分子有机物质，为非渗透性低温保护剂不能渗入细胞内，其保护细胞的机制尚未充分阐明，目前将它用于肝细胞低温保存的研究尚鲜见报道，本发明经过大量的实验，发现其在大鼠肝匀浆S9的低温保存过程中，能维持大鼠肝匀浆S9活性长时间基本不变；(3)本发明提供的保存大鼠肝匀浆S9的储存液中，包括二十碳五烯酸，二十碳五烯酸属于omega-3多不饱和脂肪酸，它能改善胃肠外营养相关性肝病预后；减少炎症介质产生、降低黏附分子的表达，从而起到直接或间接抗炎的作用；预防脂肪肝小鼠缺血再灌注损伤和微循环衰竭的作用减轻小鼠化学性肝损伤和梗阻性黄疸肝细胞损伤的作用；omega-3多不饱和脂肪酸还具有改善大鼠缺血再灌注损伤，促进肝切除后肝再生的作用，目前将它用于肝细胞低温保存的研究并无报道，本发明经过大量的实验，欣喜的发现其在大鼠肝匀浆S9的低温保存过程中，通过在保存液中同时添加二十碳五烯酸和乳糖酸，能显著延长大鼠肝匀浆S9在-20℃和4℃的保存时间；但是单独添加二十碳五烯酸或乳糖酸，并没有显著的效果；(4)本发明提供的保存大鼠肝匀浆S9的储存液的制备方法简单，生产成本低。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

实施例一

本实施例提供一种用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液，原料组分按重量份计，包括：230mL丙三醇、350mL聚乙二醇、1mmol氯化钙和20mmol Tris-HCl，余量为去离子水；其中，Tris-HCl的pH值为7.4；聚乙二醇的相对分子质量为8000。

按上述的原料，采用本发明提供的用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液的制备方法，制备储存液：将氯化钙加入Tris-HCl中，待混合均匀后加入其他原料组分，搅拌均匀，得到储存液。

实施例二

本实施例提供一种用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液，原料组分按重量份计，包括：200mL丙三醇、300mL聚乙二醇、0.5mmol氯化钙和25mmol Tris-HCl，余量为去离子水；其中，Tris-HCl的pH值为7.4；聚乙二醇的相对分子质量为7500。

按上述的原料，采用本发明提供的用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液的制备方法，制备储存液：将氯化钙加入Tris-HCl中，待混合均匀后加入其他原料组分，搅拌均匀，得到储存液。

实施例三

本实施例提供一种用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液，原料组分按重量份计，包括：260mL丙三醇、400mL聚乙二醇、2mmol氯化钙和15mmol Tris-HCl，余量为去离子水；其中，Tris-HCl的pH值为7.4；聚乙二醇的相对分子质量为8500。

按上述的原料，采用本发明提供的用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液的制备方法，制备储存液：将氯化钙加入Tris-HCl中，待混合均匀后加入其他原料组分，搅拌均匀，得到储存液。

实施例四

本实施例提供一种用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液，原料组分按重量份计，包括：230mL丙三醇、350mL聚乙二醇、1mmol氯化钙、20mmol Tris-HCl、40g二十碳五烯酸和16g乳糖酸，余量为去离子水；其中，Tris-HCl的pH值为7.4；聚乙二醇的相对分子质量为8000。

按上述的原料，采用本发明提供的用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液的制备方法，制备储存液：将氯化钙加入Tris-HCl中，待混合均匀后加入其他原料组分，搅拌均匀，得到储存液。

实施例五

本实施例提供一种用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液，原料组分按重量份计，包括：200mL丙三醇、300mL聚乙二醇、0.5mmol氯化钙、25mmol Tris-HCl、35g二十碳五烯酸和14g乳糖酸，余量为去离子水；其中，Tris-HCl的pH值为7.4；聚乙二醇的相对分子质量为7500。

按上述的原料，采用本发明提供的用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液的制备方法，制备储存液：将氯化钙加入Tris-HCl中，待混合均匀后加入其他原料组分，搅拌均匀，得到储存液。

实施例六

本实施例提供一种用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液，原料组分按重量份计，包括：260mL丙三醇、400mL聚乙二醇、2mmol氯化钙、15mmol Tris-HCl、50g二十碳五烯酸和18g乳糖酸，余量为去离子水；其中，Tris-HCl的pH值为7.4；聚乙二醇的相对分子质量为8500。

按上述的原料，采用本发明提供的用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液的制备方法，制备储存液：将氯化钙加入Tris-HCl中，待混合均匀后加入其他原料组分，搅拌均匀，得到储存液。

对比例一

本对比例提供一种储存液，原料组分按重量份计，包括：230mL丙三醇、350mL聚乙二醇、1mmol氯化钙、20mmol Tris-HCl和40g二十碳五烯酸，余量为去离子水；其中，Tris-HCl的pH值为7.4；聚乙二醇的相对分子质量为8000。

制备方法：将氯化钙加入Tris-HCl中，待混合均匀后加入其他原料组分，搅拌均匀，得到储存液。

对比例二

本对比例提供一种储存液，原料组分按重量份计，包括：230mL丙三醇、350mL聚乙二醇、1mmol氯化钙、20mmol Tris-HCl和16g乳糖酸，余量为去离子水；其中，Tris-HCl的pH值为7.4；聚乙二醇的相对分子质量为8000。

制备方法：将氯化钙加入Tris-HCl中，待混合均匀后加入其他原料组分，搅拌均匀，得到储存液。

对比例三

本对比例提供一种储存液，原料组分按重量份计，包括：500mL丙三醇、1mmol氯化钙和20mmol Tris-HCl，余量为去离子水；其中，Tris-HCl的pH值为7.4。

制备方法：将氯化钙加入Tris-HCl中，待混合均匀后加入其他原料组分，搅拌均匀，得到储存液。

实施例七

本实施例提供一种诱导制备大鼠肝匀浆S9的诱导剂，原料组分按重量份计包括：苯巴比妥4重量份、β-萘黄酮2重量份和磺吡酮15重量份。

采用上述诱导剂和本发明提供的诱导制备大鼠肝匀浆S9的方法，制备大鼠肝匀浆S9，包括如下步骤：

S1：将诱导剂用0.9％氯化钠注射液配制成诱导剂质量浓度为30mg/mL的混合溶液；

S2：将混合溶液对大鼠按每天每只2.0mL/kg腹腔注射，连续注射3d后断头处死；其中，在处死前12h禁食不禁水；

S3：在无菌条件下取出大鼠肝脏，去除肝脏的结缔组织后洗涤剪碎，然后采用组织匀浆器制成肝匀浆；

S4：将肝匀浆离心，收集上清液，即为大鼠肝匀浆S9。

实施例八

本实施例提供一种诱导制备大鼠肝匀浆S9的诱导剂，原料组分按重量份计包括：苯巴比妥7重量份、β-萘黄酮4重量份和磺吡酮20重量份。

采用上述诱导剂和本发明提供的诱导制备大鼠肝匀浆S9的方法，制备大鼠肝匀浆S9，包括如下步骤：

S1：将诱导剂用0.9％氯化钠注射液配制成诱导剂质量浓度为35mg/mL的混合溶液；

S2：将混合溶液对大鼠按每天每只2.5mL/kg腹腔注射，连续注射4d后断头处死；其中，在处死前12h禁食不禁水；

S3：在无菌条件下取出大鼠肝脏，去除肝脏的结缔组织后洗涤剪碎，然后采用组织匀浆器制成肝匀浆；

S4：将肝匀浆离心，收集上清液，即为大鼠肝匀浆S9。

实施例九

本实施例提供一种诱导制备大鼠肝匀浆S9的诱导剂，原料组分按重量份计包括：苯巴比妥4重量份、β-萘黄酮2重量份、磺吡酮15重量份和川穹提取物6重量份；川穹提取物的制备方法包括如下步骤：将粉碎至60～100目的川穹和质量分数为60％的乙醇水溶液以1:8的质量比混合均匀，然后在70℃下浸泡10h，浸泡的pH值为4.6；将浸泡得到的产物在35℃下超声提取5h，将超声提取得到的产物过滤，收集滤液并进行脱色处理；将脱色处理后的产物浓缩成相对密度为1.05的浸膏，得到川穹提取物。

采用上述诱导剂和本发明提供的诱导制备大鼠肝匀浆S9的方法，制备大鼠肝匀浆S9，包括如下步骤：

S1：将诱导剂用0.9％氯化钠注射液配制成诱导剂质量浓度为30mg/mL的混合溶液；

S2：将混合溶液对大鼠按每天每只2.0mL/kg腹腔注射，连续注射3d后断头处死；其中，在处死前12h禁食不禁水；

S3：在无菌条件下取出大鼠肝脏，去除肝脏的结缔组织后洗涤剪碎，然后采用组织匀浆器制成肝匀浆；

S4：将肝匀浆离心，收集上清液，即为大鼠肝匀浆S9。

实施例十

本实施例提供一种诱导制备大鼠肝匀浆S9的诱导剂，原料组分按重量份计包括：苯巴比妥7重量份、β-萘黄酮4重量份、磺吡酮20重量份和川穹提取物8重量份；川穹提取物的制备方法包括如下步骤：将粉碎至60～100目的川穹和质量分数为70％的乙醇水溶液以1:10的质量比混合均匀，然后在80℃下浸泡12h，浸泡的pH值为5.2；将浸泡得到的产物在40℃下超声提取8h，将超声提取得到的产物过滤，收集滤液并进行脱色处理；将脱色处理后的产物浓缩成相对密度为1.25的浸膏，得到川穹提取物。

采用上述诱导剂和本发明提供的诱导制备大鼠肝匀浆S9的方法，制备大鼠肝匀浆S9，包括如下步骤：

S1：将诱导剂用0.9％氯化钠注射液配制成诱导剂质量浓度为35mg/mL的混合溶液；

S2：将混合溶液对大鼠按每天每只2.5mL/kg腹腔注射，连续注射4d后断头处死；其中，在处死前12h禁食不禁水；

S3：在无菌条件下取出大鼠肝脏，去除肝脏的结缔组织后洗涤剪碎，然后采用组织匀浆器制成肝匀浆；

S4：将肝匀浆离心，收集上清液，即为大鼠肝匀浆S9。

将本发明实施例一至实施例六、对比例一、对比例二和对比例三制备得到的储存液，通过功能学试验来系统评价其效果。

Ames试验

储存液的使用方法：将市售的大鼠肝匀浆S9(多氯联苯诱导)分别和实施例一至实施例六、对比例一、对比例二和对比例三制备得到的储存液以1:1的体积比混合均匀，记为A-H组大鼠肝匀浆S9储存液。将A组大鼠肝匀浆S9储存液分为A1组和A2组，分别储存于4℃和-20℃的冰箱中1个周、1个月、3个月、6个月和12个月；B-H组大鼠肝匀浆S9储存液同A组的储存方法，其他条件均一样。

试验方法：应用TA100菌株，采用预培养法，选间接致变物为2-氨基芴(2-AF，100μg/mL)，每皿加2-AF溶液0.1mL，即10μg/皿。用在不同条件下储存不同时间的市售的大鼠肝匀浆S9进行Ames试验，每皿分别添加不同保存条件保存后的A-F组大鼠肝匀浆S9储存液0.5mL和2-AF 10μg，设三个平行皿，试验重复三次。平皿置37℃培养48h后计数回变菌落数，试验数据以x±s表示。菌株TA100通过鉴定都符合试验要求，其余同一般Ames。

试验结果：具体结果如下表1所示。

表1经不同储存液储存后的大鼠肝匀浆S9对TA100回变菌落数的影响(4℃)

表2经不同储存液储存后的大鼠肝匀浆S9对TA100回变菌落数的影响(-20℃)

将本发明实施例五至实施例八制备得到的大鼠肝匀浆S9，通过功能学试验来系统评价其活性。

Ames试验

试验方法：将本发明实施例七至实施例十制备得到的大鼠肝匀浆S9，分别记为A-D组大鼠肝匀浆S9，并以市售大鼠肝匀浆S9(多氯联苯诱导)为对照组。应用TA98、TA100菌株，采用预培养法，选间接致变物为2-氨基芴(2-AF，100μg/mL)，每皿加2-AF溶液0.1mL，即10μg/皿。用A-D组大鼠肝匀浆S9和市售大鼠肝匀浆S9进行Ames试验，每皿分别添A-D组大鼠肝匀浆S9或市售大鼠肝匀浆S9 250μL和2-AF 10μg，设三个平行皿，试验重复三次。平皿置37℃培养48h后计数回变菌落数，试验数据以x±s表示。菌株TA98、TA100通过鉴定都符合试验要求，其余同一般Ames。

试验结果：具体结果如下表3所示。

表3 2-AF在不同组别大鼠肝匀浆S9条件下的Ames试验结果

本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：(1)本发明提供的保存大鼠肝匀浆S9的储存液，可以在保证大鼠肝匀浆S9活性基本不变的前提下，延长大鼠肝匀浆S9的保存时间，从而避免在使用的过程中反复的冻融而影响其活性；(2)本发明提供的保存大鼠肝匀浆S9的储存液中，包括聚乙二醇，聚乙二醇MW 8000是一大分子有机物质为非渗透性低温保护剂不能渗入细胞内，其保护细胞的机制尚未充分阐明，目前将它用于肝细胞低温保存的研究尚鲜见报道，本发明经过大量的实验，发现其在大鼠肝匀浆S9的低温保存过程中，能维持大鼠肝匀浆S9活性长时间基本不变；(3)本发明提供的保存大鼠肝匀浆S9的储存液中，包括二十碳五烯酸，二十碳五烯酸属于omega-3多不饱和脂肪酸，它能改善胃肠外营养相关性肝病预后；减少炎症介质产生、降低黏附分子的表达，从而起到直接或间接抗炎的作用；预防脂肪肝小鼠缺血再灌注损伤和微循环衰竭的作用减轻小鼠化学性肝损伤和梗阻性黄疸肝细胞损伤的作用；omega-3多不饱和脂肪酸还具有改善大鼠缺血再灌注损伤，促进肝切除后肝再生的作用，目前将它用于肝细胞低温保存的研究并无报道，本发明经过大量的实验，欣喜的发现其在大鼠肝匀浆S9的低温保存过程中，通过在保存液中同时添加二十碳五烯酸和乳糖酸，能显著延长大鼠肝匀浆S9在-20℃和4℃的保存时间；但是单独添加二十碳五烯酸或乳糖酸，并没有显著的效果；(4)本发明提供的保存大鼠肝匀浆S9的储存液的制备方法简单，生产成本低；(5)采用本发明提供的诱导剂诱导得到的大鼠肝匀浆S9，在阳性剂中的回变菌落数显著提高，表明大鼠肝匀浆S9的诱导活性显著增强。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的范围当中。

Claims (10)

1.一种用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液，其特征在于，每1L所述储存液中，原料组分包括：

200～260mL丙三醇、300～400mL聚乙二醇、0.5～2mmol氯化钙和15～25mmol Tris-HCl，余量为水。

2.根据权利要求1所述的用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液，其特征在于，所述原料组分还包括：

35～50g二十碳五烯酸和14～18g乳糖酸。

3.根据权利要求1或2所述的用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液，其特征在于：

所述Tris-HCl的pH值为7.4，所述水为去离子水。

4.根据权利要求1或2所述的用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液，其特征在于：

所述聚乙二醇的相对分子质量为7500～8500。

5.权利要求1-4任一项所述的用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将氯化钙加入Tris-HCl中，待混合均匀后加入其他原料组分，搅拌均匀，得到储存液。

6.权利要求1-4任一项所述的用于保存大鼠肝匀浆S9的储存液在保存大鼠肝匀浆S9中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

将大鼠肝匀浆S9和所述储存液以(1.0～1.2):1的体积比混合均匀，然后于-20℃～4℃的条件下保存。

7.一种诱导制备权利要求6所述的大鼠肝匀浆S9的诱导剂，其特征在于：

所述诱导剂的原料组分按重量份计包括：苯巴比妥4～7重量份、β-萘黄酮2～4重量份和磺吡酮15～20重量份。

8.根据权利要求7所述的大鼠肝匀浆S9的诱导剂，其特征在于：

所述诱导剂的原料组分还包括川穹提取物6～8重量份；

所述川穹提取物的制备方法包括如下步骤：将粉碎至60～100目的川穹和质量分数为60％～70％的乙醇水溶液以1:(8～10)的质量比混合均匀，然后在70～80℃下浸泡10～12h，浸泡的pH值为4.6～5.2；将所述浸泡得到的产物在35～40℃下超声提取5～8h，将所述超声提取得到的产物过滤，收集滤液并进行脱色处理；将所述脱色处理后的产物浓缩成相对密度为1.05～1.25的浸膏，得到川穹提取物。

9.利用权利要求7或8所述的诱导剂诱导制备大鼠肝匀浆S9的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：将所述诱导剂用0.9％氯化钠注射液配制成诱导剂质量浓度为30～35mg/mL的混合溶液；

S2：将所述混合溶液对大鼠按每天每只2.0～2.5mL/kg腹腔注射，连续注射3～4d后断头处死；其中，在所述处死前12h禁食不禁水；

S3：在无菌条件下取出大鼠肝脏，去除肝脏的结缔组织后洗涤剪碎，然后采用组织匀浆器制成肝匀浆；

S4：将所述肝匀浆离心，收集上清液，即为大鼠肝匀浆S9。

10.权利要求9所述的方法制备得到的大鼠肝匀浆S9。