CN106822911A

CN106822911A - 一种可控释放的抗生素水凝胶及其制备方法和应用

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Publication number: CN106822911A
Application number: CN201610915228.2A
Authority: CN
Inventors: 程义云; 胡婧婧
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2016-10-20
Filing date: 2016-10-20
Publication date: 2017-06-13
Anticipated expiration: 2036-10-20
Also published as: CN106822911B

Abstract

本发明涉及一种可控释放的抗生素水凝胶及其制备方法和应用。本发明提供一种基于氨基糖苷类抗生素的可控释放的抗生素水凝胶，其由氧化的多糖高分子与氨基糖苷类抗生素通过酸敏感的席夫碱键交联而成，在细菌感染所产生的酸性环境下席夫碱键断裂，从而导致凝胶降解，实现抗生素的按需释放。本发明还提供所述氧化多糖‑氨基糖苷类抗生素水凝胶在体外及体内的抗菌应用。本发明制备简单，成本低廉，所制得的可控释放的抗生素水凝胶可根据抗生素含量来控制凝胶的强度、凝胶的形貌、凝胶的降解、药物的释放速率等，且具有非常广谱的高效抗菌性能，抑菌效果优于市面上的多种商业化抑菌胶。该水凝胶有望制成霜剂、植入物以及医疗器械上的涂层等，用以抵抗革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌等的感染。

Description

一种可控释放的抗生素水凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及高分子化学及生物材料技术领域。具体涉及一种医用抗生素水凝胶，特别是其连接剂为氨基糖苷类抗生素药物本身，且连接键为酸性敏感化学键。该水凝胶可在细菌增殖所产生的酸性环境下降解，从而释放出药物进行杀菌，实现氨基糖苷类抗生素的按需释放，且药物释放速率可自我调节。

背景技术

细菌感染一直给人类的健康造成巨大的威胁。氨基糖苷类抗生素是已经被世界健康组织列为治疗细菌感染非常高效的一类药物，抗菌谱非常广泛，对肺结核、脑膜炎以及鼠疫等均有效。尽管如此，这类药物仍然面临药物抗性以及副作用等的困扰，使得其在临床治疗中的用量很难控制。比如，当氨基糖苷类抗生素药物浓度不足时，将会导致细菌生物膜的形成以及持久的慢性细菌感染。然而，高浓度的氨基糖苷类抗生素又会导致多种副作用的产生。由于氨基糖苷类抗生素是通过靶向到细菌核糖体来抑制其蛋白质的合成从而达到抑菌的目的，而核糖体在各种哺乳动物细胞中广泛存在，因而氨基糖苷类抗生素对细菌的选择性很低，高浓度的氨基糖苷类抗生素便会导致耳毒性及神经毒性等副作用。因此，获得临床上合适的抗生素药物浓度是保证治疗成功的关键，虽然近年来相关工作者一直在致力于研发新的抗生素药物来解决这一问题，然而却收效甚微。

开发能够精确控制氨基糖苷类抗生素释放速率的按需递送体系来有效调节药物的浓度，成为替代新型抗生素药物研发的新策略。其中，包裹有抗菌药物的水凝胶是目前进行抗生素局部给药的主要形式，该类剂型具有多种明显的优势，例如可以进行局部给药，具有良好的生物黏附性，可以数日乃至数星期持续给药，提高生物利用度的同时也降低了药物的毒副作用。然而，传统的凝胶大多是通过被动扩散或者凝胶的降解来释放药物的，仍然存在无法获得具有可调节释放动力学的按需药物输送的问题。

发明内容

本发明克服现有传统凝胶无法精确控制药物释放的不足，创新提出了一种能精确控制氨基糖苷类抗生素释放的按需给药凝胶，由氧化的天然多糖与氨基糖苷抗生素通过酸敏感的席夫碱键交联而成。由于细菌增殖会产生酸性环境，会导致构建凝胶的席夫碱键断裂从而使凝胶降解，同时按需释放出氨基糖苷类抗生素药物杀菌。与传统通过被动扩散来释放药物的凝胶不同，所述药物凝胶是通过凝胶溶蚀逐渐释放药物的，避免了初期的药物爆释，并且可使得药物的释放速率与凝胶的降解速率一致。本发明利用氧化的天然多糖和氨基糖苷多糖抗生素通过席夫碱键共价连接成胶，获得了可根据感染程度按需释放抗生素的药物凝胶，合成简易，抗菌谱广，抗菌效率高，且凝胶的强度、药物的释放速率均可通过其中药物的含量来进行调节。

本发明提供一种可控释放的抗生素水凝胶的制备方法，所述可控释放的抗生素水凝胶为氧化的天然多糖-抗生素水凝胶，将氨基糖苷类抗生素药物分子作为交联剂，通过席夫碱键与氧化的天然多糖高分子原位交联，形成所述氧化的天然多糖-抗生素水凝胶；所述水凝胶在酸性微环境下可加速降解，同时释放出氨基糖苷类抗生素药物。

本发明中，所述氨基糖苷类抗生素药物是一类由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的苷类抗生素，并且分子结构中含有多个氨基基团。其中氨基糖苷类抗生素药物的分子结构中含有的氨基数≧2，通式如式(I)所示：

式(I)中，R₁，R₂，R₃，R₄，R₅为H或者烷基，R₆，R₇，R₈为羟基或烷基羟基。

所述氨基糖苷类抗生素包括但不局限于以下种类：奈替米星，异帕米星，卷曲霉素，核糖霉素，西索米星，安普霉素，阿米卡星，卡那霉素，庆大霉素，巴龙霉素，妥布霉素，新霉素等。其代表性药物结构式如下所示：

本发明中，所述天然多糖高分子材料包括但不局限于以下材料：葡聚糖、壳聚糖、海藻酸、透明质酸、纤维素、木质素、软骨素、糖胺聚糖、淀粉、果胶、甘露聚糖等。

作为多糖类高分子，本发明优选右旋糖酐为例，其化学结构式如下：

式(II)中，n是多糖高分子的重复单元数，为1-100000优选地为350左右。

本发明中，氧化的天然多糖高分子获得的方式为，天然多糖高分子在氧化剂存在的条件下，被氧化为氧化的天然多糖高分子，使其分子结构中生成醛基，其中，所述氧化剂为高碘酸钠等。

氧化的右旋糖酐的结构如式(III)所示：

式(III)中，n是多糖高分子的重复单元数，为1-100000；优选地为350左右。

x是醛基化的比例，为5％-95％，优选地，为50％左右。

本发明中，氧化的天然多糖高分子与氨基糖苷抗生素之间通过席夫碱键交联成胶，交联机理如下：

本发明的成胶条件为，交联所需的多糖高分子的浓度为30mg/mL-200mg/mL，优选地为50mg/mL；醛基化比例为5％-95％，优选地为50％。

本发明的成胶条件为，交联所需的氨基糖苷类抗生素的质量百分比为0.1％-20％。

本发明中，成胶的温度为室温。

本发明中，可以通过调节氨基糖苷类抗生素药物的含量来调节水凝胶的凝胶化时间，所述天然多糖-氨基糖苷类抗生素水凝胶的凝胶化时间为1秒至60分钟之间，优选地为10秒至15分钟；进一步优选地为1分钟。凝胶化时间与多糖高分子的醛基化比例以及氨基糖苷类抗生素分子结构中的氨基数有关，醛基化比例越高，凝胶化时间越短；抗生素分子中氨基数越多，凝胶化时间也会缩短。

本发明还提出了一种由上述制备方法制备得到的天然多糖-氨基糖苷类抗生素水凝胶，所述水凝胶由氨基糖苷类抗生素通过席夫碱键与氧化的天然多糖高分子原位交联，所得水凝胶呈现出明显的微观多孔结构。

本发明中，所述天然多糖-氨基糖苷类抗生素水凝胶的机械强度可通过改变多糖高分子和氨基糖苷类抗生素的浓度比例来进行调节，也可以通过调节氨基糖苷类抗生素药物的含量来调节水凝胶的机械强度；所述水凝胶的存储模量位于10帕至10000帕之间，优选地为数十帕至数千帕之间，可用于制备多种剂型。

本发明中，所制得的天然多糖-氨基糖苷类抗生素水凝胶具有良好的组织粘附性能，十分适合于在皮肤敷料等组织工程中进行应用。

本发明中，所制得的天然多糖-氨基糖苷类抗生素水凝胶可对细菌增殖所产生的酸性环境做出响应而降解，从而释放出抗生素药物，且释放速率可通过改变氨基糖苷类抗生素药物在凝胶中的质量百分比来调节，即，可以通过调节氨基糖苷类抗生素药物的含量来调节水凝胶的降解速率，也可通过调节氨基糖苷类抗生素药物的含量来调节药物的释放速率。氨基糖苷类抗生素药物的释放半周期可调节为1小时至数月，适用于多种不同的给药情况。

本发明中，所制得的天然多糖-氨基糖苷类抗生素水凝胶抗菌谱广泛，对革兰氏阳性菌、阴性菌等多种菌种均具有良好的抑菌作用。

本发明还提出了所述天然多糖-氨基糖苷类抗生素水凝胶在制备抑制细菌感染的药物中的应用。

其中，所述细菌选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌。

本发明中，所制得的天然多糖-氨基糖苷类抗生素水凝胶具有以下特点：(1)与传统抗生素凝胶利用物理包埋装载药物的方式相比，本发明中氨基糖苷类抗生素药物分子能十分稳定地交联于凝胶网络中，避免了药物由于被动扩散导致的爆释；(2)形成该天然多糖-氨基糖苷类抗生素水凝胶的席夫碱键具有酸敏感性，当细菌生长产生酸性环境，席夫碱键断裂释放出抗生素分子，实现了氨基糖苷类抗生素药物在细菌感染部位的按需释放；(3)可通过调节凝胶中氨基糖苷抗生素药物的质量百分比来调节药物分子的释放速率以及凝胶的各种性能。

附图说明

图1为实施例1中氧化右旋糖酐的合成路线。

图2为实施例1中氧化右旋糖酐的氧化度滴定拟合曲线。

图3：图3A为实施例2中氧化右旋糖酐与部分氨基糖苷类抗生素成胶图((1)-(9)分别为不同氨基糖苷类抗生素与氧化右旋糖酐形成的凝胶，从左至右依次为：奈替米星、异帕米星、核糖霉素、西索米星、安普霉素、阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素)；图3B中，(10)～(12)分别为实施例2中氧化羧甲基纤维素、氧化海藻酸钠、氧化硫酸软骨素与阿米卡星交联反应形成的凝胶。

图4为实施例2中天然多糖-阿米卡星水凝胶的扫描电镜图片。

图5为实施例3中天然多糖-阿米卡星水凝胶的流变学性能图。

图6为实施例4中天然多糖-阿米卡星水凝胶的流变学性能图。

图7为实施例5中天然多糖-阿米卡星水凝胶的流变学性能图。

图8为实施例6中不同药物含量的天然多糖-阿米卡星水凝胶的外观形貌图。

图9为实施例7中天然多糖-1.18％阿米卡星水凝胶的降解曲线图。

图10为实施例8中天然多糖-2.32％阿米卡星水凝胶的降解曲线图。

图11为实施例9中天然多糖-1.43％阿米卡星水凝胶在pH 7.4缓冲溶液中阿米卡星的释放曲线。

图12为实施例10中海藻酸钠/Ca²⁺-阿米卡星水凝胶在pH 7.4缓冲溶液中阿米卡星的释放曲线。

图13为实施例11中天然多糖-1.43％阿米卡星水凝胶在pH 5.0缓冲溶液中阿米卡星的释放曲线。

图14为实施例12中天然多糖-0.76％阿米卡星水凝胶在pH 5.0缓冲溶液中阿米卡星的释放曲线。

图15为实施例13中天然多糖-1.18％阿米卡星水凝胶在pH 5.0缓冲溶液中阿米卡星的释放曲线。

图16为实施例14中天然多糖-2.32％阿米卡星水凝胶在pH 5.0缓冲溶液中阿米卡星的释放曲线。

图17为实施例15中阿米卡星水凝胶、海藻酸钠/Ca²⁺-阿米卡星凝胶、纳米银抗菌凝胶、四环素抗菌胶、红霉素抗菌胶等对大肠杆菌的抑菌活性。

图18为实施例16中阿米卡星水凝胶、海藻酸钠/Ca²⁺-阿米卡星凝胶、纳米银抗菌凝胶、四环素抗菌胶、红霉素抗菌胶等对表皮葡萄球菌的抑菌活性。

图19为实施例17中阿米卡星水凝胶、海藻酸钠/Ca²⁺-阿米卡星凝胶、纳米银抗菌凝胶、四环素抗菌胶、红霉素抗菌胶等对金黄色葡萄球菌的抑菌活性。

图20为实施例18中阿米卡星水凝胶、海藻酸钠/Ca²⁺-阿米卡星凝胶、纳米银抗菌凝胶、四环素抗菌胶、红霉素抗菌胶等对绿脓杆菌的抑菌活性。

图21为实施例19中没有经过任何处理，经金黄色葡萄球菌感染三天的昆明鼠，以及感染部分皮肤的菌落数统计图。

图22为实施例20中注射了游离的阿米卡星药物，经金黄色葡萄球菌感染三天的昆明鼠，以及感染部分皮肤的菌落数统计图。

图23为实施例21中注射有海藻酸钠/Ca²⁺-阿米卡星水凝胶，经金黄色葡萄球菌感染三天的昆明鼠，以及感染部分皮肤的菌落数统计图。

图24为实施例22中注射有阿米卡星水凝胶，经金黄色葡萄球菌感染三天的昆明鼠，以及感染部分皮肤的菌落数统计图。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、试验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1：多糖高分子的氧化

将1g右旋糖酐(Mw：45-60kDa)溶解在12.5mL去离子水中，逐滴加入8mL高碘酸钠溶液(0.5M,107mg/mL)，避光搅拌反应4h，加入1mL乙二醇，搅拌1h终止反应，之后通过透析(截断分子量：3500Da)对反应物进行除杂，透析2天后冻干样品，并配制成醛基化右旋糖酐溶液(80mg/mL)，冷藏待用。，氧化右旋糖酐的合成路线如图1所示。

将1g羧甲基纤维素钠(Mw：100kDa)溶解在70mL去离子水中，逐滴加入18mL高碘酸钠溶液(0.5M,107mg/mL)，避光搅拌反应4h，加入2mL乙二醇，搅拌1h终止反应，之后通过透析(截断分子量：3500Da)对反应物进行除杂，透析2天后冻干样品，配制成醛基化羧甲基纤维素钠溶液(80mg/mL)，冷藏待用。

将1g海藻酸钠(Mw：250kDa)溶解在50mL去离子水中，逐滴加入16mL高碘酸钠溶液(0.5M,107mg/mL)，避光搅拌反应4h，加入2mL乙二醇，搅拌1h终止反应，之后通过透析(截断分子量：3500Da)对反应物进行除杂，透析2天后冻干样品，配制成醛基化海藻酸钠溶液(80mg/mL)，冷藏待用。

将1g硫酸软骨素钠(Mw：50kDa)溶解在15mL去离子水中，逐滴加入8mL高碘酸钠溶液(0.5M,107mg/mL)，避光搅拌反应4h，加入1mL乙二醇，搅拌1h终止反应，之后通过透析(截断分子量：3500Da)对反应物进行除杂，透析2天后冻干样品，配制成醛基化软骨素钠溶液(80mg/mL)，冷藏待用。

取约30mg冻干后的氧化右旋糖酐固体，溶解于3mL盐酸羟胺/甲基橙溶液中，之后用0.1M的NaOH溶液进行滴定，记录对应的pH值，绘制所消耗的NaOH体积与对应pH值的相关曲线，并对该曲线进行一次微分拟合，得到的拟合曲线最高点即为滴定终点，进而计算得出右旋糖酐的氧化比例。

实验结果：如图2，根据滴定结果计算可得，右旋糖酐聚合物分子链中约有48％的羟基被氧化为醛基，即，醛基化比例为48％。以相同的方法可计算出其他几种多糖高分子的醛基化比例，羧甲基纤维素钠的氧化比例(醛基化比例)为35％，海藻酸钠的氧化比例(醛基化比例)为58％，硫酸软骨素的氧化比例(醛基化比例)为45％。后续实施例主要以氧化右旋糖酐为例进行说明。

实施例2：抗菌水凝胶的制备

该实施例(1)～(9)主要以氧化右旋糖酐为多糖高分子代表，对其与多种氨基糖苷类抗生素药物的交联反应进行观察，如图3A所示；(10)～(12)分别为氧化羧甲基纤维素、氧化海藻酸钠、氧化硫酸软骨素与阿米卡星的交联反应；如图3B所示；结合图3A及图3B可得，氧化天然多糖高分子与氨基糖苷类抗生素药物均可形成透明均匀的水凝胶。相比而言，氧化海藻酸钠与药物形成水凝胶的时间较长，可能是由于其较低的水溶性以及较高的黏度所造成。

(1)将150μL氧化右旋糖酐溶液(50mg/mL)，50μL奈替米星溶液(50mg/mL)混合，室温下约2分钟成胶。

(2)将150μL氧化右旋糖酐溶液(50mg/mL)，50μL异帕米星溶液(50mg/mL)混合，室温下约1分钟成胶。

(3)将150μL氧化右旋糖酐溶液(50mg/mL)，50μL核糖霉素溶液(50mg/mL)混合，室温下约5分钟成胶。

(4)将150L氧化右旋糖酐溶液(50mg/mL)，50μL西索米星溶液(50mg/mL)混合，室温下约3分钟成胶。

(5)将150μL氧化右旋糖酐溶液(50mg/mL)，50μL安普霉素溶液(50mg/mL)混合，室温下约2分钟成胶。

(6)将150μL氧化右旋糖酐溶液(50mg/mL)，50μL阿米卡星溶液(50mg/mL)混合，室温下约1分钟成胶。

(7)将150μL氧化右旋糖酐溶液(50mg/mL)，50μL卡那霉素溶液(50mg/mL)混合，室温下约50秒成胶。

(8)将150μL氧化右旋糖酐溶液(50mg/mL)，50μL妥布霉素溶液(50mg/mL)混合，室温下约40秒成胶。

(9)将150μL氧化右旋糖酐溶液(50mg/mL)，50μL庆大霉素溶液(50mg/mL)混合，室温下约20秒成胶。

(10)将150μL氧化羧甲基纤维素溶液(50mg/mL)，50μL阿米卡星溶液(50mg/mL)混合，室温下约50秒成胶。

(11)将150μL氧化海藻酸钠溶液(80mg/mL)，50μL阿米卡星溶液(50mg/mL)混合，室温下约10分钟成胶。

(12)将150μL氧化硫酸软骨素溶液(80mg/mL)，50μL阿米卡星溶液(50mg/mL)混合，室温下约2分钟成胶。

将本实施例中右旋糖酐与阿米卡星所形成的凝胶采取扫描电子显微镜对其截面进行观测，所得的微观结构如图4所示。其明显的多孔结构证明右旋糖酐与阿米卡星确实形成了水凝胶。

实验结果表明，右旋糖酐等多糖高分子经氧化使得分子结构中含有醛基后，可与氨基糖苷类抗生素药物发生高效的交联反应形成水凝胶。

在后续实施例中，主要以氧化右旋糖酐-阿米卡星水凝胶为例来说明其在凝胶的形貌、成胶时间、机械强度、药物释放、抗菌活性等方面的效果。

实施例3：0.71％阿米卡星水凝胶(0.71％为阿米卡星含药量(占水凝胶总质量的百分含量))的凝胶时间及机械性能测定

制备阿米卡星含量为0.71％的氧化右旋糖酐-阿米卡星水凝胶：将170μL氧化右旋糖酐溶液(50mg/mL，48％氧化度)与30μL阿米卡星溶液(50mg/mL)混合，大约90s可形成凝胶。

机械性能的测试：采取多功能流变仪对该阿米卡星含量为0.71％的水凝胶进行机械性能的测试。具体方法是：850μL氧化右旋糖酐溶液(50mg/mL，48％氧化度)与150μL阿米卡星溶液(50mg/mL)混合，之后立即转移到37℃的流变仪平板上，进行时间相关的模量测试(流变仪型号为ARES-G2，TA仪器公司，应变率为1％，频率为1Hz)。如图5所示，所得凝胶的存储模量大约为80Pa左右。

实施例4：1.43％阿米卡星水凝胶(1.43％阿米卡星含药量)的凝胶时间及机械性能测定

制备阿米卡星含量为1.43％的氧化右旋糖酐-阿米卡星水凝胶：将140μL氧化右旋糖酐溶液(50mg/mL，48％氧化度)与60μL阿米卡星溶液(50mg/mL)混合，大约60s可形成凝胶。

机械性能的测试：采取多功能流变仪对该阿米卡星含量为1.43％的水凝胶进行机械性能的测试。具体方法是：750μL氧化右旋糖酐溶液(50mg/mL，48％氧化度)与250μL阿米卡星溶液(50mg/mL)混合，之后立即转移到37℃的流变仪平板上，进行时间相关的模量测试(流变仪型号为ARES-G2，TA仪器公司，应变率为1％，频率为1Hz)。如图6所示，所得凝胶的存储模量大约为550Pa左右。

实施例5：2.41％阿米卡星水凝胶(2.41％阿米卡星含药量)的凝胶时间及机械性能测定

制备阿米卡星含量为2.41％的氧化右旋糖酐-阿米卡星水凝胶：将120μL氧化右旋糖酐溶液(50mg/mL，48％氧化度)与80μL阿米卡星溶液(50mg/mL)混合，大约40s可形成凝胶。

机械性能的测试：采取多功能流变仪对该阿米卡星含量为2.41％的水凝胶进行机械性能的测试。具体方法是：600μL氧化右旋糖酐溶液(50mg/mL，48％氧化度)与400μL阿米卡星溶液(50mg/mL)混合，之后立即转移到37℃的流变仪平板上，进行时间相关的模量测试(流变仪型号为ARES-G2，TA仪器公司，应变率为1％，频率为1Hz)。如图7所示，所得凝胶的存储模量大约为2800Pa左右。

由实施例3-5的结果可知，氧化右旋糖酐与阿米卡星形成水凝胶的时间随着阿米卡星的含量增高而逐渐缩短，且存储模量随着含药量的增加而上升，在数十帕至数千帕之间。

实施例6：阿米卡星含量对凝胶形貌的影响

制备阿米卡星含量为0.71％的氧化右旋糖酐-阿米卡星水凝胶：将170μL氧化右旋糖酐溶液(50mg/mL，48％氧化度)与30μL阿米卡星溶液(50mg/mL)混合，所得凝胶呈透明状。

制备阿米卡星含量为1.43％的氧化右旋糖酐-阿米卡星水凝胶：将140μL氧化右旋糖酐溶液(50mg/mL，48％氧化度)与60μL阿米卡星溶液(50mg/mL)混合，所得凝胶呈半透明状。

制备阿米卡星含量为2.41％的氧化右旋糖酐-阿米卡星水凝胶：将120μL氧化右旋糖酐溶液(50mg/mL，48％氧化度)与80μL阿米卡星溶液(50mg/mL)混合，所得凝胶呈白色不透明状。

三种含量的阿米卡星水凝胶的形貌如图8所示。

实施例7：1.18％阿米卡星水凝胶在pH 5.0缓冲液中的降解行为

研究药物含量为1.18％的氧化右旋糖酐-阿米卡星水凝胶的降解行为。具体方法是：将150μL右旋糖酐溶液(60mg/mL)，50μL阿米卡星溶液(50mg/mL)混合得到抗菌水凝胶。在瓶中加入pH 5.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.1M)1mL，分别在特定时间点用移液器收集瓶中的溶液，持续时间为24小时，之后将收集得到的溶液冻干称重，绘制该水凝胶随着时间的降解曲线。

如图9所示，1.18％阿米卡星水凝胶在24小时内大约降解了50％左右。

实施例8：2.32％阿米卡星水凝胶在pH 5.0缓冲液中的降解行为

研究药物含量为2.32％的氧化右旋糖酐-阿米卡星水凝胶的降解行为。具体方法是：将150μL右旋糖酐溶液(70mg/mL)，50μL阿米卡星溶液(100mg/mL)混合得到抗菌水凝胶。在瓶中加入pH 5.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.1M)1mL，分别在特定时间点用移液器收集瓶中的溶液，持续时间为24小时，之后将收集得到的溶液冻干称重，绘制该水凝胶随着时间的降解曲线。

如图10所示，2.32％阿米卡星水凝胶在24小时内大约降解了10％左右。

综合图9、图10可得，阿米卡星水凝胶的降解行为可通过其药物含量来调节，随着药物含量的增加，凝胶的降解速率减慢。

实施例9：1.43％阿米卡星水凝胶在pH 7.4缓冲液中对阿米卡星的释放行为

研究阿米卡星凝胶在pH 7.4缓冲液中对阿米卡星的控制释放行为。具体方法是：将140μL氧化右旋糖酐溶液(50mg/mL)，60μL阿米卡星溶液(50mg/mL)混合制得阿米卡星含量为1.43％的水凝胶。在瓶中加入pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.1M)2mL，每隔一小时从瓶中取样300μL，同时补充300μL对应的空白磷酸缓冲液(pH 7.4)以保持体积恒定。

采取邻苯二甲醛对收集到的样品进行衍生化，536mg的邻苯二甲醛(OPA)，20mL甲醇，2.8mL巯基乙酸，pH 10.5的硼酸缓冲液77.2mL混合得到衍生化OPA试剂，每个释放样品中加入600μL进行衍生化，20分钟后对样品在波长为333nm处的紫外吸收进行检测分析，得到该抗生素水凝胶对抗生素药物的控释行为。如图11所示，所检测的阿米卡星在pH 7.4的缓冲液中对抗生素药物的释放非常缓慢，24小时内仅释放了10％左右的药物。

实施例10：海藻酸钠/Ca²⁺-1.43％阿米卡星水凝胶在pH 7.4缓冲液中对阿米卡星的释放行为

将4.5mg CaCO₃和7.5mg葡萄糖内脂溶于1mL水中配置成悬浮液，取100μL与100μL海藻酸钠溶液(15mg/mL)等体积混合，同时加入3mg阿米卡星(与1.43％阿米卡星水凝胶中的阿米卡星含量相同)，约20分钟成胶，加入pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.1M)2mL，每隔一小时从瓶中取样300μL，同时补充300μL对应的空白磷酸缓冲液(pH 7.4)以保持体积恒定。

采取邻苯二甲醛对收集到的样品进行衍生化，536mg的邻苯二甲醛(OPA)，20mL甲醇，2.8mL巯基乙酸，pH 10.5的硼酸缓冲液77.2mL混合得到衍生化OPA试剂，每个释放样品中加入600μL进行衍生化，20分钟后对样品在波长为333nm处的紫外吸收进行检测分析，得到该抗菌凝胶的体外药物控释行为。

如图12所示，所述海藻酸钠/Ca²⁺-阿米卡星凝胶是通过物理包裹来装载阿米卡星的，药物呈现出非常快速的扩散释放，24小时内几乎释放完全。

实施例11：1.43％阿米卡星水凝胶在pH 5.0缓冲液中对阿米卡星的释放行为

研究阿米卡星凝胶在pH 5.0缓冲液中对药物的控制释放行为。将140μL氧化右旋糖酐溶液(50mg/mL)，60μL阿米卡星溶液(50mg/mL)混合得到阿米卡星含量为1.43％的凝胶，加入pH 5.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.1M)2mL，每隔一小时从瓶中取样300μL，同时补充300μL对应的空白磷酸缓冲液(pH 5.0)以保持体积恒定。

采取邻苯二甲醛对收集到的样品进行衍生化，536mg的邻苯二甲醛(OPA)，20mL甲醇，2.8mL巯基乙酸，pH 10.5的硼酸缓冲液77.2mL混合得到衍生化OPA试剂，每个释放样品中加入600μL进行衍生化，20分钟后对样品在波长为333nm处的紫外吸收进行检测分析，得到该类抗菌凝胶的体外药物控释行为。

如图13所示，所检测的1.43％阿米卡星水凝胶在pH 5.0的缓冲液中对抗生素阿米卡星的释放速率大于在pH 7.4缓冲液中的释放速率。大约24小时内释放了30％左右的药物。

综合图11、图12、图13可得，与物理包裹药物的水凝胶在生理条件下即大量释放药物不同，本发明的阿米卡星水凝胶在正常生理环境下不释放药物，然而会对酸性环境做出响应，构成凝胶网络的席夫碱键断裂进而释放出抗生素，可实现对抗生素药物的按需释放。

实施例12：0.76％阿米卡星水凝胶(阿米卡星含量为0.76％)对药物的控释行为

研究阿米卡星水凝胶中阿米卡星含量对其控制释放能力的影响。具体方法是：将160μL右旋糖酐溶液(50mg/mL)，40μL阿米卡星溶液(40mg/mL)混合得到药物含量为0.76％的阿米卡星水凝胶。在瓶中加入pH 5.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.1M)2mL，每隔一小时从瓶中取样300μL，同时补充300μL对应的空白磷酸缓冲液(pH 5.0)以保持体积恒定，实验过程中制备三份平行样以减小操作误差。

如图14所示，该实施例中0.76％阿米卡星水凝胶大约在两天内释放了90％药物。

实施例13：1.18％阿米卡星水凝胶(阿米卡星含量为1.18％)对药物的控释行为

研究1.18％阿米卡星水凝胶中阿米卡星的释放行为。具体方法是：将150μL右旋糖酐溶液(60mg/mL)，50μL阿米卡星溶液(50mg/mL)混合得到抗菌水凝胶。在瓶中加入pH 5.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.1M)2mL，每隔一小时从瓶中取样300μL，同时补充300μL对应的空白磷酸缓冲液(pH 5.0)以保持体积恒定，实验过程中制备三份平行样以减小操作误差。

如图15所示，该实施例中1.18％阿米卡星水凝胶大约在一个月内释放了85％的药物。

实施例14：2.32％阿米卡星水凝胶(阿米卡星含量为2.32％)对药物的控释行为

将150μL右旋糖酐溶液(70mg/mL)，50μL阿米卡星溶液(100mg/mL)混合得到抗菌水凝胶。在瓶中加入pH 5.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.1M)2mL，每隔一小时从瓶中取样300μL，同时补充300μL对应的空白磷酸缓冲液(pH 5.0)以保持体积恒定，实验过程中制备三份平行样以减小操作误差。

如图16所示，该实施例中2.32％阿米卡星水凝胶在一个月内仅释放了30％左右的药物。

由图14、图15、图16可得，该抗菌凝胶对药物的控释能力与抗菌药物的含量有关，当含药量为0.76％时，所得到的抗菌胶较软且透明，交联程度低，药物释放快，在两天内释放出90％的药物。升高药物含量提高凝胶的交联度，随之凝胶的强度也就增加，药物的释放速度则降低。1.18％的凝胶在一周内大致释放出33％的药物，2.32％的凝胶在一个月内只释放出30％左右的药物。可根据这一特点制备不同药物含量的凝胶，以符合临床上不同用药需求的患者。

实施例15：阿米卡星水凝胶对大肠杆菌的体外抑菌效果

研究所制备得到的阿米卡星凝胶对大肠杆菌的体外抑菌效果。具体方法是：在96孔板中分别加入70μL的阿米卡星水凝胶(阿米卡星含量分别为1.08％、1.43％、1.84％、2.80％)，70μL的海藻酸钠/Ca²⁺-阿米卡星凝胶，70μL的醛基化右旋糖酐-PEI凝胶，70μL的纳米银抗菌胶，70μL的红霉素药膏，70μL的四环素药膏。每个孔中加入100μL大肠杆菌的LB溶液(10⁴CFU/mL)，在37℃，200rpm下孵育24h，检测细菌密度。另在孔中不加任何抑菌材料，检测其在24h后的细菌密度，用作对照。

如图17所示，经阿米卡星凝胶处理24小时后的大肠杆菌存活率呈现出显著降低，其中药物含量为2.80％的阿米卡星水凝胶的抑菌效率达到99％以上，总体抑菌效果明显均优于其他抗菌凝胶。

实施例16：阿米卡星水凝胶对表皮葡萄球菌的体外抑菌效果

研究所制备得到的阿米卡星凝胶对表皮葡萄球菌的体外抑菌效果。具体方法是：在96孔板中分别加入70μL的阿米卡星水凝胶(阿米卡星含量分别为1.08％、1.43％、1.84％、2.80％)，70μL的海藻酸钠/Ca²⁺-阿米卡星凝胶，70μL的醛基化右旋糖酐-PEI凝胶，70μL的纳米银抗菌胶，70μL的红霉素药膏，70μL的四环素药膏。每个孔中加入100μL表皮葡萄球菌的TSB溶液(10⁴CFU/mL)，在37℃，200rpm下孵育24h，检测细菌密度。另在孔中不加任何抑菌材料，检测其在24h后的细菌密度，用作对照。

如图18所示,经阿米卡星水凝胶处理24小时后的表皮葡萄球菌存活率呈现出显著降低，其中药物含量为2.80％的阿米卡星水凝胶的抑菌效率达到99％以上，总体抑菌效果明显均优于其他抗菌凝胶。

实施例17：阿米卡星水凝胶对金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果

研究所制备得到的阿米卡星水凝胶对金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果。具体方法是：在96孔板中分别加入70μL的阿米卡星水凝胶(阿米卡星含量分别为1.08％、1.43％、1.84％、2.80％),70μL的海藻酸钠/Ca²⁺-阿米卡星凝胶，70μL的醛基化右旋糖酐-PEI凝胶，70μL的纳米银抗菌胶，70μL的红霉素药膏，70μL的四环素药膏。每个孔中加入100μL金黄色葡萄球菌的TSB溶液(10⁴CFU/mL)，在37℃，200rpm下孵育24h，检测细菌密度。另在孔中不加任何抑菌材料，检测其在24h后的细菌密度，用作对照。

如图19所示，经阿米卡星水凝胶处理24小时后的金黄色葡萄球菌存活率呈现出显著降低，其中药物含量为1.43％的阿米卡星凝胶的抑菌效率达到99％以上，总体抑菌效果明显均优于其他抗菌凝胶。

实施例18：阿米卡星水凝胶对绿脓杆菌的体外抑菌效果

研究所制备得到的阿米卡星凝胶对绿脓杆菌的体外抑菌效果。具体方法是：在96孔板中分别加入70μL的阿米卡星水凝胶(阿米卡星含量分别为1.08％、1.43％、1.84％、2.80％),70μL的海藻酸钠/Ca²⁺-阿米卡星凝胶，70μL的醛基化右旋糖酐-PEI凝胶，70μL的纳米银抗菌胶，70μL的红霉素药膏，70μL的四环素药膏。每个孔中加入100μL绿脓杆菌的TSB溶液(10⁴CFU/m)，在37℃，200rpm下孵育24h，检测细菌密度。另在孔中不加任何抑菌材料，检测其在24h后的细菌密度，用作对照。

如图20所示，经阿米卡星水凝胶处理24小时后的绿脓杆菌存活率呈现出显著降低，其中药物含量为1.84％的阿米卡星凝胶的抑菌效率达到99％以上，总体抑菌效果明显均优于其他抗菌凝胶。

结合以上对四种不同菌株的体外抑菌效果可知，不同药物含量的阿米卡星水凝胶均显示了良好的抗菌及杀菌效果，无论是对于革兰氏阳性菌抑或是革兰氏阴性菌，以及致病菌或者是非致病菌，细菌抑制率都可达到99％左右。相比而言，其他的抗菌凝胶则未显示出如此高效的抑菌效果，并且抑菌能力存在一定的局限性，广谱性欠佳。由此可以得出，由氧化右旋糖酐与氨基糖苷抗生素交联所得的抗菌水凝胶具有非常广谱的抗菌性，且抑菌效果显著。

实施例19：金黄色葡萄球菌对昆明鼠的皮肤感染评估

该组昆明鼠麻醉后背部剃毛，不在体内注射任何抗菌材料，直接在背部注射70μL10⁸CFU/mL的金黄色葡萄球菌。三天后观察昆明鼠注射细菌部位的感染情况，并且取下感染部位的皮肤通过点板方法计算细菌菌落数。

如图21所示，没经过任何抗菌材料处理的昆明鼠的感染部位皮肤发生了严重溃烂，单位体积的菌落数为9.8×10⁹CFU/mL，皮肤外观显示存在严重的感染情况。

实施例20：游离阿米卡星药物的体内抑菌效果评价

研究游离阿米卡星药物(给药量与1.43％阿米卡星水凝胶相同)在体内的抑菌效果。具体方法：将8周的昆明鼠麻醉后背部剃毛，对昆明鼠尾静脉注射游离的阿米卡星溶液，随后在背部注射70μL 10⁸CFU/mL的金黄色葡萄球菌。三天后观察昆明鼠注射细菌部位的感染情况，并且取下感染部位的皮肤通过点板方法计算细菌菌落数。

如图22所示，注射了游离阿米卡星的老鼠的感染部位皮肤有部分溃烂，单位体积皮肤的菌落数为4.7×10⁹CFU/mL，皮肤外观显示存在一定程度的感染情况。

实施例21：海藻酸钠/Ca²⁺-阿米卡星水凝胶的体内抑菌效果评价

研究海藻酸钠/Ca²⁺-阿米卡星水凝胶(抗生素含量与含1.43％阿米卡星的氧化右旋糖酐-阿米卡星水凝胶相同)在体内的抑菌效果。具体方法：将8周的昆明鼠麻醉后背部剃毛，在老鼠背部皮下注射海藻酸钠/Ca²⁺-阿米卡星水凝胶(100μL)，随后注射70μL 10⁸CFU/mL的金黄色葡萄球菌。三天后观察昆明鼠注射细菌部位的感染情况，并且取下感染部位的皮肤通过点板方法计算细菌菌落数。

如图23所示，注射有海藻酸钠/Ca²⁺-阿米卡星水凝胶的老鼠感染部位的皮肤有部分溃烂，单位体积皮肤的菌落数为6.8×10⁹CFU/mL，皮肤外观也显示存在一定程度的感染情况。

实施例22：阿米卡星水凝胶的体内抑菌效果评价

研究所制备得到的阿米卡星水凝胶(药物含量为1.43％)在体内的抑菌效果。具体方法：将8周的昆明鼠麻醉后背部剃毛，在老鼠背部皮下注射阿米卡星抗菌水凝胶(阿米卡星含量1.43％，100μL)，随后注射70μL 10⁸CFU/mL的金黄色葡萄球菌。三天后观察昆明鼠注射细菌部位的感染情况，并且取下感染部位的皮肤通过点板方法计算细菌菌落数。

如图24所示，注射有阿米卡星水凝胶的老鼠感染部位的皮肤基本完好，单位体积皮肤的菌落数为1.5×10⁸CFU/mL，皮肤外观也显示并不存在严重的感染情况。

综合图21、图22、图23、图24可以得到，金黄色葡萄球菌的感染性很强，如不采取任何抗菌措施，可造成小鼠皮肤的严重溃烂。游离的阿米卡星具有一定的抗菌效果，但是由于游离的小分子药物在体内代谢快，在感染部位的富集能力弱，因而治疗效果欠佳。实施例21中，包裹在海藻酸钠凝胶中的阿米卡星是以被动扩散的形式进行释放的，药物也会在短期内随着体液的循环而被代谢清除，所以也只能在一定程度上减轻细菌感染程度。相比之下，实施例22中由氧化右旋糖酐与阿米卡星交联所得的水凝胶的抑菌效果则远远优于经游离阿米卡星或者是物理包裹阿米卡星的凝胶处理的抑菌效果，这是由于阿米卡星被稳定交联在凝胶中，在细菌感染部位通过酸性环境的刺激逐渐降解，释放出阿米卡星继而杀菌，药物稳定持续的释放会保证在感染部位持续有效的杀菌浓度，从而表现出长程、高效的杀菌效果。

上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让本领域的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所做出的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种可控释放的抗生素水凝胶的制备方法，其特征在于，由氨基糖苷类抗生素作为交联剂，与氧化的天然多糖高分子通过酸性敏感的席夫碱键交联成胶，制备得到所述可控释放的抗生素水凝胶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述天然多糖高分子选自葡聚糖、壳聚糖、海藻酸、透明质酸、纤维素、木质素、软骨素、糖胺聚糖、淀粉、果胶、甘露聚糖，所述氧化的多糖高分子通过氧化剂氧化得到含醛基的氧化的多糖高分子。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基糖苷类抗生素药物选自奈替米星，异帕米星，卷曲霉素，核糖霉素，西索米星，安普霉素，阿米卡星，卡那霉素，庆大霉素，巴龙霉素，妥布霉素，新霉素。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化的天然多糖高分子的成胶浓度为30mg/mL-200mg/mL，醛基化比例为5％到95％；氨基糖苷类抗生素的质量百分比为0.1％-20％。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述成胶的温度为室温。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述成胶的时间在1秒至60分钟之间。

7.一种如权利要求1-6之任一项所述的方法制备得到的可控释放的抗生素水凝胶。

8.如权利要求7所述的可控释放的抗生素水凝胶，其特征在于，所述水凝胶的存储模量在10帕至10000帕之间。

9.如权利要求7或8所述的可控释放的抗生素水凝胶在制备抑制细菌感染的药物中的应用。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述可控释放的抗生素水凝胶可制备为霜剂、植入物、涂层剂型。

11.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述细菌选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌。