CN106822874B - 一种艾塞那肽鼻腔给药制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种艾塞那肽鼻腔给药制剂，为冻干粉形式，其复溶溶液中有效成分组成包含：壳聚糖、甘油磷酸钠、氯化镁或者氯化钙、艾塞那肽。其制备方法是：(1)室温下将壳聚糖或其衍生物溶解；（2）在冰浴条件下，缓慢加入甘油磷酸钠、无机盐混合溶液，搅拌；（3）在混合溶液中加入艾塞那肽，调整溶液的pH值至4.0‑6.0，冷冻干燥得到成品。冻干粉复溶溶液可以在常温或冰箱冷藏温度下以溶液形式保存两周以上，在体温下8~123分钟内形成水凝胶，实现对艾塞那肽的缓释，促进艾塞那肽的透过，提高艾塞那肽的生物利用度。复溶的艾塞那肽鼻腔给药制剂溶液可以用于鼻腔给药，帮助肥胖人群降低体重，提高生活质量。

Description

一种艾塞那肽鼻腔给药制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种药物制剂，特别是一种含艾塞那肽的冻干粉鼻腔给药制剂，属于医药工程的药物制剂技术领域。
背景技术
艾塞那肽是胰高血糖素样肽受体的一种激动剂，具有促进胰腺β细胞增殖、促进胰岛素分泌、增加机体对胰岛素的敏感性和延缓胃排空等作用。艾塞那肽注射剂在2005年被美国食品药品监督管理局批准上市，用于2型糖尿病的辅助治疗。近几年的临床研究表明，艾塞那肽还能够用于降低2型糖尿病病人和非糖尿病肥胖人群的体重，用于肥胖人群的减重治疗。然而，目前艾塞那肽的给药途径是注射剂，因其半衰期短，需1日给药2 次，导致患者顺应性差。因而，临床上亟需研制艾塞那肽的非注射给药剂型。
温度敏感型原位凝胶系统在低温时呈现一种流动的液体状态，而在温度升高到体温后会快速形成水凝胶。由于有这种温度敏感特性，温度敏感型原位凝胶系统可用于药物的缓释。与微球，脂质体等药物包埋方式相比，原位凝胶包埋方式更加简便，同时，花费的成本也相对较低，因而，在生物医学领域受到了广泛的关注。2000年，Chenite等研究人员开发了一种基于壳聚糖/甘油磷酸钠的温敏型原位凝胶系统（Chenite, A., et al.,Biomaterials 2000，21, 2155–2161.）。与其它原位凝胶系统相比，壳聚糖/甘油磷酸钠凝胶系统的安全性好，制备过程不涉及到有毒的交联剂，制备工艺简单，能够容易地实现对小分子、多肽、蛋白质、细胞等物质的包封，尤其适合于多肽、蛋白、细胞等对有机溶剂敏感物质的包封。但是，如果直接使用壳聚糖/甘油磷酸钠凝胶系统用于艾塞那肽的递送，存在明显的缺点，一方面，壳聚糖/甘油磷酸钠水溶液长期放置稳定性差，即使低温短时间（几天）放置也会在体外形成凝胶，无法进行注射；另一方面，当使用壳聚糖-甘油磷酸钠水凝胶系统递送艾塞那肽时，由于艾塞那肽在溶液中稳定性差，尤其是中性水溶液中易于被降解，因而，无法使用已有的壳聚糖/甘油磷酸钠凝胶体系递直接送艾塞那肽。为此，研制一种体外可长期保存、体内可形成水凝胶的艾塞那肽鼻腔给药制剂，对于促进艾塞那肽在鼻腔中的吸收，提高艾塞那肽鼻腔给药的生物利用度，具有显著的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种艾塞那肽鼻腔给药制剂，以克服壳聚糖和甘油磷酸钠温敏型水凝胶溶液制剂长期放置稳定性差和艾塞那肽在溶液状态下易于被降解的缺点。
本发明的另一目的是提供一种艾塞那肽鼻腔给药制剂的制备方法。
本发明所提供的艾塞那肽鼻腔给药制剂为冻干粉形式，其复溶溶液中有效成分组成分别为：壳聚糖质量浓度为0.9%~1.7%、甘油磷酸钠质量浓度为0.5%~3.0%、无机盐质量浓度为0.5%-1.5%、艾塞那肽质量浓度低于0.5%。
所说的壳聚糖分子量范围为8~37万，脱乙酰度大于80%，所说的壳聚糖包括壳聚糖及其衍生物，如羟丙基壳聚糖、壳聚糖季铵盐；
所说的甘油磷酸钠是α-甘油磷酸钠或β-甘油磷酸钠或者它们的混合物。
所述的无机盐是氯化钙或者氯化镁，但优选氯化镁。
本发明的艾塞那肽的鼻腔给药制剂为冻干粉制剂，在使用前加水或者缓冲液复溶，以溶液形式注射入体内、滴加或者喷雾进入鼻腔或生殖道内，在体温下形成水凝胶，从而实现对艾塞那肽的缓释。
本发明所提供的艾塞那肽鼻腔给药制剂的复溶溶液在4-20 ℃时为流动的液体，当温度达到37 ℃时，可实现溶液-凝胶的转变，形成水凝胶。
本发明的艾塞那肽鼻腔给药制剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）室温下将壳聚糖或其衍生物溶解于乳酸溶液中，搅拌至完全溶解；
（2）将甘油磷酸钠和无机盐用水溶解制成混合溶液，在冰浴条件下，将甘油磷酸钠和无机盐混合溶液缓慢加入壳聚糖溶液中，低速搅拌充分混匀。
（3）在壳聚糖、甘油磷酸钠和无机盐混合溶液中加入艾塞那肽，调整溶液的pH值至4.0-6.0，冷冻干燥得到冻干粉鼻腔给药制剂。
本发明提供的艾塞那肽鼻腔给药制剂中加水或者缓冲液可以复溶形成溶液，复溶的溶液可以在常温或冰箱冷藏温度下以溶液形式保存两周以上。溶液可以注射入体内或者滴加入鼻腔、生殖道内，在体温下8~123分钟内可形成水凝胶，实现对艾塞那肽的缓释，并促进艾塞那肽透过黏膜，提高艾塞那肽的生物利用度。
本发明所提供的艾塞那肽的鼻腔给药制剂可本发明取得的有益效果在于：通过冷冻干燥技术将艾塞那肽水凝胶溶液制剂制成冻干粉制剂，既解决了水凝胶溶液制剂稳定性差、难以长期保存的难题，也解决了艾塞那肽在水溶液中，尤其是中性水溶液中易于降解的问题。复溶的艾塞那肽的鼻腔给药制剂可以用于肥胖人群鼻腔给药，帮助他们降低体重，提高生活质量。
附图说明
附图1：艾塞那肽从艾塞那肽/壳聚糖/甘油磷酸钠/氯化钙冻干粉和艾塞
那肽/壳聚糖/甘油磷酸钠/氯化镁冻干粉复溶溶液在37℃形成的水凝胶中释放的体外释放曲线。
附图2：艾塞那肽的三种制剂鼻腔给药后Cy7标记的艾塞那肽在各个脏
器中的分布。
附图3：连续给药9天，艾塞那肽的各种制剂导致的肥胖模型大鼠体重随
时间的变化曲线。
附图4：连续给药28天，艾塞那肽的各种制剂导致的肥胖模型大鼠体重
随时间的变化曲线。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 艾塞那肽鼻腔给药制剂的制备
将壳聚糖溶于0.1 M的乳酸中，充分溶解后，在冰浴条件下向其中逐滴加入无机盐和甘油磷酸钠混合水溶液，200 转/分搅拌15 分钟，充分混匀；然后，加入艾塞那肽，用0.1M氢氧化钠和0.1M盐酸调整混合溶液pH至4.0-6.0，200 转/分搅拌15 分钟，充分混匀后，分装到1 毫升的EP管或者西林瓶中。-80 ℃预冻12小时后，用冻干机真空冷冻干燥12小时，即可得到含艾塞那肽的鼻腔给药冻干粉制剂。
粘度测定方法：将溶液置于有夹层的小烧杯中，通过控制夹层温度来恒定烧杯内溶液的温度，用NDJ-8S旋转粘度计，测定烧杯内流体的旋转粘度。
水凝胶体外释放: 将含艾塞那肽的鼻腔给药冻干粉制剂用水或者乳酸钠和氢氧化钠混合溶液溶解，使得复溶混合溶液的pH为6.0。取艾塞那肽浓度为0.1%的复溶溶液于离心管内，将离心管置于37 ℃恒温水浴锅中，直至水凝胶形成。取1.5毫升水凝胶置于截留分子量为1.5万的透析袋内，将透析袋置于试管内，透析袋外加入3.0毫升pH6.0浓度0.05 M的磷酸钠缓冲液，置于37 ℃恒温摇床，摇床转速为80转/分，按照预先设定好的时间间隔取透析液，同时加入等量的新鲜的磷酸钠缓冲液。用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定透析液中艾塞那肽含量。进一步计算艾塞那肽的累积释放量。艾塞那肽磷酸钠缓冲液的释放行为测定只是将透析袋内的水凝胶换成艾塞那肽的磷酸钠缓冲液。
肥胖型SD大鼠模型的构建：选择60只雄性SD大鼠，体重150-180 g，按体重大小随机分为对照组(普通饲料喂养，n=6)和模型组(高脂词料，n=54)，连续喂养4周。饲喂期间，每天观察动物精神状态、外表形态等。隔天称取大鼠体重和饲料消耗量。喂养高脂饲料前，所有的SD大鼠使用普通饲料预养3-4天，每次每笼喂养饲料300 g。使用高脂饲料喂养SD雄鼠三十天后，营养肥胖型大鼠的体重超过普通饲料喂养后的大鼠体重的20%，可以认定为肥胖型大鼠。高脂饲料配方：猪油10%，绵白糖9%，蛋黄粉10%，胆酸钠0.1%，基础饲料70.9%
Cy7染料标记艾塞那肽：1毫克 Cy7 染料中加入0.1毫升-1.0毫升的无水二甲基亚砜。将艾塞那肽溶解于5毫升-10毫升pH 8.0磷酸钠缓冲液溶液中，Cy7溶液与艾塞那肽溶液4 ℃混合振荡60 分钟，4℃下用截留分子量为2000 Da的透析袋透析4小时，4 ℃下再透析2小时，除去未标记的荧光素分子。将标记好的艾塞那肽冻干，冻干粉-80 ℃保存。
实施例2
将壳聚糖（分子量：8-12万）溶于0.1M的乳酸中，在冰浴条件下向其中逐滴加入氯化镁/α,β-甘油磷酸钠混合溶液，用NaOH调整pH至6.0，200 转/分搅拌15分钟。溶液中壳聚糖、α,β-甘油磷酸钠和氯化镁浓度如表1所示。将制备好的壳聚糖/α,β-甘油磷酸钠/氯化镁混合溶液进行分装，经过真空冷冻干燥处理后得到冻干粉末，加入去离子水复溶，溶液体积与冻干前相同。考察体系中各物质的浓度对冻干粉复溶性、4 ℃、20 ℃和37 ℃形成水凝胶的影响以及冻干粉长时间放置稳定性。
实验结果如表1所示，壳聚糖/α,β-甘油磷酸钠/氯化镁水凝胶体系是否复溶受氯化镁浓度的影响，当体系中氯化镁浓度过低时，各个体系无法复溶；随着壳聚糖浓度升高，复溶所需氯化镁浓度越高。并且，加入去离子水进行复溶，在充分搅拌情况下，冻干粉复溶时间超过1.0小时。批号5、6和9三种复溶的壳聚糖/甘油磷酸钠/氯化镁溶液形成水凝胶具有温度敏感性，在4 ℃和20 ℃下两周内粘度未发生变化，一直以溶液状态存在，体系稳定性良好。而在37 ℃可以形成水凝胶，所用时间为40-67分钟。冻干粉在4 ℃和25 ℃下放置6个月以后，冻干粉复溶后pH值、粘度与未放置时没有显著性差异，37 ℃形成水凝胶的时间也没有显著性差异。
表 1，壳聚糖/α,β-甘油磷酸钠/氯化镁冻干粉复溶性和水凝胶形成能力
批号 壳聚糖/% α,β-甘油磷酸钠/% 氯化镁/% 是否复溶 4 ℃ 20 ℃ 37℃成胶时间
1 1.3 1.0 0.5 是 溶液 溶液 无法成胶
2 1.3 1.0 1.0 是 溶液 溶液 无法成胶
3 1.3 1.0 1.5 是 溶液 溶液 无法成胶
4 1.5 1.0 0.5 否 - - -
5 1.5 1.0 1.0 是 溶液 溶液 45 min
6 1.5 1.0 1.5 是 溶液 溶液 67 min
7 1.7 1.0 0.5 否 - - -
8 1.7 1.0 1.0 否 - - -
9 1.7 1.0 1.5 是 溶液 溶液 40 min
实施例3
将壳聚糖溶于0.1M的乳酸中，在冰浴条件下向其中逐滴加入氯化钙/α,β-甘油磷酸钠混合溶液，用NaOH调整pH至6.0，100 转/分搅拌15 分钟。溶液中壳聚糖、α,β-甘油磷酸钠和氯化钙浓度如表2所示。混合好的壳聚糖/α,β-甘油磷酸钠/氯化钙混合溶液进行分装，经过真空冷冻干燥得到冻干粉末，加入去离子水复溶，溶液体积与冻干前相同，考察体系中各物质浓度对冻干粉复溶性、4 ℃、20 ℃和37 ℃形成水凝胶的影响以及冻干粉长时间放置稳定性。
实验结果如表2所示，壳聚糖/α,β-甘油磷酸钠/氯化钙水凝胶体系是否复溶受氯化钙浓度的影响，当体系中氯化钙浓度过低时，体系无法复溶，随着壳聚糖浓度升高，复溶所需氯化钙浓度越高。并且，加入去离子水进行复溶时，在充分搅拌情况下，冻干粉复溶时间超过1.0小时。批号为4、5、7、12-17、21-23和25的复溶溶液形成水凝胶具有温度敏感性，在4 ℃和20 ℃下两周内粘度不会发生较大变化，在4 ℃和20 ℃下两周内粘度未发生变化，一直以溶液状态存在，体系稳定性良好。而在37 ℃可以形成水凝胶，所用时间为3-9分钟。并且，冻干粉在4 ℃和25 ℃下放置6个月以后，冻干粉复溶后pH值、粘度与未放置时没有显著性差异，37 ℃形成水凝胶的时间也没有显著性差异。
表2，壳聚糖/α,β-甘油磷酸钠/氯化钙冻干粉的复溶性和水凝胶形成能力
Figure 1
实施例4
将羟丙基壳聚糖溶于去离子水中搅拌2小时，使其完全溶解，在冰浴条件下向其中逐滴加入氯化钙/α,β-甘油磷酸钠混合溶液，溶液中各物质的含量为：羟丙基壳聚糖2%、甘油磷酸钠20%、氯化钙5% 。用NaOH调整pH至6.0，200 转/分搅拌15分钟。将所制备的样品取1毫升于EP管内，进行冷冻干燥处理。向得到的冻干粉末中加入等体积水溶液进行复溶，发现冻干粉可以完全复溶。在4℃和20℃下两周内粘度不会发生较大变化，体系稳定性较好；而在37℃恒温水浴锅中，约4 分钟即可形成凝胶。
实施例5
将壳聚糖溶于0.1M的乳酸中，充分溶解后，在冰浴条件下向其中逐滴加入氯化钙和α-甘油磷酸钠混合水溶液，加入艾塞那肽溶液，然后，用NaOH调整pH至6.0，200 转/分搅拌15 分钟。将制备好的艾塞那肽/壳聚糖/α-甘油磷酸钠/氯化钙混合溶液分装入5 毫升西林瓶。真空冷冻干燥后得到艾塞那肽鼻腔给药冻干粉制剂，加入去离子水进行复溶，在充分搅拌情况下，冻干粉复溶时间超过1.5小时。复溶后溶液中各物质的含量：壳聚糖为1.5%，甘油磷酸钠为1.0%，氯化钙为1.6%，艾塞那肽分别为0.1%、0.3%和0.5%。考察复溶溶液在37℃成胶时间、在4 ℃和20 ℃稳定性和艾塞那肽的体外释放过程。
结果发现，含 0.5%、1.0%和2.0%艾塞那肽的复溶溶液在37℃的凝胶时间分别为8.5、13.6和20.2分钟。在4 ℃和20 ℃条件下，能保持两周以上的溶液状态，溶液粘度没有显著升高。
实施例6
将壳聚糖溶于0.1M的乳酸中，充分溶解后，在冰浴条件下向其中逐滴加入氯化钙和α-甘油磷酸钠混合水溶液，加入艾塞那肽溶液，然后，用盐酸整pH至4.0，200 转/分搅拌15 分钟。将制备好的艾塞那肽/壳聚糖/α-甘油磷酸钠/氯化钙混合溶液分装入5毫升西林瓶。真空冷冻干燥后得到艾塞那肽鼻腔给药冻干粉制剂，加入乳酸钠和氢氧化钠混合溶液进行复溶，稍加振荡，冻干粉快速复溶，时间不超过5分钟。复溶后溶液pH为6.0，复溶后溶液中各物质的含量：壳聚糖为1.5%，甘油磷酸钠为1.0%，氯化钙为1.6%，艾塞那肽分别为0.1%、0.3%和0.5%。考察复溶溶液在37℃成胶时间、在4 ℃和20 ℃稳定性和艾塞那肽的体外释放过程。
结果发现，凝胶体系中艾塞那肽的含量升高，37℃凝胶时间延长，含0.1%、0.3%和0.5%艾塞那肽的水凝胶体系的凝胶时间分别为8.1、14.3和20.0分钟。在4 ℃和20 ℃条件下能保持溶液状态超过两周，溶液粘度没有显著升高。艾塞那肽/壳聚糖/甘油磷酸钠/氯化钙载药凝胶在pH6.0的缓冲液中的释放曲线如附图1所示，艾塞那肽/壳聚糖/甘油磷酸钠/氯化钙载药水凝胶中艾塞那肽的释放时间比磷酸钠缓冲液中的释放时间延长5倍，呈现显著缓释效果。
实施例7
将壳聚糖溶于0.1M的乳酸中，充分溶解后，在冰浴条件下向其中逐滴加入氯化镁和β-甘油磷酸钠混合水溶液，加入艾塞那肽溶液，然后，用NaOH调整pH至6.0，200 转/分搅拌15 分钟。将制备好的艾塞那肽/壳聚糖/β-甘油磷酸钠/氯化镁混合溶液分装入5毫升西林瓶。真空冷冻干燥后得到艾塞那肽鼻腔给药冻干粉制剂，加入去离子水进行复溶，在充分搅拌情况下，冻干粉复溶时间超过1.5小时。复溶后溶液pH6.0，复溶后溶液中各物质的含量：壳聚糖为1.5%，β-甘油磷酸钠为1.1%，氯化镁为1.0%，艾塞那肽为0.1%、0.3%和0.5%。考察复溶溶液在37℃成胶时间、在4 ℃和20 ℃稳定性。
结果发现，凝胶体系中艾塞那肽的含量升高，37℃凝胶时间延长，含0.1%、0.3%和0.5%艾塞那肽的复溶溶液的凝胶时间分别为112.0、123.0和超过150分钟。艾塞那肽加入后，该水凝胶体系仍能保持较好的温敏性，在4 ℃和20 ℃条件下能保持两周以上的溶液状态，溶液粘度没有显著升高。
实施例8
将壳聚糖溶于0.1M的乳酸中，充分溶解后，在冰浴条件下向其中逐滴加入氯化镁和α-甘油磷酸钠混合水溶液，加入艾塞那肽溶液，用盐酸溶液调整pH至4.0，200 转/分搅拌15 分钟。然后，将制备好的艾塞那肽/壳聚糖/β-甘油磷酸钠/氯化镁混合溶液分装入5毫升西林瓶。真空冷冻干燥后得到艾塞那肽鼻腔给药冻干粉制剂，加入乳酸钠和氢氧化钠混合溶液进行复溶，稍加振荡，冻干粉快速复溶，时间不超过10分钟。复溶后溶液pH为6.0，复溶后溶液中各物质的含量：壳聚糖为1.5%，β-甘油磷酸钠为1.1%，氯化镁为1.0%，艾塞那肽为0.1%、0.3%和0.5%。考察复溶溶液在37℃成胶时间、在4 ℃和20 ℃稳定性和艾塞那肽的体外释放过程。
结果发现，含0.1%、0.3%和0.5%艾塞那肽的复溶溶液的37℃凝胶时间分别为110.0、125.0和超过150分钟。并且，复溶溶液在4 ℃和20 ℃条件下能保持两周以上的溶液状态，溶液粘度没有显著升高。艾塞那肽/壳聚糖/甘油磷酸钠/氯化镁载药凝胶在pH6.0的缓冲液中的释放曲线如附图1所示，艾塞那肽/壳聚糖/甘油磷酸钠/氯化镁载药水凝胶中艾塞那肽的释放时间比磷酸钠缓冲液中的释放时间延长5倍，呈现缓释效果。艾塞那肽/壳聚糖/甘油磷酸钠/氯化钙载药凝胶在pH6.0时的释放速度与艾塞那肽/壳聚糖/甘油磷酸钠/氯化镁载药凝胶在pH6.0时的释放速度相近。
实施例9
选取6-8周的SD大鼠，自由采食和饮水，适应环境饲养2天。大鼠分为三组，第一组大鼠鼻腔滴入50 微升Cy7标记的艾塞那肽溶液；第二组大鼠鼻腔滴入50 微升Cy7标记的艾塞那肽/壳聚糖/β-甘油磷酸钠/氯化镁冻干粉复溶溶液，溶液中壳聚糖、甘油磷酸钠和氯化镁含量与实施例7相同；第三组大鼠鼻腔滴入50 微升Cy7标记的艾塞那肽/壳聚糖/β-甘油磷酸钠/氯化钙冻干粉复溶溶液，溶液中壳聚糖、甘油磷酸钠和氯化钙含量与实施例5相同；三个组大鼠所给予的溶液中Cy7标记的艾塞那肽含量为0.1%。给药后30 分钟，处死大鼠，分离各个脏器，置于小动物荧光成像系统中观察艾塞那肽在各个脏器的分布，并进行定量分析。所用激发波长为750 nm，发射波长为800 nm。
三种给药方式导致的艾塞那肽在各个脏器的分布结果如附图2所示，鼻腔给药后，艾塞那肽溶液组荧光强度较弱，说明艾塞那肽进入体内的量较少，生物利用度低，定量分析脏器的荧光强度表明，脑为5.26×108，胃为2.61×109。艾塞那肽/壳聚糖/β-甘油磷酸钠/氯化钙冻干粉复溶溶液组荧光强度主要分布在肝、肾、胃，并且在脑部较弱，定量分析脏器的荧光强度表明，脑为5.11×108，胃为5.04×109。艾塞那肽/壳聚糖/β-甘油磷酸钠/氯化镁冻干粉复溶溶液组荧光强度主要分布在肝、肾、胃和脑部，定量分析脏器的荧光强度表明，脑为6.64×108，胃为8.14×109。这些结果表明，艾塞那肽/壳聚糖/β-甘油磷酸钠/氯化钙冻干粉复溶溶液形成的水凝胶提高了艾塞那肽的生物利用度，但是没有增加艾塞那肽在脑部的分布，只是提高了在胃的分布；艾塞那肽/壳聚糖/β-甘油磷酸钠/氯化镁冻干粉复溶溶液显著提高了艾塞那肽在脑和胃的分布，统计学分析表明，脑部的荧光强度显著高于其它两个组（P<0.05）。说明艾塞那肽/壳聚糖/β-甘油磷酸钠/氯化镁冻干粉复溶溶液不仅提高了艾塞那肽的生物利用度，而且增强了艾塞那肽的脑靶向性。
实施例10
构建SD大鼠肥胖模型，将得到的肥胖SD大鼠随机分为四组，每组6只。组别设置如下：磷酸缓冲液组、艾塞那肽溶液组、艾塞那肽/壳聚糖/甘油磷酸钠/氯化钙冻干粉复溶溶液组和艾塞那肽/壳聚糖/甘油磷酸钠/氯化镁冻干粉复溶溶液组。鼻腔给药溶液体积均为50 µl，艾塞那肽给药量为32 µg/kg，每天分别在上午十点和下午六点两次给药。连续给药9天，检测每天的总进食量和体重变化。实验结束后，将大鼠用4毫升0.8%戊巴比妥钠麻醉剂处死，心耳采血，用于血液生化指标的测定，将所得到的血样，4℃，1500 转/分离心25 分钟，取血清，应用迈瑞BS180型全自动血液生化分析仪测定肥胖型大鼠血清中总胆固醇含量。
实验过程中，各组SD大鼠体重变化结果见附图3，其中，鼻腔滴加磷酸缓冲液和鼻腔给予艾塞那肽溶液都没有减重效果；与鼻腔给予艾塞那肽溶液组相比，鼻腔给予艾塞那肽/壳聚糖/β-甘油磷酸钠/氯化钙冻干粉复溶溶液和艾塞那肽/壳聚糖/β-甘油磷酸钠/氯化镁冻干粉复溶溶液减重效果显著（P<0.05），并且，艾塞那肽/壳聚糖/β-甘油磷酸钠/氯化镁冻干粉复溶溶液组略优于艾塞那肽/壳聚糖/β-甘油磷酸钠/氯化钙冻干粉复溶溶液组。比较血清总胆固醇含量，艾塞那肽/壳聚糖/β-甘油磷酸钠/氯化镁冻干粉复溶溶液组为1.96±0.03（毫摩尔/升），艾塞那肽/壳聚糖/β-甘油磷酸钠/氯化钙冻干粉复溶溶液组2.22±0.06（毫摩尔/升），均显著低于艾塞那肽溶液组 2.44±0.05（P<0.05）。
实施例11
构建SD大鼠肥胖模型，将得到的肥胖SD大鼠随机分为三组，第一组为空白对照组，鼻腔滴加磷酸缓冲液；第二组为高剂量组，鼻腔滴入艾塞那肽/壳聚糖/β-甘油磷酸钠/氯化钙冻干粉复溶溶液50微升，艾塞那肽剂量为300 微克/公斤/天；第三组为低剂量组，鼻腔滴入艾塞那肽/壳聚糖/β-甘油磷酸钠/氯化钙冻干粉复溶溶液50微升，艾塞那肽剂量为100微克/公斤/天。连续给药28天。在进行试验的过程中，动物自由进水，每周检测体重变化。
实验结束后，将大鼠用4毫升0.8%戊巴比妥钠麻醉剂处死，心耳采血，用于血液生化指标的测定，将所得到的血样，4℃离心，1500转/分，离心25分钟，取血清，应用迈瑞BS180型全自动血液生化分析仪测定肥胖型大鼠的血清总胆固醇含量。
艾塞那肽凝胶类药物治疗后大鼠体重的变化情况见附图4，第0周时，各组间大鼠的体重无显著性差异（P>0.05）。第一至第四周，高低剂量组，皮下注射实验组与空白对照组相比，均具有显著性差异（P<0.05）。从鼻腔给药第二周开始至实验结束，与空白对照组相比，300 微克/公斤/天剂量组和100 微克/公斤/天剂量组均有显著的减重效果（P<0.05），且300 微克/公斤/天剂量组的减重效果显著优于100微克/公斤/天（P<0.05）。比较血清总胆固醇含量， 300 微克/公斤/天剂量组为2.03±0.16（毫摩尔/升）和100 微克/公斤/天剂量组为2.23±0.11（毫摩尔/升）均显著低于空白对照组2.57±0.12（毫摩尔/升）（P<0.05）。

Claims (4)

1.一种艾塞那肽鼻腔给药制剂，其特征在于，该制剂为冻干粉形式，复溶溶液组成为：壳聚糖为1.5%，α-甘油磷酸钠为1.0%，氯化钙为1.6%，艾塞那肽质量浓度低于0.5%；或者，壳聚糖为1.5%，β-甘油磷酸钠为1.1%，氯化镁为1.0%，艾塞那肽质量浓度低于0.5%。
2.根据权利要求1所述的给药制剂，其特征在于所说的壳聚糖为壳聚糖及其衍生物，分子量范围为8~37万，脱乙酰度大于80%。
3.根据权利要求2所述的给药制剂，其特征在于所说的壳聚糖为羟丙基壳聚糖或壳聚糖季铵盐。
4.一种如权利要求1所述的艾塞那肽鼻腔给药制剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）室温下将壳聚糖溶解于乳酸溶液中，搅拌至完全溶解；
（2）将甘油磷酸钠和无机盐用水溶解制成混合溶液，在冰浴条件下，将甘油磷酸钠和无机盐混合溶液缓慢加入壳聚糖溶液中，低速搅拌充分混匀；所述的无机盐指氯化钙或者氯化镁；所述的甘油磷酸钠指α-甘油磷酸钠或者β-甘油磷酸钠；
（3）在壳聚糖、甘油磷酸钠和无机盐混合溶液中加入艾塞那肽，调整溶液的pH值至4.0-6.0，冷冻干燥得到冻干粉鼻腔给药制剂。
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