CN106814050A - 超声‑荧光检测多毛类体内石油烃含量的方法 - Google Patents
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Abstract
超声‑荧光检测多毛类体内石油烃含量的方法，油标准液的配置，绘制标准曲线。在105℃条件下将多毛类烘干成粉末，烘干时间16小时，将粉末状多毛类样品与色谱纯二氯甲烷混合进行超声萃取，收集上清液，用色谱纯二氯甲烷平衡8~12小时的60~100目硅胶层析柱，利用20ml二氯甲烷进行洗脱，然后用旋转蒸发仪进行蒸发处理，用正己烷定容至10ml后，用孔径0.22um的尼龙膜过滤后，于激发波长310nm，发射波长360nm，狭缝设置1nm，扫描速度1200nm/min，PMT 700V的条件下进行荧光分光光度测定；从标准曲线中查出相应数值，按照公式W=(m·V)/(F·M)计算出多毛类样品中石油烃含量。
Description
技术领域
本发明属于海洋环境污染监测技术，主要涉及一种测定海洋无脊椎多毛类石油烃含量的方法。
背景技术
石油烃化合物是造成海洋污染的主要物质之一，海洋中的石油烃类富集在海洋生物体内，可以通过食物链传递进而对人体造成危害。多毛类隶属于环节动物门，是广泛分布于海洋近岸和河口潮滩的优势底栖动物，由于其具有体型大、生命周期长、行动缓慢等特点，极易接触并富集沉积质中的石油烃化合物在体内。研究表明，海洋多毛类能够摄入大量的沉积物，通过一系列的转化和分解作用使之成为无毒的代谢产物排出体外，表现出对许多持久性污染物较强的耐受性和生物利用性，因此目前已作为海洋沉积环境污染评价的指示生物和毒理研究的模型动物。故测定其体内石油烃的含量可以深入了解石油烃化合物在其体内的转化和分解，为海洋环境污染监测和海洋风险评估提供新的技术支持。
目前测定海洋生物体内石油烃的含量应用皂化方法处理样品，但是皂化效果的差异会导致样品石油烃含量测定产生巨大的差异性。如果皂化效果不好，萃取液会出现较严重的棕黄色，使得乳化现象严重，影响萃取的效果，从而影响测定结果。此外皂化过程较为复杂耗时，皂化萃取过程中， 试剂加入的顺序、加入水的质量和数量、取样量多少、皂化时间、温度、萃取次数均会影响最终测定结果的准确性。许岩等人（2014）研究了荧光分光光度计法测定贝类产品石油烃含量过程中所产生的不确定度，结果发现贝类产品石油烃测定的不确定度主要由样品的皂化反应处理过程中的损失所致。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够高效便捷、测试结果准确的超声-荧光检测多毛类体内石油烃含量的方法，克服现有技术的不足。
本发明的超声-荧光检测多毛类体内石油烃含量的方法，是利用超声萃取提取多毛类体内石油烃，进而利用荧光检测来测定多毛类体内石油烃含量，所述方法包括以下步骤：
a、油标准液的配置：称取0.1g标准油于称量瓶中，用色谱纯正己烷溶解，全量移入100mL容量瓶中，用色谱纯正己烷稀释至标线，混匀；
将100mL容量瓶中混匀的溶液移取5mL溶液于50mL容量瓶中，用正己烷稀释至标线，混匀，配置成100ug/mL的油标准使用溶液；
分别量取0mL、0.1mL、0.3mL、0.5mL、0.7mL、0.9mL油标准使用溶液于6只10mL具塞比色管中，用色谱纯正己烷稀释至标线混匀；
依次用1cm石英测定池，以正己烷作参比，测定360nm处的荧光强度Ii和I0，并记录测定数据，以荧光强度Ii—I0作为纵坐标，相应以浓度为横坐标，绘制标准曲线；
b、在105℃条件下将多毛类烘干成粉末，烘干时间16小时；
c、将粉末状多毛类样品与色谱纯二氯甲烷混合进行超声萃取，每0.05g粉末状多毛类样品加入1ml色谱纯二氯甲烷，每次超声时间为10min，间隔3min，重复此操作4次，4000 r/min 离心10分钟，收集上清液；
d、将c步骤中收集的上清液加入预先用色谱纯二氯甲烷平衡8~12小时的60~100目硅胶层析柱，利用20ml二氯甲烷进行洗脱；
e、将d步骤获得的洗脱液用旋转蒸发仪进行蒸发处理，用正己烷定容至10ml后，用孔径0.22um的尼龙膜过滤后，于激发波长310nm，发射波长360nm，狭缝设置1nm，扫描速度1200nm/min，PMT 700V的条件下进行荧光分光光度测定；
f、以e步骤所测数据从a步骤的标准曲线中查出相应数值，按照公式W=(m·V)/(F·M)计算出多毛类样品中石油烃含量；其中m代表从标准曲线上查得石油烃的含量，单位为微克每毫升，V为萃取剂的体积，单位为毫升，F代表样品的干湿比；M代表样品的称取量，单位为克；
所述的多毛类为双齿围沙蚕或日本此沙蚕或多齿围沙蚕；所述的样品油为石油原油标准油20-3#。
本发明首次利用超声-荧光检测方法测定了海洋多毛类动物体内石油烃的含量，通过正交实验和数据分析发现，在用二氯甲烷作为溶剂和洗脱剂，超声10分钟重复4次条件下，加标回收率范围在89.3%-94.6%，能够高效并准确测定海洋多毛类动物体内石油烃的含量，这一方法为深入了解石油烃化合物在海洋多毛类动物体内的转化和分解提供技术支持，亦为海洋环境污染监测和海洋风险评估奠定基础。本发明的方法高效便捷、测试结果准确。
附图说明
图1为实施例石油烃检测标准曲线。
具体实施方式
本发明的方法是利用超声萃取提取多毛类体内石油烃，进而利用荧光检测来测定多毛类体内石油烃含量，方法包括以下步骤：
a、油标准液的配置：称取0.1g标准油于称量瓶中，用色谱纯正己烷溶解，全量移入100mL容量瓶中，用色谱纯正己烷稀释至标线，混匀；
将100mL容量瓶中混匀的溶液移取5mL溶液于50mL容量瓶中，用正己烷稀释至标线，混匀，配置成100ug/mL的油标准使用溶液；
分别量取0mL、0.1mL、0.3mL、0.5mL、0.7mL、0.9mL油标准使用溶液于6只10mL具塞比色管中，用色谱纯正己烷稀释至标线混匀；
依次用1cm石英测定池，以正己烷作参比，测定360nm处的荧光强度Ii和I0，并记录测定数据，以荧光强度Ii—I0作为纵坐标，相应以浓度为横坐标，绘制标准曲线；
b、在105℃条件下将多毛类烘干成粉末，烘干时间16小时；
c、将粉末状多毛类样品与色谱纯二氯甲烷混合进行超声萃取，每0.05g粉末状多毛类样品加入1ml色谱纯二氯甲烷，每次超声时间为10min，间隔3min，重复此操作4次，4000 r/min 离心10分钟，收集上清液；
d、将c步骤中收集的上清液加入预先用色谱纯二氯甲烷平衡8~12小时的60~100目硅胶层析柱，利用20ml二氯甲烷进行洗脱；
e、将d步骤获得的洗脱液用旋转蒸发仪进行蒸发处理，用正己烷定容至10ml后，用孔径0.22um的尼龙膜过滤后，于激发波长310nm，发射波长360nm，狭缝设置1nm，扫描速度1200nm/min，PMT 700V的条件下进行荧光分光光度测定；
f、以e步骤所测数据从a步骤的标准曲线中查出相应数值，按照公式W=(m·V)/(F·M)计算出多毛类样品中石油烃含量；其中m代表从标准曲线上查得石油烃的含量，单位为微克每毫升，V为萃取剂的体积，单位为毫升，F代表样品的干湿比；M代表样品的称取量，单位为克；
所述的多毛类为双齿围沙蚕或日本此沙蚕或多齿围沙蚕；所述的样品油为石油原油标准油20-3#。
具体实例如下：绘制标准曲线：用正己烷配置100ug/ml油标准使用液，分别量取0.1mL、0.3mL、0.5mL、0.7mL、0.9mL油标准使用液，用正己烷稀释混匀，以正己烷作为参比，测定360nm处的荧光强度（Ii和I0），以荧光强度（Ii-I0）作为纵坐标，相应以浓度为横坐标，绘制标准曲线（如图1所示）。
双齿围沙蚕或日本此沙蚕或多齿围沙蚕体内石油烃萃取：称取0.3g粉末状双齿围沙蚕样品，加入5mL二氯甲烷萃取剂进行超声萃取，每次萃取时间为10min，重复此操作4次，收集上清液。将获得的上清液加入到硅胶层析柱中，加入20mL二氯甲烷进行洗脱，收集洗脱液。将洗脱液用旋转蒸发仪浓缩至干，用正己烷定容至10mL。
沙蚕体内石油烃的测定：用荧光分光光度计测量其吸光值。荧光扫描条件设置为ex/em=310nm/360nm，狭缝设置1nm，扫描速度1200nm/min，PMT 700V，将所测数据带入标准曲线中计算得出双齿围沙蚕样品中石油烃含量。
实验过程中利用加标回收试验测得回收率范围是89.3%-94.6%，平均值为92.2%。表明该方法提取效率高。
表1 超声波萃取-荧光法测定双齿围沙蚕体内石油烃含量回收率
| 实验次数 | 加标量μg | 测得量μg | 回收率% |
| 1 | 30 | 27.6 | 92 |
| 2 | 30 | 28.4 | 94.6 |
| 3 | 30 | 27.9 | 93 |
| 4 | 30 | 26.8 | 89.3 |
| 平均值 | 27.6 | 92.2 |
Claims (1)
1.一种超声-荧光检测多毛类体内石油烃含量的方法，其特征在于：利用超声萃取提取多毛类体内石油烃，进而利用荧光检测来测定多毛类体内石油烃含量，所述方法包括以下步骤：
a、油标准液的配置：称取0.1g标准油于称量瓶中，用色谱纯正己烷溶解，全量移入100mL容量瓶中，用色谱纯正己烷稀释至标线，混匀；
将100mL容量瓶中混匀的溶液移取5mL溶液于50mL容量瓶中，用正己烷稀释至标线，混匀，配置成100ug/mL的油标准使用溶液；
分别量取0mL、0.1mL、0.3mL、0.5mL、0.7mL、0.9mL油标准使用溶液于6只10mL具塞比色管中，用色谱纯正己烷稀释至标线混匀；
依次用1cm石英测定池，以正己烷作参比，测定360nm处的荧光强度Ii和I0，并记录测定数据，以荧光强度Ii—I0作为纵坐标，相应以浓度为横坐标，绘制标准曲线；
b、在105℃条件下将多毛类烘干成粉末，烘干时间16小时；
c、将粉末状多毛类样品与色谱纯二氯甲烷混合进行超声萃取，每0.05g粉末状多毛类样品加入1ml色谱纯二氯甲烷，每次超声时间为10min，间隔3min，重复此操作4次，4000 r/min 离心10分钟，收集上清液；
d、将c步骤中收集的上清液加入预先用色谱纯二氯甲烷平衡8~12小时的60~100目硅胶层析柱，利用20ml二氯甲烷进行洗脱；
e、将d步骤获得的洗脱液用旋转蒸发仪进行蒸发处理，用正己烷定容至10ml后，用孔径0.22um的尼龙膜过滤后，于激发波长310nm，发射波长360nm，狭缝设置1nm，扫描速度1200nm/min，PMT 700V的条件下进行荧光分光光度测定；
f、以e步骤所测数据从a步骤的标准曲线中查出相应数值，按照公式W=(m·V)/(F·M)计算出多毛类样品中石油烃含量；其中m代表从标准曲线上查得石油烃的含量，单位为微克每毫升，V为萃取剂的体积，单位为毫升，F代表样品的干湿比；M代表样品的称取量，单位为克；
所述的多毛类为双齿围沙蚕或日本此沙蚕或多齿围沙蚕；所述的样品油为石油原油标准油20-3#。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20170609 |