CN106811547B - 一种龟甲胶中龟、牛源性荧光pcr检测引物、探针、试剂盒及检测方法与应用 - Google Patents

一种龟甲胶中龟、牛源性荧光pcr检测引物、探针、试剂盒及检测方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法与应用。本发明的试剂盒检测灵敏度高、特异性好，可以实现龟甲胶中龟、牛源性成分的快速检测。本发明的检测方法能够快速的检测到龟甲胶及其制品中龟、牛源性，从而辨别真伪，具有重复性好、特异性强、准确度高、通量大、使用方便、耗时短的特点。

Description

一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检 测方法与应用
技术领域
本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法与应用。属于胶类中药动物源性检测技术领域。
背景技术
龟甲胶为龟科动物乌龟的背甲及腹甲，经水煎熬、浓缩制成的固体胶。味咸、甘，微寒，归肝、肾和心经，具有滋阴潜阳，益肾强骨，养血补心之功效，主要用于阴虚潮湿，骨蒸盗汗，头晕目眩，虚风内动，筋骨痿软，心虚健忘等。长期服用龟甲胶利于增强机体自身调节，延年益寿，利于阴虚阳亢患者的身体恢复。随着生活水平的不断提高，龟甲胶成为人们进补的首选之一。
据2015年版《中国药典》记载，龟甲胶为龟甲经水煎熬、浓缩制成的固体胶。由于龟甲属于名贵药材，加上近年来对各种龟类动物的严重捕杀，致使龟甲原料的供应有限，随着胶类市场的不断发展，熬胶原料紧缺和原料价格的上涨，部分生产商制作原料用其他动物的杂皮包括猪皮、牛皮等、碎骨代替龟骨，以次充好。这些假冒伪劣产品无论是在外观、色泽和气味上都与正品龟甲胶无明显差别，肉眼很难辨别真假。若消费者长期服用这些伪劣产品，不仅没有任何的治疗效果，服用时间久了还有可能对身体造成伤害。劣质龟甲胶产品的出现影响了整个龟甲胶产业链的健康发展。这就要求发展更加可信、灵敏的检测技术来满足监管部门的质量控制与监管要求。
随着分子生物学技术的发展，一些基于DNA的生物学鉴定手段逐渐丰富起来，DNA分子法主要是利用显示生物特征的各种生物物种所具有的不同DNA序列信息进行鉴别，它可以突破依据感官检测的局限性，与传统分析方法相比，更加具有客观性和准确性。以聚合酶链式反应（PCR）为基础的技术已逐步成为了食品药品中动物源性成分种属鉴定的核心方法。近年来实时荧光PCR技术的飞速发展大大提高了检测的灵敏度、特异性和准确性，并使得成分含量的定量溯源成为可能，由于荧光定量PCR检测整个检测过程为闭管操作，所以有效的减少了实验过程中的污染的风险，目前广泛应用于各个领域。
目前，龟甲胶中以DNA为基础的溯源鉴定工作在不断展开。专利CN103630646A通过质谱法快速鉴别龟甲胶中龟源性成分，专利授权号（CN 103630634A）通过加入限制性内切酶后利用质谱法快速鉴别龟甲胶中是否含有驴、马、牛、猪或羊源性成分。但这些方法均针对龟甲胶中多肽差异性进行鉴定，而由于技术的局限性，灵敏度和假阳性比率相对较高，判定上不够准确。因此，传统的鉴别方法不能满足当前龟甲胶真伪鉴别的要求。而利用实时荧光定量PCR检测龟甲胶中龟、牛源性的研究目前在国内还尚未报道。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法与应用。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测引物，包括两对引物，其核苷酸序列如下：
（1）龟特异性引物：
正向引物F1序列：5’-CTGGGGTAGCTTGGTTCGTT-3’；
反向引物R1序列：5’-GCCTACGGGCCCATATCAAA-3’；
（2）牛特异性引物：
正向引物F2序列：5’-CTGATGGTGCAACCGCTATC-3’；
反向引物R2序列：5’-TCTAGGGCAGGGTTTTGTGTT-3’。
一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测探针，包括：
龟特异性探针P1序列：5’-TTTTGCCGGAAGCACTTTGG-3’；
牛特异性探针P2序列：5’-CCGGAGTAATCCAGGTCGGT-3’。
作为优选的技术方案之一，龟特异性探针序列和牛特异性探针序列的5’端修饰有报告基团，3’端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一种，所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ1、BHQ2中的任一种。
作为优选的技术方案之一，
龟特异性探针P1序列为：5’-FAM-TTTTGCCGGAAGCACTTTGG-BHQ1 3’；
牛特异探针P2序列为：5’-JOE-CCGGAGTAATCCAGGTCGGT-BHQ2 3’。
一种龟甲胶中龟、牛源性PCR检测试剂盒，包括上述荧光PCR检测引物、探针，以及龟甲胶DNA提取液和多重实时荧光PCR反应扩增体系。
作为优选的技术方案之一，所述PCR检测试剂盒还包括内标质控体系，所述内标质控体系包括质控体系引物、质控体系探针和质控体系序列，各核苷酸序列如下：
（1）质控体系引物：
上游引物F：5’- CCTGTATCAACACATAGAAGCAATA -3’；
下游引物R：5’- CTTTTACTTCTTTTAATCTTTCCGA -3’；
（2）质控体系探针CntP：5’-TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT-3’；
（3）质控体系Isqc序列：
CCTGTATCAACACATAGAAGCAATAATGGAGCACGCCGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATTGGTGACCTC GGAAAGATTAAAAGAAGTAAAAGGA。
作为进一步优选的技术方案之一，质控体系探针CntP的5’端修饰有报告基团，3’端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一种，所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ1、BHQ2中的任一种。
作为优选的技术方案之一，所述PCR检测试剂盒还包括龟和牛阳性标准品、阴性对照品和空白对照品。作为优选的技术方案之一，所述多重实时荧光PCR反应扩增体系包括：2×qPCR Master Mix 10μL，引物对10μM取1μL，探针用量P1（龟）和P2（牛）终浓度各0.25μM，DNA用量1～50ng/μL取2μL，用双蒸水补足20μL。
上述引物、探针或试剂盒在鉴别龟甲胶中龟和牛源性成分中的应用。
一种龟甲胶中龟、牛源性多重实时荧光定量PCR检测（Multiplex QuantitativeReal-time PCR）方法，包括以下步骤：
（1）提取待测样品DNA，选择靶基因，并进行引物设计和含有阳性扩增内标DNA的重组质粒的构建；
（2）使用上述试剂盒进行PCR扩增；
（3）设立阳性对照、阴性对照及空白对照，分析实验结果，给出第n个循环时的荧光增加值ΔRn与扩增曲线Ct值，根据不同探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定龟甲胶中是否含有龟和牛源性成分。
作为优选的技术方案之一，步骤（1）中DNA的提取按照专利CN201410317118.7中阿胶DNA提取技术进行提取。
作为优选的技术方案之一，步骤（1）中靶基因选自线粒体16SrDNA基因，因为相比基因组而言，线粒体在组织中拷贝数高，而且龟甲胶经过深度加工后破坏程度相对小。
作为优选的技术方案之一，步骤（1）中，阳性内标DNA的重组质粒的构建方法如下：使用DNA随机生成软件产生一段DNA序列，使其在NCBI中Blast后没有出现与之同源的DNA片段，在这段随机DNA序列设计如SEQ ID NO.7所示的上游引物和如SEQ ID NO.8所示的下游引物序列，从而形成111bp的阳性扩增内标DNA序列（如SEQ ID NO.10所示），将这段阳性扩增内标序列委托人工基因合成，合成片段连接载体PMD18-T，转化感受态DH5a，质粒提取，并测序验证，得到能与龟和牛源性各自的特异性引物，如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，从而构建阳性内标DNA的重组质粒。各核苷酸序列见表1。
表1. 引物探针序列
Figure DEST_PATH_IMAGE002
作为优选的技术方案之一，步骤（2）是将引物及探针放入同一反应体系中共同扩增，无需开管，避免污染。PCR反应体系见表2。
表2. PCR反应体系
Figure 161007DEST_PATH_IMAGE003
作为优选的技术方案之一，步骤（2）中的PCR扩增条件为：95℃，10min；95℃，10s；63℃，35s，在此收集荧光信号，45个循环。
本发明的有益效果：
本发明的试剂盒检测灵敏度高、特异性好，可以实现龟甲胶中龟、牛源性成分的快速检测。
本发明的检测方法能够快速的检测到龟甲胶及其制品中龟、牛源性，从而辨别真伪，具有重复性好、特异性强、准确度高、通量大、使用方便、耗时短的特点。同时，本发明的方法有效克服了龟甲胶成品经过高温炮制导致DNA降解而导致提取困难不完整的难题，在龟甲胶生产加工质量监控及监管部门在监管中具有很高的应用价值。
附图说明
图1为FAM荧光修饰龟源性特异探针有扩增曲线，说明待测样本检出龟源性成分。
图2为JOE荧光修饰牛源性特异探针有扩增曲线，说明待测样本检出牛源性成分。
图3为FAM和JOE荧光修饰探针同时有扩增曲线，说明待测样本检出龟和牛源性成分。
图4为试剂盒龟源性检测灵敏度扩增曲线图，检测限为0.01ng。
图5为试剂盒牛源性检测灵敏度扩增曲线图，检测限为0.01ng。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
本发明中所用实验材料、试剂与仪器如下：
实验材料：
鹿、龟、鱼、牛、驴、马、狐狸、水貂、貉子、狗、兔、鸡、鸭、鹅、骆驼、玉米等动物皮张或新鲜组织，龟甲胶不同批次的样品共20份，均购自济南市各大药店。
所用试剂：
动物组织提取试剂盒为OMEGA品牌。DNA分子量MakerDL1000、电泳上样缓冲液等PCR反应试剂购自宝生物工程（大连）有限公司。引物与探针由生工生物工程（上海）有限公司负责合成。2×TaqMan Master Mix为DBI Bioscience品牌。DNA测序由山东省农业科学院生物技术中心测序中心完成。
所用仪器：ABI 7500荧光定量PCR仪为ABI公司产品，Takara PCR仪为宝生物工程（大连）有限公司产品。5424 D型高速离心机为Eppendorf公司产品。
实施例1
龟甲胶样品DNA提取，采用专利201410317118.7（一种从阿胶中快速提取DNA的试剂盒及其提取方法）中公开的方法进行提取，步骤不再赘述，提取的基因组DNA经紫外分光光度计测定其纯度和浓度。测定OD260/OD280值均为1.8～1.9左右，浓度在10ng/μl以上，说明DNA纯度较高，浓度适中，符合PCR扩增要求。
1、靶基因的选择和引物的设计：相比基因组而言，线粒体在组织中拷贝数高，而且龟甲胶经过深度加工后破坏程度相对小，所以优先选用线粒体16SrDNA基因。设计龟和牛通用外侧引物及内侧引物，扩增片段小，使引物与靶点更容易结合。引物探针序列见表1。
2、龟甲胶中龟源性成分的定量检测：选用20μL的实时荧光多重PCR扩增体系，含TaqMan reaction Mix（2x）10μl，Gui-P 2.0 μM, Bovine -P 2.0 μM，龟特异性正反向引物Gui F / Gui R 5.0 μM，牛特异性正反向引物NF /NR 5.0 μM，待测样本总DNA 2.0 μL，用双蒸水补足20 μL反应体系。阴性模板对照加无菌双蒸水。20μL反应体系见表2。
3、本发明优先选用PCR扩增条件：PCR扩增条件为：95℃3min； 95℃ 10s，62℃，35s，在此收集荧光信号，45个循环。
4、结果分析：每次试验设立阳性对照、阴性对照及空白对照，试验结束后打开分析软件，分析实验结果，给出ΔRn（第n个循环时的荧光增加值）与扩增曲线Ct值，根据不同探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定龟甲胶中是否含有龟和牛源性成分。结果见图1，FAM荧光修饰龟源性特异探针有扩增曲线时，说明待检样本检出龟源性成分，图2，JOE荧光修饰牛源性特异探针有扩增曲线时，说明待检样本检出牛源性成分，图3，FAM荧光修饰龟源性特异探针和JOE荧光修饰牛特异探针同时有扩增曲线时，说明为样本同时检出龟和牛源性成分。
实施例2 特异性验证
利用本发明设计的引物和探针，分别以鹿、龟、鱼、牛、驴、马、狐狸、水貂、貉子、狗、兔、鸡、鸭、鹅、骆驼、玉米等动物皮张或新鲜组织的总基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR检测，验证其引物和探针的特异性。其结果见表3，结果表明本研究所设计的探针及引物具有很强的特异性。
表3. 特异性验证试验
Figure DEST_PATH_IMAGE004
实施例3 灵敏度实验
将龟、牛基因组DNA分别定量到50 ng，按10×梯度稀释（10-1，10-2，10-3，10-4，10-5），每个梯度均取2.0 μL为模板量，（即：10 ng，1 ng，0.1 ng，0.01 ng，0.001 ng）进行实时荧光定量PCR检测，评估本发明的检测限。见图4和图5，结果表明本方法定量检测限为0.1ng，说明本发明所提供的方法具有很高的灵敏度。
实施例4 实际样品检测应用
市售样本20份，不同品牌厂家及不同生产批次，按照本发明提供的检测方法，提取DNA后进行实时荧光PCR检测，见表4，其中8份样品检测出龟源性，3份检测出牛源性，5份样本同时检测出龟和牛源性成分，4份样本未检出龟和牛源性。说明本发明提供的检测方法具有很好的应用价值。
表4. 实际样本检测
样本编号 检测结果
1、3、7、10、14、15、18、20 检出龟源性成分
5、6、11 检出牛源性成分
9、12、17、19 未检出龟和牛源性成分
2、4、8、13、16 检出龟和牛源性成分
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学研究院生物技术研究中心
<120> 一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测引物、探针组合物、试剂盒及检测方
法与应用
<130> 2017
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 龟特异性引物F1
<400> 1
ctggggtagc ttggttcgtt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 龟特异性引物R1
<400> 2
gcctacgggc ccatatcaaa 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 牛特异性引物F2
<400> 3
ctgatggtgc aaccgctatc 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 牛特异性引物R2
<400> 4
tctagggcag ggttttgtgt t 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 龟特异性探针P1
<400> 5
ttttgccgga agcactttgg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 牛特异性探针P2
<400> 6
ccggagtaat ccaggtcggt 20
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 质控体系引物F
<400> 7
cctgtatcaa cacatagaag caata 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 质控体系引物R
<400> 8
cttttacttc ttttaatctt tccga 25
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 质控体系探针CntP
<400> 9
tgacgctagt aggcaagtac gctccatt 28
<210> 10
<211> 111
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 质控体系IsqcP序列
<400> 10
cctgtatcaa cacatagaag caataatgga gcacgccgta agcttaacct gacgctagta 60
ggcaagtacg ctccattggt gacctcggaa agattaaaag aagtaaaagg a 111

Claims (8)

1.一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测引物及探针，其特征在于，检测引物，其核苷酸序列如下：
（1）龟特异性引物：
正向引物F1序列：5’-CTGGGGTAGCTTGGTTCGTT-3’；
反向引物R1序列：5’-GCCTACGGGCCCATATCAAA-3’；
（2）牛特异性引物：
正向引物F2序列：5’-CTGATGGTGCAACCGCTATC-3’；
反向引物R2序列：5’-TCTAGGGCAGGGTTTTGTGTT-3’；
检测探针，包括：
龟特异性探针P1序列：5’-TTTTGCCGGAAGCACTTTGG-3’；
牛特异性探针P2序列：5’-CCGGAGTAATCCAGGTCGGT-3’；
龟特异性探针序列和牛特异性探针序列的5’端修饰有报告基团，3’端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一种，所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ1、BHQ2中的任一种。
2.一种龟甲胶中龟、牛源性PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的荧光PCR检测引物、探针，以及龟甲胶DNA提取液和多重实时荧光PCR反应扩增体系。
3.根据权利要求2所述的一种龟甲胶中龟、牛源性PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂盒还包括内标质控体系，所述内标质控体系包括质控体系引物、质控体系探针和质控体系序列，各核苷酸序列如下：
（1）质控体系IsqcP序列：
CCTGTATCAACACATAGAAGCAATAATGGAGCACGCCGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATTGGTGACCTC GGAAAGATTAAAAGAAGTAAAAGGA；
（2）质控体系引物：
上游引物F：5’- CCTGTATCAACACATAGAAGCAATA -3’；
下游引物R：5’- CTTTTACTTCTTTTAATCTTTCCGA -3’；
（3）质控体系探针CntP：5’-TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT-3’。
4.根据权利要求2所述的一种龟甲胶中龟、牛源性PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂盒还包括龟和牛阳性标准品、阴性对照品和空白对照品。
5.根据权利要求2所述的一种龟甲胶中龟、牛源性PCR检测试剂盒，其特征在于，所述多重实时荧光PCR反应扩增体系包括：2×qPCR Master Mix 10×10μL，龟特异性引物F1/R1mix 5μM取1μL，牛特异性引物F2/R2 mix 5μM取1μL，质控体系引物F/R mix 2～5μM取1μL，龟特异性探针P1/牛特异性探针P2/质控体系探针CntP mix 2μM 取1μL，含有质控体系IsqcP序列的质粒DNA0.01ng/μL取1μL，DNA用量1～20ng/μL取2μL，用双蒸水补足20μL。
6.权利要求2所述的试剂盒在鉴别龟甲胶中龟和牛源性成分中的应用。
7.一种龟甲胶中龟、牛源性多重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取待测样品DNA，选择靶基因，并进行引物设计和含有阳性扩增内标DNA的重组质粒的构建；
（2）使用权利要求2所述的试剂盒进行PCR扩增；
（3）设立阳性对照、阴性对照及空白对照，分析实验结果，给出第n个循环时的荧光增加值ΔRn与扩增曲线Ct值，根据不同探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定龟甲胶中是否含有龟和牛源性成分。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中的PCR扩增条件为：95℃3min； 95℃ 10s，62℃ 35s，在此收集荧光信号，45个循环。
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