CN106811477B - 一种葡糖苷酶多拷贝表达提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法 - Google Patents

一种葡糖苷酶多拷贝表达提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种葡糖苷酶多拷贝表达提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，属于基因工程领域。本发明方法包括如下步骤：（1）构建以启动子序列‑信号肽编码序列‑葡糖苷酶编码序列‑终止子序列为基本单元的葡糖苷酶多拷贝表达盒。表达盒中各单元的信号肽编码序列均不相同。（2）在葡糖苷酶多拷贝表达盒两端加入限制性内切酶识别位点序列，通过限制性内切酶、DNA连接酶将表达盒构建到表达载体上。（3）将构建的重组表达载体转化到里氏木霉中，转化有重组载体的里氏木霉菌株纤维素酶酶活得到提高。本发明利用不同的信号肽进行组合，避免相同信号肽竞争，从而提高了里氏木霉所产纤维素酶的酶活。

Description

一种葡糖苷酶多拷贝表达提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种葡糖苷酶多拷贝表达提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法。
背景技术
里氏木霉纤维素酶是一种广泛应用的酶类，里氏木霉具有胞外表达酶量大等优点，是工业生产酶制剂中广泛应用的菌种。里氏木霉产生的纤维素酶酶系组成中，纤维素葡糖苷酶的活力相对较低。已有的提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法是通过基因工程的手段导入纤维素葡糖苷酶基因，提高葡糖苷酶的酶活；或者敲除某一些外分泌蛋白，降低外分泌蛋白的分泌量，从而提高纤维素酶蛋白的分泌量。
一些多克隆研究中，有些通过多克隆的基因表达量增加的不多，或者是三拷贝的基因克隆与二拷贝的基因克隆相比，目标基因表达量几乎没有大的提升。已有的多克隆增加基因表达量的方法采用的都是相同的信号肽，信号肽对胞外酶的分泌具有重要的影响。信号肽与其连接的蛋白构成一个分泌的蛋白整体，这个蛋白整体的电荷分布、分子量大小、蛋白的形状等都影响到分泌的效率。相同信号肽连接的蛋白在外分泌的过程中可能有分泌竞争存在，这样即使是二克隆或三克隆表达的蛋白不能迅速分泌向胞外。
发明内容
本发明的目的在于提供一种葡糖苷酶多拷贝表达提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，以及通过该方法得到的里氏木霉菌株。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种葡糖苷酶多拷贝表达提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，包括如下步骤：
（1）构建以启动子序列-信号肽编码序列-葡糖苷酶编码序列-终止子序列为基本单元的葡糖苷酶多拷贝表达盒。表达盒中各单元的信号肽编码序列均不相同；相邻两个单元之间优选通过连接序列连接。
（2）在葡糖苷酶多拷贝表达盒两端加入限制性内切酶识别位点序列，通过限制性内切酶、DNA连接酶将表达盒构建到表达载体上。
（3）将构建的重组表达载体转化到里氏木霉中，转化有重组载体的里氏木霉菌株纤维素酶酶活得到提高。
步骤（1）中所述的葡糖苷酶多拷贝表达盒的组成优选为：启动子序列-信号肽1编码序列-葡糖苷酶编码序列-终止子序列-连接序列-启动子序列-信号肽2编码序列-葡糖苷酶编码序列-终止子序列-连接序列-启动子序列-信号肽3编码序列-葡糖苷酶编码序列-终止子序列。所述的启动子序列、信号肽1编码序列、葡糖苷酶编码序列、终止子序列、连接序列、信号肽2编码序列、信号肽3编码序列分别优选如SEQ ID NO.1-7所示。
步骤（2）中所述的表达载体优选为pCAMBIA1300；所述的限制性内切酶优选为EcoRI和PmeI。
步骤（3）优选通过农杆菌将构建的重组载体转化到里氏木霉中。
步骤（3）中所述的里氏木霉优选为里氏木霉ATCC24449。
一种里氏木霉菌株，为上述转化有重组载体的里氏木霉菌株。
本发明具有如下优点和有益效果：本发明利用不同的信号肽进行组合，避免相同信号肽竞争，从而提高了里氏木霉所产纤维素酶的酶活。
具体实施方式
实施例1
1、材料
里氏木霉ATCC24449，质粒pCAMBIA1300（Biovector），农杆菌EHA105，大肠杆菌DH5α，限制性内切酶（TakaRA）等。
合成的两段有酶切位点的多拷贝表达片段1。多拷贝表达片段1的序列组成为：CCGAATTC（EcoRI酶切位点序列）-启动子序列-信号肽1编码序列-葡糖苷酶编码序列-终止子序列-终止子与启动子之间的连接序列（连接序列）-启动子序列-信号肽2编码序列-葡糖苷酶编码序列-终止子序列-连接序列-启动子序列-信号肽3编码序列-葡糖苷酶编码序列-终止子序列-GTTTAAACGG（PmeI酶切位点序列）。其中，启动子序列如SEQ ID NO.1所示，信号肽1编码序列如SEQ ID NO.2所示，葡糖苷酶编码序列如SEQ ID NO.3所示，终止子序列如SEQ ID NO.4所示，连接序列SEQ ID NO.5所示，信号肽2编码序列如SEQ ID NO.6所示，信号肽3编码序列如SEQ ID NO.7所示。
2、方法
一、重组质粒的构建
（1）质粒pCAMBIA1300的提取
含有pCAMBIA1300的大肠杆菌DH5α接种到含有卡那霉素的LB培养基（LB培养基：氯化钠1%，蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，121℃灭菌20min，加入微孔过滤的卡那霉素，卡那霉素在LB中的终浓度为30µg/mL）中，35℃培养过夜。使用质粒小提试剂盒（天根生化科技有限公司，DP103）按照说明书说明提取pCAMBIA1300质粒，提取步骤如下：
使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。
1）柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12000rpm（13400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
2）取2mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm（13400×g）离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
3）向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
4）向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
5）向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm（13400×g）离心10min。
6）将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm（13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
7）可选步骤：向吸附柱CP3中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm（13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。如果宿主菌是endA+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM系列，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），这步可省略。
8）向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
9）重复操作步骤8）。
10）将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm（13400×g）离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
11）将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm（13400×g）离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μL，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为了增加质粒的回收率，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm（13400×g）离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。
（2）质粒pCAMBIA1300、多拷贝表达片段1的酶切和电泳
往41μL pCAMBIA1300质粒溶液或多拷贝表达片段1溶液中加入2μL EcoRI、2μLPmeI和5μL酶切缓冲液，总体积为50.0µL，在30℃酶切2h。使用琼脂糖凝胶电泳试剂盒（上海一基实业有限公司）进行电泳。
1）打开试剂盒，依照说明书清点各种试剂，并按实验需要量将50×电泳缓冲液稀释为1×电泳缓冲液待用；将核酸荧光染料与6×Loading Buffer按1:1比例混合备用。
2）把U型凝胶托盘放入制胶槽中，插好梳子，置于一水平面上。
3）将0.25g琼脂糖加到盛有适当体积1×电泳缓冲液的三角瓶或玻璃瓶中（常用凝胶浓度0.8-1.2%）。
4）将瓶口用封口膜轻轻盖住，在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖完全熔化（熔化到没有小颗粒物为止）。
5）将温热的凝胶溶液倒入U型凝胶托盘中（超过二分之一处）。
6）将凝胶室温放置15-30min完全冷却至凝固，小心拔除梳子，将凝胶托盘移入电泳槽，梳井（点样孔）一端朝负极方向，加入1×电泳缓冲液，使凝胶全部被浸没。
7）将样品与6×Loading Buffer和核酸荧光染料充分混合（20μL样品+1μL 6×Loading Buffer+1μL核酸荧光染料），用微量移液器将以上混合物缓慢加入梳井内，注意避免引入气泡。
8）盖上电泳槽盖，样品应向阳极（红色插头）泳动，提供5-10V/cm的电压。
9）当样品与染料在凝胶中迁移到足够距离时，关上电源，拔出电极插头和打开电泳槽盖，在DNA电泳图谱观察仪中观察核酸条带。
（3）胶回收
使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收质粒pCAMBIA1300、多拷贝表达片段1的酶切、电泳产物。
1）从琼脂糖凝胶中割下含目的条带的胶块，称重。
2）加入胶块重量3-6倍的Buffer B2，50℃水浴5-10分钟溶胶。
3）选做，对于<500bp的片段，加入1/3 Buffer B2体积的异丙醇。
4）将溶胶液移入吸附柱中，8000×g离心30秒。倒掉收集管中液体。
5）加入500μL Wash Solution，9000×g离心30秒，倒掉收集管中液体。
6）重复步骤5）一次。
7）空吸附柱于9000×g离心1分钟。
8）将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入15-40μL ElutionBuffer，室温静置1分钟后，离心1分钟。保存管中DNA溶液。
（4）质粒pCAMBIA1300和多拷贝表达片段1的连接
使用DNA Ligation Kit Ver.2.1（Takara）进行连接。
1）将酶切的质粒pCAMBIA1300与酶切的多拷贝表达片段1混合制备成体积为10μL的DNA溶液，质粒溶液和多拷贝表达片段1溶液的体积比为1:3。
2）向上述DNA溶液中加入等体积的 Solution I，充分混匀。
3）16℃反应12h。
（5）大肠杆菌的转化和筛选
1）从-80℃冰箱中取100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞悬液，冰上溶解10分钟。
2）取10μL上述连接产物加入感受态细胞中，轻轻摇匀，冰上放置30分钟。
3）42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却2分钟。
4）加入890μL LB 液体培养基（不含Kan），混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（KanR）。
5）将上述菌液摇匀后取100μL涂布于含Kan的LB筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。
大肠杆菌转化子长出后挑取部分转化子接种于LB液体培养基，37℃、200rpm培养12-16小时后，提质粒验证，验证正确的重组质粒命名为pCAMBIA1300-pc1。
二、农杆菌介导转化里氏木霉及里氏木霉转化子的发酵
（1）农杆菌感受态细胞的制备
1）在新活化的农杆菌EHA105的LB平板（LB液体培养基添加5%琼脂）上，挑取单克隆于LB液体培养基。
2）28℃、220r/min振荡培养至OD600达到0.6-0.7。
3）取1.5mL无菌离心管，每管分装1mL菌液，6000r/min离心10min。
4）去除上清，用1mL 10%无菌甘油重悬菌体，6000r/min离心10min，重复此过程3次，充分洗涤菌体以去除残留的培养基。
5）洗好的菌体用100μL 20%无菌甘油重悬，-70℃保存备用。
（2）农杆菌的转化
1）将100µL农杆菌EHA105感受态细胞置于冰上，加入10µL重组质粒pCAMBIA1300-pc1，充分混匀，冰上放置30min。
2）置液氮中快速冷却约1min后迅速转入37℃水浴中，待其融化。
3）加1mL无抗生素的YM 液体培养基（酵母膏0.3%，胰蛋白胨0.5%，麦芽糖0.5%，自然pH）于28℃、230r/min培养2-4h。
4）3000r/min离心2min收集菌体，将上清吸去500µL，剩余液体重悬培养菌后直接涂布含氨苄霉素30µg/mL的YM平板，28℃、230r/min培养24h。
5）挑取单菌落接种到含氨苄霉素的YM液体培养基中，28℃、250r/min 培养48h，将菌液用于保存-20℃，得到含有重组质粒pCAMBIA1300-pc1的农杆菌。
（3）里氏木霉菌丝的制备
1）从-80℃冰箱取出甘油管保藏的里氏木霉ATCC24449菌株，置于室温下，快速解冻。
2）吸取适量菌液加到淀粉培养基平板上，用涂布棒将菌液涂布均匀（或者用无菌接种环蘸取适量菌液作平板划线分离），34℃恒温培养5天。
3）待平板上长出单菌落后，用无菌牙签挑取单菌落移至装有察氏培养基的三角瓶中，34℃培养5天。
4）将三角瓶中菌液全部转移至50mL离心管，8000rpm离心5min，弃去上清。
5）加入20mL生理盐水，反复吹打混匀，8000rpm离心洗涤 5min，弃上清，再加入适量生理盐水重悬使菌体浓度OD600值达到1.5左右，留待转化用。
（4）农杆菌转化里氏木霉
1）试剂的配制
无机盐液：将2.61g KCl、7.48g KH2PO4和29.8g NaNO3溶于80mL水中，再加水定容至100mL，用5M KOH调pH至5.5，高压灭菌，4℃保存。
50%葡萄糖（w/v）：50g葡萄糖溶于90mL蒸馏水中，定容至100mL，高压灭菌。
1M MgSO4：24.7g MgSO4溶于90mL蒸馏水中，定容至100mL，高压灭菌。
MM微量元素溶液：将1.1g H3BO3、2.1g ZnSO4·7H2O、0.16g CuSO4·5H2O、0.5gMnC12·4H2O、0.5g FeSO4·7H2O、0.17g CoC12·6H2O、0.15g Na2MoO4·2H2O和0.1g EDTA溶于90mL蒸馏水中，定容至100mL，高压灭菌，4℃保存。
MM选择培养平板：取20mL无机盐溶液、20mL 50%葡萄糖溶液、2mL 1M MgSO4溶液、1mL MM微量元素溶液加入到957mL经高压灭菌含有20g琼脂粉的蒸馏水中使总体积至1L，充分混匀（即琼脂浓度2%）。当温度降至60℃，加入1mL 100mg/mL潮霉素B（终浓度100μg/mL）和1mL 0.2M头孢噻肟（终浓度0.2mM），加入1mL 200mM乙酰丁香酮（终浓度0.2mM)，混合均匀后制成MM选择培养平板。
PDA培养基：①称量和熬煮：按培养基配方逐一称取去皮土豆。土豆切成小块放入锅中，加水1000mL，在加热器上加热至沸腾，维持20-30min，用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。②加热溶解：把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15-20g（提前搞碎），然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，待琼脂完全溶解后，再补充水分至所1000mL。
2）农杆菌转化里氏木霉
在含有200μM乙酰丁香酮的IM培养基平板上贴一层玻璃纸滤膜（尽量不要产生气泡），将100μL里氏木霉菌丝悬液与100μL转化有重组质粒pCAMBIA1300-pc1的农杆菌培养液等体积混合均匀后涂布于滤膜上，22.5℃避光培养3天。将滤膜转移至含有200μM头孢噻肟（目的杀死农杆菌细胞）和100μg/mL潮霉素的MM选择培养基平板，30℃培养4-6天，筛选转化成功的转化子命名为里氏木霉pc1。
（5）里氏木霉转化子发酵
转化子选育：将里氏木霉pc1接种到PDA平板上，30℃培养 6d，得到孢子。挑取的孢子用无菌水稀释到孢子浓度为1×107/mL，涂布PDA平板，30℃培养72h得到单菌落，单菌落接种到PDA斜面，30℃培养108h左右，得到里氏木霉pc1选育的孢子。同时以出发菌株里氏木霉ATCC24449作为对照。
接种发酵：选育的孢子接种于装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，孢子最终浓度为1×108孢子/mL发酵培养液，30℃、130r/m培养96h。其中，发酵培养基组成：MM微量元素液5mL，麸皮23g，甘蔗渣（粉碎过20目筛）15g，玉米芯12g，微晶纤维素5g，蛋白胨2g，自来水定容至1L。
发酵结束后，用滤纸过滤发酵液，测定滤液的纤维素酶酶活，纤维素酶酶活测定方法按照文献（冯月，蒋建新，朱莉伟，菅红磊。纤维素酶活力及混合纤维素酶协同作用的研究。北京林业大学学报，2009，第31卷，增刊1）。测定得到，里氏木霉pc1发酵液的滤纸酶活为3.7U/mL，葡糖苷酶酶活为28U/mL，纤维素内切酶酶活为18U/mL，外切酶酶活为0.31U/mL；里氏木霉ATCC24449的滤纸酶活为2.9U/mL，葡糖苷酶酶活为19U/mL，纤维素内切酶酶活为17U/mL，外切酶酶活为0.30U/mL。从结果可以看出，转化子的纤维素酶活显著增加，葡糖苷酶的酶活增加。从该结果可以看出，多克隆基因工程实现了葡糖苷酶酶活的大幅度上升，酶活性比例的改变更适宜于纤维素酶复合酶系降解纤维素。
对比试验1
除多拷贝表达片段1中三个信号肽编码序列全部为信号肽1编码序列外，其余操作同实施例1。
最后筛选得到的里氏木霉转化子发酵液的滤纸酶活为3.2U/mL，葡糖苷酶酶活为22U/mL，纤维素内切酶酶活为18U/mL，外切酶酶活为0.31U/mL。
对比试验2
除多拷贝表达片段1中的信号肽2编码序列替换为信号肽1编码序列外，其余操作同实施例1。
最后筛选得到的里氏木霉转化子发酵液的滤纸酶活为滤纸酶活为3.0U/mL，葡糖苷酶酶活为19U/mL，纤维素内切酶酶活为18U/mL，外切酶酶活为0.31U/mL。
从对比试验结果可以看出，信号肽序列的组合对纤维素酶的酶活有很大影响。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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taccacctcg tgctgtgaga gcagatgagg ttcttatagt ttctatgtca gagtcttctg 60
gtttcccgat aactctgaaa agttgtttcc cattatagcc ctttggagga gcctaaggta 120
acgggtcgat agacagtgaa gtagttttcc tgtcatcttt tccttccacc gtggatgttt 180
acggtagtaa cgctatttcc tttccgatag caagttctac ggagacggct gtcaccaggg 240
tttctacctg ggggtgggtg ctcctcgtag cacctttttc ttctgcaagg ttggtgcaga 300
agtttcgttc acctaactac actattgtac cacctcgtgc tgtgagagca gatgaggttc 360
ttatagtttc tatgtcagag tcttctggtt tcccgataac tctgaaaagt tgtttcccat 420
tatagccctt tggaggagcc taaggtaacg ggtcgataga cagtgaagta gttttcctgt 480
catcttttcc ttccaccgtg gatgtttacg gtagtaacgc tatttccttt ccgatagcaa 540
gttctacgga gacggctgtc accagggttt ctacctgggg gtgggtgctc ctcgtagcac 600
ctttttcttc tgcaaggttg gtgcagaagt ttcgttcacc taactacact atagaggtga 660
ctgcattccc tactgcgtgt tagggtgata ggaagcgttc tggaaggaga tatattcctt 720
caagtaaagt aaacctctcc tgtgcgactt tagtggtcag agagagatgt ttagatagag 780
a 781
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 信号肽1编码序列
<400> 2
atgtcgttcc gatctctact cgccctgagc ggcctcgtct gcacagggtt ggca 54
<210> 3
<211> 2526
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 葡糖苷酶编码序列
<400> 3
gatgaattgg cctactcccc tccgtattac ccctcccctt gggccaatgg ccagggtgac 60
tgggcggaag cataccagcg cgctgttgat atcgtctcgc agatgacatt ggctgagaag 120
gtcaatttga ctacgggaac tggatgggaa ttggaattat gtgttggtca gactggaggt 180
gttccccgat tgggagttcc gggaatgtgt gcacaggata gccctctggg tgttcgtgac 240
tccgactaca actctgcgtt ccccgccggt gtcaacgtgg ccgcaacctg ggacaagaat 300
ctggcttacc tgcgtggcca ggctatgggt caggagttta gtgacaaggg tgctgatatc 360
caattgggtc cagctgccgg ccctctcggt agaagtcccg acggcggtcg taactgggag 420
ggcttctccc ccgacccggc cctcagtggt gtgctctttg cagagacaat caagggtatt 480
caggatgctg gtgtggttgc aacggctaag cactacatcg cctacgagca ggagcatttc 540
cgtcaggcgc ctgaagctca aggctacgga ttcaatatta ccgagagtgg aagcgcgaac 600
ctcgacgata agactatgca tgagctgtac ctctggccct tcgcggatgc catccgtgca 660
ggtgccggtg ctgtgatgtg ctcgtacaac cagatcaaca acagctatgg ctgccagaac 720
agctacactc tgaacaagct gctcaaggct gagctgggtt tccagggctt tgtcatgagt 780
gattgggcgg ctcaccatgc cggtgtgagt ggtgctttgg cgggattgga catgtctatg 840
ccgggagacg tcgattacga cagtggcacg tcttactggg gtaccaactt gaccatcagt 900
gtgctcaacg ggacggtgcc ccaatggcgt gttgatgaca tggctgtccg catcatggcc 960
gcctactaca aggtcggccg tgaccgtctg tggactcctc ccaacttcag ctcatggacc 1020
agagatgaat acggcttcaa gtactactat gtctcggggg gaccgtatga gaaggtcaac 1080
cagttcgtga atgtgcaacg caaccatagc gagttgatcc gccgtattgg agcagacagc 1140
acggtgctcc tcaagaacga tggcgctctt cccttgactg gaaaggagcg cttggtcgcc 1200
cttatcggag aagatgcggg ttccaatcct tatggtgcca acggctgcag tgaccgtggg 1260
tgcgacaatg gaacattggc gatgggctgg ggaagtggca ctgccaactt tccctacttg 1320
gtgacccccg agcaggccat ctcgaacgag gtgctcaaga acaagaatgg cgtattcact 1380
gcgaccgata actgggctat tgatcagatt gaggcgcttg ctaagaccgc cagtgtctct 1440
cttgtctttg tcaacgccga ctctggtgag ggttatatca atgtcgacgg aaacctgggt 1500
gaccgcagga acctgaccct gtggaggaac ggcgacaatg tgatcaaggc tgctgctagc 1560
aactgcaaca acacgatcgt tattattcac tctgtcggcc cagtcttggt taacgagtgg 1620
tacgacaacc ccaatgttac cgctattctc tggggtggtc ttcccggtca ggagtctggc 1680
aactccctcg ccgacgtgct ctacggccgt gtcaaccccg gtgccaagtc gcccttcacc 1740
tggggcaaga ctcgtgaggc ctaccaagat tacttgtaca ccgagcccaa caacggcaac 1800
ggagcgcccc aggaagactt cgtcgagggc gtcttcattg actaccgcgg atttgacaag 1860
cgcaacgaga ctcctatcta tgagttcggc tatggtctga gctacactac cttcaactac 1920
tcgaaccttc aggtggaggt tctgagcgcc cctgcgtacg agcctgcttc gggcgagact 1980
gaggcagcgc cgactttcgg agaggtcgga aatgcgtcgg attacctcta ccccgatgga 2040
ctgcagagaa tcaccaagtt catctacccc tggctcaaca gtaccgatct tgaggcgtct 2100
tctggggatg ctagctatgg gcaggatgcc tcagactatc ttcccgaggg agccaccgat 2160
ggctctgcgc aaccgatcct gcctgccggt ggtggtgctg gcggcaaccc tcgcctgtac 2220
gacgagctca tccgcgtgac ggtgactatc aagaacaccg gcaaggttgc gggtgataaa 2280
gttcctcaac tgtatgtttc tcttggcggc cctaacgaac ccaagatcgt gctgcgtcaa 2340
ttcgagcgta tcacgctgca gccgtcggaa gagacgcagt ggagcacgac tctgacgcgc 2400
cgtgaccttg cgaactggaa tgttgagacg caggactggg agattacgtc gtatcccaag 2460
atggtgtttg tcggaagctc ctcgcggaag ctgccgctcc gggcgtctct gcctactgtt 2520
cactaa 2526
<210> 4
<211> 726
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 终止子序列
<400> 4
tctagaaaga aggattacct ctaaacaagt gtacctgtgc attctgggta aacgactcat 60
aggagagttg taaaaaagtt tcggccggcg tattgggtgt tacggagcat tcactaggca 120
accatggtta ctattgtata cccatcttag taggaatgat tttcgaggtt tatacctacg 180
atgaatgtgt gtcctgtagg cttgagagtt caaggaagaa acagtgcaat tatctttgcg 240
aacccagggg ctggtgacgg aattttcata gtcaagctat cagagtaaag aagaggagca 300
tgtcaaagta caattagaga caaatatata gtcgcgtgga gccaagagcg gattcctcag 360
tctcgtaggt ctcttgacga ccgttgatct gcttgatctc gtctcccgaa aatgaaaata 420
gactctgcta agctattctt ctgcttcgcc ggagcctgaa gggcgtacta gggttgcgag 480
gtccaatgca ttaatgcatt gcagatgagc tgtatctgga agaggtaaac ccgaaacgcg 540
ttttattctt gttgacatgg agctattaaa tcactagaag gcactctttg ctgcttggac 600
aaatgaacgt atcttatcga gatcctgcac accatttgtc tcaactccgg agctgacatc 660
gacaccaacg atcttatatc cagattcgtc aagctgtttg atgatttcag taacgttaag 720
tggatc 726
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 连接序列
<400> 5
gctgtgttgg cgggcccgaa aggcc 25
<210> 6
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 信号肽2编码序列
<400> 6
atgaagcaag cgattggagc cgtggttctg gcgctgggca gtctgggtgc cgctgcaccc 60
cag 63
<210> 7
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 信号肽3编码序列
<400> 7
atgcgggccc tgtgggctct tgcacccgtt ctcttccctg ctgtgagcgc t 51

Claims (6)

1.一种葡糖苷酶多拷贝表达提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)构建如下组成的葡糖苷酶多拷贝表达盒：启动子序列-信号肽1编码序列-葡糖苷酶编码序列-终止子序列-连接序列-启动子序列-信号肽2编码序列-葡糖苷酶编码序列-终止子序列-连接序列-启动子序列-信号肽3编码序列-葡糖苷酶编码序列-终止子序列；所述的启动子序列、信号肽1编码序列、葡糖苷酶编码序列、终止子序列、连接序列、信号肽2编码序列、信号肽3编码序列分别如SEQ ID NO.1-7所示；
(2)在葡糖苷酶多拷贝表达盒两端加入限制性内切酶识别位点序列，通过限制性内切酶、DNA连接酶将表达盒构建到表达载体上；
(3)将构建的重组表达载体转化到里氏木霉中，转化有重组载体的里氏木霉菌株纤维素酶酶活得到提高。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的表达载体为pCAMBIA1300。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的限制性内切酶为EcoRI和PmeI。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)通过农杆菌将构建的重组载体转化到里氏木霉中。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述的里氏木霉为里氏木霉ATCC24449。
6.一种里氏木霉菌株，其特征在于：为权利要求1-5中任一项所述的转化有重组载体的里氏木霉菌株。
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