CN106801037A - 体外痤疮炎症模型的建立方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种体外痤疮炎症模型的建立方法及其应用，所述体外痤疮炎症模型的建立方法为，用痤疮丙酸杆菌感染RAW264.7细胞，建立炎症模型。所述的体外痤疮炎症模型的应用，用于治疗痤疮药物的体外活性筛选和活性评价。本发明的优点在于：该体外痤疮炎症模型的建立方法不仅操作简单，而且所用的RAW264.7细胞株是永生化细胞株，较体外角质形成细胞更易获得；本发明建立的体外痤疮炎症模型可用于研究痤疮粉刺的形成抑制和皮脂腺细胞中雄激素的代谢等研究；本发明建立的体外痤疮炎症模型还可用于治疗痤疮药物的体外活性筛选和活性评价中。

Description

体外痤疮炎症模型的建立方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种体外痤疮炎症模型的建立方法及其应用。
背景技术
痤疮又称粉刺、青春痘，是一种慢性炎症性皮肤病，好发于青少年，发病率高达70％-87％。痤疮累及部位在毛囊皮脂腺，常伴有皮脂溢出，可表现为多种不同的皮损类型，包括粉刺、丘疹、结节、脓疱、囊肿、瘢痕等，好发于头面、胸、背和肩。痤疮病因复杂，但未完全明了，主要有以下四个方面：(1)皮脂腺过度分泌；(2)毛囊导管阻塞；(3)痤疮丙酸杆菌感染；(4)炎症因子的产生和作用。为研究痤疮，人们模仿痤疮的发病机理制造各种痤疮动物模型，这些模型用于研究痤疮粉刺的形成抑制和皮脂腺细胞中雄激素的代谢等研究。
目前的实验模型主要有体内动物模型和体外模型。体内实验动物模型包括兔耳模型、金黄地鼠模型，犀牛模型和墨西哥无毛犬模型。虽然有许多痤疮的动物模型，但没有一种完全能模仿人的痤疮临床表现和病理改变的模型。动物模型主要有四个方面的问题：(1)痤疮丙酸杆菌只存在于人体皮肤的表面，动物模型没有看到这种细菌，需人为接种；(2)动物皮脂腺分泌的皮脂和人类的不同，人体皮脂成分的变化与皮脂腺角化异常有关；(3)动物模型痤疮粉刺形成的机理和人类是不同的；(4)人类的寻常痤疮是依赖于雄激素，而动物模型是由外用化学物质引起，和人类氯痤疮相类似。
体外模型主要集中在表皮角质形成细胞和皮脂腺细胞培养。永生化细胞系SZ95，SEB-1，和SEB-E6E7细胞在体外培养成功克服了以前培养不超过6周的缺点，使得能够从供体获得了大量的皮脂腺细胞成为可能，可是国内没有这三种细胞株。体外角质形成细胞培养大部分用于药物的抗炎作用并研究其机制。从新生儿包皮中分离角质形成细胞进行培养，并用加热灭活P.acnes诱导炎症的产生，但是临床上新生儿包皮不容易获得。
由于痤疮的发病机制的复杂，单一痤疮型不能很好的满足实验要求，因此人们仍不断寻找痤疮的新模型。
发明内容
本发明的目的在于提供一种原材料易获得、操作简单的体外痤疮炎症模型的建立方法及其应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：一种体外痤疮炎症模型的建立方法，用痤疮丙酸杆菌感染RAW264.7细胞，建立炎症模型。
所述的体外痤疮炎症模型的应用，用于治疗痤疮药物的体外活性筛选和活性评价。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
该体外痤疮炎症模型的建立方法不仅操作简单，而且所用的RAW264.7细胞株是永生化细胞株，较体外角质形成细胞更易获得。
本发明建立的体外痤疮炎症模型可用于研究痤疮粉刺的形成抑制和皮脂腺细胞中雄激素的代谢等研究。
本发明建立的体外痤疮炎症模型还可用于治疗痤疮药物的体外活性筛选和活性评价中。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明内容进行详细说明：
一种体外痤疮炎症模型的建立方法，用痤疮丙酸杆菌感染RAW264.7细胞，建立炎症模型。
所述的体外痤疮炎症模型的建立方法，它的具体操作步骤如下：
(1)制备痤疮丙酸杆菌灭活液；
(2)培养小鼠巨噬细胞RAW264.7，并将培养后的小鼠巨噬细胞RAW264.7分为空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组这5个组；
(3)除空白组外，其他4组均接种相同浓度的痤疮丙酸杆菌灭活液进行感染刺激；
(4)配制5-氨基酮戊酸液；在经步骤(3)后的治疗一组、治疗二组以及治疗三组中分别给予等量的不同终浓度的5-氨基酮戊酸液；而经步骤(3)后的模型组以及空白组中加入PBS液，其中，PBS液的加入量与治疗一组中的5-氨基酮戊酸液加入量相同；之后空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组分别置于培养箱中培养4-6h；
(5)给予经步骤(4)后的空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组15-20J/cm2的红光照射，之后吸出旧的培养基，加入0.5-1.5mL新的培养基，置于培养箱中培养10-30h后取出；
(6)收集经步骤(5)后的空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组中的上清液；
(7)采用ELISA法检测步骤(6)所得的上清液中的TNF-α浓度和IL-6浓度。
其中，步骤(1)中制备痤疮丙酸杆菌灭活液的具体步骤如下：挑取单个痤疮丙酸杆菌(痤疮丙酸杆菌来自广东省微生物研究所，ATCC6919)的菌落，并接种于厌氧脑心浸液肉汤培养基(所述厌氧脑心浸液肉汤培养基购自青岛海博生物技术有限公司)中，在37.0-37.5℃厌氧环境下培养2-4d，用麦氏比浊法计数，以生理盐水调配痤疮丙酸杆菌浓度至2.25×107cells/ml，90.0-98.0℃水灭活10-20min。
步骤(2)中小鼠巨噬细胞RAW264.7的培养方法为：将小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株(购自上海细胞生物研究所)按浓度为2.25×105个/mL接种于黑色6孔板中，每孔1-3mL，置于培养箱中，培养过夜。
步骤(3)的具体操作方法为：除空白组外，其他4组均给予终浓度为2.25×107cells/ml的痤疮丙酸杆菌灭活液刺激1-3h，其中痤疮丙酸杆菌的接种量为感染复数MOI＝100：1～1000:1，即痤疮丙酸杆菌与小鼠巨噬细胞RAW264.7的数量比为100：1～1000:1。
步骤(4)中，经步骤(3)后的治疗一组、治疗二组以及治疗三组中给予的5-氨基酮戊酸液的终浓度分别为0.03、0.06、0.12mmol/L。
步骤(7)中采用ELISA法检测上清液中的TNF-α浓度和IL-6浓度的具体步骤为：
a、加样：在反应板中设置空白孔(无加任何液体)、标准孔以及待测样品孔；在标准孔中从左到右加入不同浓度的标准品TNF-α和IL-6；待测样品孔中加入50μL的步骤(6)所得的上清液，反应板充分混匀，在36.5-37.5℃之间反应30-50分钟；
b、洗板：反应板用洗涤液充分洗涤4-6次，用滤纸印干；
c、除空白孔外，每孔加入蒸馏水50ul和第一抗体工作液50ul，反应板充分混匀后置于36.5-37.5℃下反应15-25分钟；
d、洗板：同步骤b；
e、除空白孔外，每孔加入酶标抗体工作液100ul，反应板充分混匀后置于36.5-37.5℃下反应5-15分钟；
f、洗板：同步骤b；
g、除空白孔外，每孔各加底物工作液100ul，置于36.5-37.5℃暗处，反应10-20分钟；
h、除空白孔外，每孔加终止液100ul，充分混匀，并在20-30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
实施例一：
一种体外痤疮炎症模型的建立方法，它的具体操作步骤如下：
(1)制备痤疮丙酸杆菌灭活液：挑取单个痤疮丙酸杆菌(广东省微生物研究所，ATCC6919)的菌落，并接种于厌氧脑心浸液肉汤培养基(购自青岛海博生物技术有限公司)中，在37.0℃厌氧环境下培养2d，用麦氏比浊法计数，以生理盐水调配痤疮丙酸杆菌浓度至2.25×107cells/ml，95℃水灭活15min。
(2)将小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株(购自上海细胞生物研究所)，按浓度为2.25×105个/mL接种于黑色6孔板中，每孔1mL，置于培养箱中，培养过夜。将培养后的小鼠巨噬细胞RAW264.7分为空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组这5个组；
(3)除空白组外，其他4组均给予终浓度为2.25×107cells/ml的痤疮丙酸杆菌灭活液刺激1h，其中痤疮丙酸杆菌的接种量为感染复数MOI＝100：1。
(4)配制5-氨基酮戊酸液；在经步骤(3)后的治疗一组、治疗二组以及治疗三组中给予等量的终浓度分别为0.03、0.06、0.12mmol/L的5-氨基酮戊酸液；而经步骤(3)后的模型组以及空白组中加入PBS液，其中，PBS液的加入量与治疗一组中的5-氨基酮戊酸液的加入量相同；之后空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组分别置于培养箱中培养4h；
其中所述5-氨基酮戊酸液的配制方法为：称取15.7mg 5-氨基酮戊酸散(购自上海复旦张江生物医药股份有限公司)，用10ml PBS溶液溶解，得12mmol/L的5-氨基酮戊酸液；
(5)给予经步骤(4)后的空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组15J/cm2的红光照射，之后吸出旧的培养基，加入0.5mL新的培养基，置于培养箱中培养10h后取出；所述培养基为厌氧脑心浸液肉汤培养基。
(6)收集经步骤(5)后的空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组中的上清液；
(7)采用ELISA法检测步骤(6)所得的上清液中的TNF-α浓度和IL-6浓度。
其中，步骤(7)中采用ELISA法检测上清液中的TNF-α浓度和IL-6浓度的具体步骤为：
a、加样：在反应板中设置空白孔(无加任何液体)、标准孔以及待测样品孔；在标准孔中从左到右加入不同浓度的标准品TNF-α和标准品IL-6；待测样品孔中加入50μL的步骤(6)所得的上清液，反应板充分混匀，在36.5℃下反应30分钟；
其中，所述的标准品TNF-α和标准品IL-6来自上海西唐生物科技有限公司生产的小鼠TNF-α、IL-6ELISA试剂盒；标准品TNF-α的浓度为：5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL，0.312ng/mL，0.156ng/mL，0.078ng/mL，0ng/mL；标准品IL-6的浓度为：5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL，0.312ng/mL，0.156ng/mL，0.078ng/mL，0ng/mL
b、洗板：反应板用洗涤液充分洗涤4次，用滤纸印干；其中，所述的洗涤液来自上海西唐生物科技有限公司生产的小鼠TNF-α、IL-6ELISA试剂盒。
c、除空白孔外，每孔加入蒸馏水50ul和第一抗体工作液50ul，反应板充分混匀后置于36.5℃下反应15分钟；其中，所述第一抗体工作液来自上海西唐生物科技有限公司生产的小鼠TNF-α、IL-6ELISA试剂盒。
d、洗板：同步骤b；
e、除空白孔外，每孔加入酶标抗体工作液(所述酶标抗体工作液来自上海西唐生物科技有限公司生产的小鼠TNF-α、IL-6ELISA试剂盒)100ul，反应板充分混匀后置于36.5℃下反应5分钟；
f、洗板：同步骤b；
g、除空白孔外，每孔各加底物工作液(底物工作液来自上海西唐生物科技有限公司生产的小鼠TNF-α、IL-6ELISA试剂盒)100ul，置于36.5℃暗处，反应10分钟；
h、除空白孔外，每孔加终止液(终止液来自上海西唐生物科技有限公司生产的小鼠TNF-α、IL-6ELISA试剂盒)100ul，充分混匀，并在20分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
实施例一的实验结果如下：
1、空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组的TNF-α的浓度分别为0.24±0.01、0.34±0.02、0.04±0.01、0.03±0.01、0.03±0.01pg/mL，F(方差值)＝1123.636，P(概率)＝0.001，说明这5个数据之间具有显著性差异。进一步用Tambane’S T2检验，模型组和空白组比较，P＝0.006，有显著性差异；治疗一组和模型组比较，P＝0.001，有显著性差异；治疗二组和空白组比较，P＝0.001，有显著性差异；治疗三组和治疗一组比较，P＝0.440，无显著性差异。
2、空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组的IL-6的浓度分别为0.01±0.01、0.21±0.03、0.09±0.01、0.08±0.01、0.07±0.01pg/ml，F＝114.813，P＝0.001，说明这5个数据之间有显著性差异。进一步用Tambane’S T2检验，模型组和空白组比较，P＝0.009，有显著性差异；治疗二组和模型组比较，P＝0.031，有显著性差异；治疗三组和治疗一组比较，P＝0.003，有显著性差异。
结论：用痤疮丙酸杆菌灭活液感染RAW264.7细胞，在感染后的1h采用ELISA法检测RAW264.7细胞培养上清IL-6和TNF-α的吸光度，同时以PBS刺激为阴性对照，TNF-α和IL-6较空白组高，说明造模成功。
实施例二：
一种体外痤疮炎症模型的建立方法，它的具体操作步骤如下：
(1)制备痤疮丙酸杆菌灭活液：挑取单个痤疮丙酸杆菌(广东省微生物研究所，ATCC6919)的菌落，并接种于厌氧脑心浸液肉汤培养基(购自青岛海博生物技术有限公司)中，在37.5℃厌氧环境下培养4d，用麦氏比浊法计数，以生理盐水调配痤疮丙酸杆菌浓度至2.25×107cells/ml，90℃水灭活20min。
(2)将小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株(购自上海细胞生物研究所)，按浓度为2.25×105个/mL接种于黑色6孔板中，每孔3mL，置于培养箱中，培养过夜。将培养后的小鼠巨噬细胞RAW264.7分为空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组这5个组；
(3)除空白组外，其他4组均给予终浓度为2.25×107cells/ml的痤疮丙酸杆菌灭活液刺激3h，其中痤疮丙酸杆菌的接种量为感染复数MOI＝1000：1。
(4)配制5-氨基酮戊酸液；在经步骤(3)后的治疗一组、治疗二组以及治疗三组中给予等量的终浓度分别为0.03、0.06、0.12mmol/L的5-氨基酮戊酸液；而经步骤(3)后的模型组以及空白组中加入PBS液，其中，PBS液的加入量与治疗一组中的5-氨基酮戊酸液加入量相同；之后空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组分别置于培养箱中培养6h；
其中所述5-氨基酮戊酸液的配制方法为：称取15.7mg 5-氨基酮戊酸散(购自上海复旦张江生物医药股份有限公司)，用10ml PBS溶液溶解，得12mmol/L的5-氨基酮戊酸液；
(5)给予经步骤(4)后的空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组20J/cm2的红光照射，之后吸出旧的培养基，加入1.5mL新的培养基，置于培养箱中培养30h后取出；所述培养基为厌氧脑心浸液肉汤培养基。
(6)收集经步骤(5)后的空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组中的上清液；
(7)采用ELISA法检测步骤(6)所得的上清液中的TNF-α浓度和IL-6浓度。
其中，步骤(7)中采用ELISA法检测上清液中的TNF-α浓度和IL-6浓度的具体步骤为：
a、加样：在反应板中设置空白孔(无加任何液体)、标准孔以及待测样品孔；在标准孔中从左到右加入不同浓度的标准品TNF-α和标准品IL-6；待测样品孔中加入50μL的步骤(6)所得的上清液，反应板充分混匀，在37.5℃下反应50分钟；
其中，所述的标准品TNF-α和标准品IL-6来自上海西唐生物科技有限公司生产的小鼠TNF-α、IL-6ELISA试剂盒；标准品TNF-α的浓度为：5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL，0.312ng/mL，0.156ng/mL，0.078ng/mL，0ng/mL；标准品IL-6的浓度为：5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL，0.312ng/mL，0.156ng/mL，0.078ng/mL，0ng/mL
b、洗板：反应板用洗涤液充分洗涤6次，用滤纸印干；其中，所述的洗涤液来自上海西唐生物科技有限公司生产的小鼠TNF-α、IL-6ELISA试剂盒。
c、除空白孔外，每孔加入蒸馏水50ul和第一抗体工作液50ul，反应板充分混匀后置于37.5℃下反应25分钟；其中，所述第一抗体工作液来自上海西唐生物科技有限公司生产的小鼠TNF-α、IL-6ELISA试剂盒。
d、洗板：同步骤b；
e、除空白孔外，每孔加入酶标抗体工作液(所述酶标抗体工作液来自上海西唐生物科技有限公司生产的小鼠TNF-α、IL-6ELISA试剂盒)100ul，反应板充分混匀后置于37.5℃下反应15分钟；
f、洗板：同步骤b；
g、除空白孔外，每孔各加底物工作液(底物工作液来自上海西唐生物科技有限公司生产的小鼠TNF-α、IL-6ELISA试剂盒)100ul，置于37.5℃暗处，反应20分钟；
h、除空白孔外，每孔加终止液(终止液来自上海西唐生物科技有限公司生产的小鼠TNF-α、IL-6ELISA试剂盒)100ul，充分混匀，并在30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
实施例二的实验结果如下：
1、空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组的TNF-α的浓度分别为0.22±0.01、0.32±0.02、0.05±0.01、0.04±0.01、0.03±0.01pg/mL，F(方差值)＝1023.821，P(概率)＝0.001，说明这5个数据之间具有显著性差异。进一步用Tambane’S T2检验，模型组和空白组比较，P＝0.005，有显著性差异；治疗一组和模型组比较，P＝0.003，有显著性差异；治疗二组和空白组比较，P＝0.002，有显著性差异；治疗三组和治疗一组比较，P＝0.432，无显著性差异。
2、空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组的IL-6的浓度分别为0.01±0.01、0.30±0.03、0.10±0.01、0.08±0.01、0.06±0.01pg/ml，F＝105.721，P＝0.001，说明这5组数据之间具有显著性差异。进一步用Tambane’S T2检验，模型组和空白组比较，P＝0.008，有显著性差异；治疗二组和模型组比较，P＝0.023，有显著性差异；治疗三组和治疗一组比较，P＝0.002，有显著性差异。
结论：用痤疮丙酸杆菌灭活液感染RAW264.7细胞，在感染后的3h采用ELISA法检测RAW264.7细胞培养上清IL-6和TNF-α的吸光度，同时以PBS刺激为阴性对照，TNF-α和IL-6较空白组高，说明造模成功。
实施例三：
一种体外痤疮炎症模型的建立方法，它的具体操作步骤如下：
(1)制备痤疮丙酸杆菌灭活液：挑取单个痤疮丙酸杆菌(广东省微生物研究所，ATCC6919)的菌落，并接种于厌氧脑心浸液肉汤培养基(购自青岛海博生物技术有限公司)中，在37.2℃厌氧环境下培养3d，用麦氏比浊法计数，以生理盐水调配痤疮丙酸杆菌浓度至2.25×107cells/ml，98℃水灭活10min。
(2)将小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株(购自上海细胞生物研究所)，按浓度为2.25×105个/mL接种于黑色6孔板中，每孔2mL，置于培养箱中，培养过夜。将培养后的小鼠巨噬细胞RAW264.7分为空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组这5个组；
(3)除空白组外，其他4组均给予终浓度为2.25×107cells/ml的痤疮丙酸杆菌灭活液刺激2h，其中痤疮丙酸杆菌的接种量为感染复数MOI＝100：1。
(4)配制5-氨基酮戊酸液；在经步骤(3)后的治疗一组、治疗二组以及治疗三组中给予等量的终浓度分别为0.03、0.06、0.12mmol/L的5-氨基酮戊酸液；而经步骤(3)后的模型组以及空白组中加入PBS液，其中，PBS液的加入量与治疗一组中的5-氨基酮戊酸液加入量相同；之后空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组分别置于培养箱中培养5h；
其中所述5-氨基酮戊酸液的配制方法为：称取15.7mg 5-氨基酮戊酸散(购自上海复旦张江生物医药股份有限公司)，用10ml PBS溶液溶解，得12mmol/L的5-氨基酮戊酸液；
(5)给予经步骤(4)后的空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组18J/cm2的红光照射，之后吸出旧的培养基，加入1mL新的培养基，置于培养箱中培养20h后取出；所述培养基为厌氧脑心浸液肉汤培养基。
(6)收集经步骤(5)后的空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组中的上清液；
(7)采用ELISA法检测步骤(6)所得的上清液中的TNF-α浓度和IL-6浓度。
其中，步骤(7)中采用ELISA法检测上清液中的TNF-α浓度和IL-6浓度的具体步骤为：
a、加样：在反应板中设置空白孔(无加任何液体)、标准孔以及待测样品孔；在标准孔中从左到右加入不同浓度的标准品TNF-α和标准品IL-6；待测样品孔中加入50μL的步骤(6)所得的上清液，反应板充分混匀，在37℃下反应40分钟；
其中，所述的标准品TNF-α和标准品IL-6来自上海西唐生物科技有限公司生产的小鼠TNF-α、IL-6ELISA试剂盒；标准品TNF-α的浓度为：5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL，0.312ng/mL，0.156ng/mL，0.078ng/mL，0ng/mL；标准品IL-6的浓度为：5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL，0.312ng/mL，0.156ng/mL，0.078ng/mL，0ng/mL
b、洗板：反应板用洗涤液充分洗涤5次，用滤纸印干；其中，所述的洗涤液来自上海西唐生物科技有限公司生产的小鼠TNF-α、IL-6ELISA试剂盒。
c、除空白孔外，每孔加入蒸馏水50ul和第一抗体工作液50ul，反应板充分混匀后置于37℃下反应20分钟；其中，所述第一抗体工作液来自上海西唐生物科技有限公司生产的小鼠TNF-α、IL-6ELISA试剂盒。
d、洗板：同步骤b；
e、除空白孔外，每孔加入酶标抗体工作液(所述酶标抗体工作液来自上海西唐生物科技有限公司生产的小鼠TNF-α、IL-6ELISA试剂盒)100ul，反应板充分混匀后置于37℃下反应10分钟；
f、洗板：同步骤b；
g、除空白孔外，每孔各加底物工作液(底物工作液来自上海西唐生物科技有限公司生产的小鼠TNF-α、IL-6ELISA试剂盒)100ul，置于37℃暗处，反应15分钟；
h、除空白孔外，每孔加终止液(终止液来自上海西唐生物科技有限公司生产的小鼠TNF-α、IL-6ELISA试剂盒)100ul，充分混匀，并在25分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
实施例三的实验结果如下：
1、空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组的TNF-α的浓度分别为0.22±0.01、0.35±0.03、0.05±0.01、0.04±0.01、0.03±0.01pg/mL，F(方差值)＝1223.726，P(概率)＝0.001，说明这5组数据之间具有显著性差异。进一步用Tambane’S T2检验，模型组和空白组比较，P＝0.007，有显著性差异；治疗一组和模型组比较，P＝0.002，有显著性差异；治疗二组和空白组比较，P＝0.002，有显著性差异；治疗三组和治疗一组比较，P＝0.520，无显著性差异。
2、空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组的IL-6的浓度分别为0.02±0.01、0.24±0.03、0.10±0.02、0.08±0.01、0.05±0.01pg/ml，F＝124.750，P＝0.001，说明这5组数据之间具有显著性差异。进一步用Tambane’S T2检验，模型组和空白组比较，P＝0.008，有显著性差异；治疗二组和模型组比较，P＝0.026，有显著性差异；治疗三组和治疗一组比较，P＝0.004，有显著性差异。
结论：用痤疮丙酸杆菌灭活液感染RAW264.7细胞，在感染后的2h采用ELISA法检测RAW264.7细胞培养上清IL-6和TNF-α的吸光度，同时以PBS刺激为阴性对照，TNF-α和IL-6较空白组高，说明造模成功。

Claims (9)

1.一种体外痤疮炎症模型的建立方法，其特征在于：用痤疮丙酸杆菌感染RAW264.7细胞，建立炎症模型。
2.根据权利要求1所述的体外痤疮炎症模型的建立方法，其特征在于：它的具体操作步骤如下：
(1)制备痤疮丙酸杆菌灭活液；
(2)培养小鼠巨噬细胞RAW264.7，并将培养后的小鼠巨噬细胞RAW264.7分为空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组这5个组；
(3)除空白组外，其他4组均接种相同浓度的痤疮丙酸杆菌灭活液进行感染刺激；
(4)配制5-氨基酮戊酸液；在经步骤(3)后的治疗一组、治疗二组以及治疗三组中分别给予等量的不同终浓度的5-氨基酮戊酸液；而经步骤(3)后的模型组以及空白组中加入PBS液，其中，PBS液的加入量与治疗一组中的5-氨基酮戊酸液的加入量相同；之后空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组分别置于培养箱中继续培养；
(5)给予经步骤(4)后的空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组红光照射，之后吸出旧的培养基，加入新的培养基，置于培养箱中培养；
(6)收集经步骤(5)后的空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组中的上清液；
(7)采用ELISA法检测步骤(6)所得的上清液中的TNF-α浓度和IL-6浓度。
3.根据权利要求2所述的体外痤疮炎症模型的建立方法，其特征在于：步骤(1)中制备痤疮丙酸杆菌灭活液的具体步骤如下：挑取单个痤疮丙酸杆菌的菌落，并接种于厌氧脑心浸液肉汤培养基中，在37.0-37.5℃厌氧环境下培养2-4d，用麦氏比浊法计数，以生理盐水调配痤疮丙酸杆菌浓度至2.25×107cells/ml，90.0-98.0℃水灭活10-20min。
4.根据权利要求2所述的体外痤疮炎症模型的建立方法，其特征在于：步骤(2)中小鼠巨噬细胞RAW264.7的培养方法为：将小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株，按浓度为2.25×105个/mL接种于黑色6孔板中，每孔1-3mL，置于培养箱中，培养过夜。
5.根据权利要求2所述的体外痤疮炎症模型的建立方法，其特征在于：步骤(3)的具体操作方法为：除空白组外，其他4组均给予终浓度为2.25×107cells/ml的痤疮丙酸杆菌灭活液刺激1-3h，其中痤疮丙酸杆菌的接种量为感染复数MOI＝100：1～1000:1。
6.根据权利要求2所述的体外痤疮炎症模型的建立方法，其特征在于：步骤(4)中，经步骤(3)后的治疗一组、治疗二组以及治疗三组中给予的5-氨基酮戊酸液的终浓度分别为0.03、0.06、0.12mmol/L。
7.根据权利要求2所述的体外痤疮炎症模型的建立方法，其特征在于：步骤(5)的具体操作方法为：给予经步骤(4)后的空白组、模型组、治疗一组、治疗二组以及治疗三组15-20J/cm2的红光照射，之后吸出旧的培养基，加入0.5-1.5mL新的培养基，置于培养箱中培养10-30h后取出。
8.根据权利要求2所述的体外痤疮炎症模型的建立方法，其特征在于：步骤(7)中采用ELISA法检测上清液中的TNF-α浓度和IL-6浓度的具体步骤为：
a、加样：在反应板中设置空白孔、标准孔以及待测样品孔；在标准孔中从左到右加入不同浓度的标准品TNF-α和IL-6；待测样品孔中加入50μL的步骤(6)所得的上清液，反应板充分混匀，在36.5-37.5℃之间反应30-50分钟；
b、洗板：反应板用洗涤液充分洗涤4-6次，用滤纸印干；
c、除空白孔外，每孔加入蒸馏水50ul和第一抗体工作液50ul，反应板充分混匀后置于36.5-37.5℃下反应15-25分钟；
d、洗板：同步骤b；
e、除空白孔外，每孔加入酶标抗体工作液100ul，反应板充分混匀后置于36.5-37.5℃下反应5-15分钟；
f、洗板：同步骤b；
g、除空白孔外，每孔各加底物工作液100ul，置于36.5-37.5℃暗处，反应10-20分钟；
h、除空白孔外，每孔加终止液100ul，充分混匀，并在20-30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的体外痤疮炎症模型的应用，其特征在于：用于治疗痤疮药物的体外活性筛选和活性评价中。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115322951A (zh) * 2022-07-27 2022-11-11 广东博溪生物科技有限公司 一种类痤疮表型的体外重组表皮模型及构建方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101023947A (zh) * 2006-02-24 2007-08-29 江传箕 用于杀菌、抑菌和抗炎的组合物及其方法
EP1814534B1 (en) * 2004-11-10 2010-06-02 Photocure ASA Derivatives of 5-aminolevulinic acid for the treatment of acne

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1814534B1 (en) * 2004-11-10 2010-06-02 Photocure ASA Derivatives of 5-aminolevulinic acid for the treatment of acne
CN101023947A (zh) * 2006-02-24 2007-08-29 江传箕 用于杀菌、抑菌和抗炎的组合物及其方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HSIOU-HSIN TSAI, ET AL.: "Propionibacterium acnes-induced iNOS and COX-2 protein expression via ROS-dependent NF-kB and AP-1 activation in macrophages", 《JOURNAL OF DERMATOLOGICAL SCIENCE》 *
NATALIE FISCHER, ET AL.: "Deciphering the Intracellular Fate of Propionibacterium acnes in Macrophages", 《BIOMED RESEARCH INTERNATIONAL》 *
孙保存 主编: "《病理学》", 31 December 2013, 北京大学医学出版社 *
居颂光 等: "《医学免疫学实验技术》", 28 February 2011, 苏州大学出版社 *
施建新 等: "5-氨基酮戊酸光动力疗法对痤疮丙酸杆菌体外抑制的实验研究", 《中国中西医结合皮肤性病学杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115322951A (zh) * 2022-07-27 2022-11-11 广东博溪生物科技有限公司 一种类痤疮表型的体外重组表皮模型及构建方法
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