CN106796216A - 用于分离细胞的装置和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于分离生物材料、特别是不同密度的细胞群体的装置、方法和套件。本发明在将血液分离成其不同构成部分或细胞群体中发现特别效用。公开了一种用于离心管的插入件,其通过在密度梯度介质与血液样本之间产生明显且清楚的界面帮助血液部分的有效分离。描述了涉及在分离细胞中使用插入件的方法和套件。
Description
本发明的技术领域
本发明涉及用于分离生物材料(特别是不同密度的细胞群体)的装置、方法和套件。本发明在将血液分离成其不同构成部分或细胞群体中发现特别效用。
本发明的背景
在医学和生物学中,密度梯度通常将血液分离成不同部分,诸如红细胞、白细胞和血浆。血液覆盖到具有限定密度的介质(例如,FicollTM、Ficoll-PaqueTM、GE Healthcare)上且然后离心。在离心过程期间,发生血液成分的差异转移,从而造成每个血液部分的层的形成。红细胞转移穿过Ficoll层且沉积在管的底部处,而白细胞移动至在Ficoll上方且在血浆层下方的界面。白细胞名义上包括不足周围血液的1%,且此技术允许它们有效且容易的纯化。
对于血液部分的有效分离,密度梯度介质和血液样本之间的界面必须尽可能地分明,带有最低限度的混合。这可为难以实现的,且需要熟练、稳定的手和耐心。因此,在离心之前将血液装载到密度梯度介质上是非常耗时的。该界面也是脆弱的,且如果管被敲打,则该界面可容易地混合且被破坏。
在离心之后的分离的带(band)或部分的移除或采集也对操作者提出技术挑战,操作者必须小心不干扰或破坏部分且避免密度梯度介质的过量带出。
已开发了方法和装置来解决这些问题。
WO2012/149641(Stem Cell Technologies Inc.)描述了一种用于离心管的插入件,其有助于样本中存在的不同细胞群体的密度梯度分离。插入件大小确定成适应于离心管,且具有通过支撑件(通常是圆柱形支撑件)而定位或稳定在管内的部件,从而将管分成顶部和底部部分。该部件通常为凹入构造且具有至少两个开口,其中一个当插入件就位时较接近管的底部端部且作用为允许液体穿过其行进至底部部分,第二个作用为允许空气逸出以平衡压力。包括这种插入件的离心管是市售的,即,来自Stem Cell TechnologiesInc.的SepMateTM。
可从Sigma-Aldrich获得的AccuspinTM管设计成与密度梯度介质(诸如Histopaque®)一起使用,以用于离析淋巴细胞和其它单核的细胞。Accuspin管(也称为LeucosepTM管,可从Greiner Bio-One获得)是特别设计的聚丙烯离心管,其中两个腔由多孔高密度聚乙烯屏障或熔块(frit)分开。密度梯度介质(诸如Histopaque-1077)加入熔块下方的下腔。血液样本加入顶腔且将管离心。在离心时,红细胞沉积至包含密度梯度介质的管的底部,而单核的细胞(诸如淋巴细胞和单核细胞)在血浆/Histopaque-1077界面处形成稠密带。然后可通过倾析或利用吸管来移除此带。由于腔之间的屏障,避免了红细胞的污染。
FloatiesTM(www.Biofloaties.com)是小的耐高压加热的聚合物混合珠,其设计成用于通过密度梯度离心从人类全血和脐血样本将周围血液单核细胞(PBMC)在试管内离析。珠直接倾倒到离心管中的密度梯度介质的顶部上,且缓和地加入血液样本。大部分的珠上升到样本的顶部,其可然后在管中离心。在离心之后,PBMC在血浆-密度梯度介质界面附近形成层或带,且通过插入吸管穿过珠层而收集。
虽然多种商业产品可用于克服上述问题,但仍然需要简单和灵活的手段以用于以成本效率合算的方式实现血液部分的有效分离。本发明通过提供新颖的插入件、方法、离心管和套件来解决此需要。
本发明的概要
根据本发明的第一方面,提供了一种用于离心管的插入件(100),其包括:盘(20),其大小确定成适应于离心管以用于将所述管分成上部分和下部分;所述盘(20)包括凸起的上表面(21)和在其中具有一个或更多个凹口(24)的外边缘(22);和支柱(30),其从盘(20)的下表面(26)延伸以用于当插入件(100)定位在管内时接触所述管的底部。
在一个实施例中,该一个或更多个凹口(24)允许管的上部分和下部分之间的流体连通。
在另一个实施例中,该一个或更多个凹口(24)大小确定成跨过该一个或更多个凹口(24)产生表面张力,以在没有离心力的情况下约束液体穿过其的流动。
在进一步的实施例中,上表面(21)另外包括连接至所述一个或更多个凹口(24)的一个或更多个凹槽(28)。
在一个实施例中,盘(20)的上表面(21)另外包括握持元件(40)。
在另一个实施例中,握持元件(40)在盘(20)的上表面(21)的中心。优选地,握持元件(40)为杆的形式。
在进一步的实施例中,该一个或更多个凹槽(26)将盘(20)的中心与该一个或更多个凹口(24)连接。
在一个实施例中,凹槽(26)是扇形的,在盘(20)的中心处比在凹口(24)处窄。
在另一个实施例中,盘(20)的下表面(28)在形式上是凸起的。
在进一步的实施例中,该一个或更多个凹口(24)在形式上是半圆形或卵形的。
在进一步的实施例中,插入件由聚合物组成。优选地,聚合物是惰性聚合物。优选地,聚合物是可消毒的,例如通过高压加热、化学处理或通过利用合适的能量(诸如γ射线)照射。通常,聚合物是塑料聚合物,诸如聚乙烯或聚丙烯。然而,可使用其它惰性塑料聚合物,诸如聚碳酸酯、聚乙烯和丙烯酸酯聚合物。
在另一个实施例中,插入件已经处理成使微生物污染最小化。合适的方法的示例包括高压加热、利用消毒剂或抗微生物剂的化学处理,和/或利用合适的能量(诸如γ射线)照射。
根据本发明的第二方面,提供了一种包括如前面描述的插入件的离心管。离心管可另外包含密度梯度介质。
根据本发明的第三方面,提供了一种用于分离细胞的方法,其包括以下步骤:
i) 将一定体积的密度梯度介质加入离心管;
ii) 将如前面描述的插入件定位在所述密度梯度介质的表面上,使得支柱与所述管的底部接触;
iii) 在盘的上表面上分配包含一个或更多个细胞的液体样本,以在密度梯度介质与样本之间形成界面;和
iv) 将管离心以从样本分离所述一个或更多个细胞。
在一个实施例中,细胞选自由哺乳动物细胞、红细胞、白细胞和干细胞组成的组。
在另一实施例中,样本包括全血。
在进一步的实施例中,该方法另外包括恢复该一个或更多个细胞的步骤。
根据本发明的第四方面,提供了一种包括如前面描述的插入件和离心管的套件。优选地,套件另外包括一定体积的密度梯度介质。
根据本发明的第五方面,提供了一种如前面描述的插入件和一定体积的密度梯度介质。
根据本发明的第六方面,提供了使用如前面描述的插入件用于从样本分离一个或更多个细胞。
定义
如本文所使用,用语“用于离心管的插入件”意在指可逆地或不可逆地放置或固定在离心管内的任何装置或设备。
离心管是可被离心的管。管可具有在本领域中常见的圆锥形底端部或可为平坦的或圆形底的。市售的离心管的示例包括但不限于NuncTM圆锥形无菌聚丙烯离心管(ThermoScientificTM)、NalgeneTM Oak Ridge聚碳酸酯、聚丙烯或TeflonTM管(ThermoScientificTM)以及Sterilin聚丙烯管(Camlab, UK)。
将理解的是,根据本发明的插入件可与具有不同容积(诸如例如2ml、5ml、10ml、15ml和50ml)的离心管一起使用。
在一个方面,本发明中使用的“细胞”是哺乳动物细胞,优选为人类细胞。可用在本发明中的哺乳动物细胞的示例包括但不限于血细胞,诸如红细胞(红血球)、白细胞(包括白血球、淋巴细胞、粒细胞和单核细胞)、血小板(凝血细胞)和干细胞(例如造血干细胞)。
“细胞”可为骨髓细胞。
本文中使用的用语“干细胞”涉及多能(pluripotent)干细胞或多能性(multipotent)干细胞。干细胞的示例包括但不限于胚胎干细胞(ESC)、成体干细胞、造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞和诱导多能干细胞(iPS)。
附图的简要描述
图1示出了根据本发明的插入件的实施例的三维透视图。
图2a至图2c绘出了图1的插入件的一系列视图:平面透视(图2a)、前透视(图2b)和下侧平面透视(图2c)。
图3a是示出了根据本发明的插入件的平面透视的示意图,带有凹槽的详细插图(图3b)。
图4a、图4b和图4c是根据本发明的插图的一部分的示意图。具体而言,图4a详细描绘了插入件的盘的上表面上的液体流,图4b详细描绘了隆起的高度,且图4c详细描绘了凹槽的深度。
图5a、图5b和图5c是定位在空离心管(图5a)以及离心之前(图5b)和离心之后(图5c)的填充的离心管内的根据本发明的插入件的示意图。
图6是在通过离心分离之前的已经装载了Ficoll-Paque密度梯度介质(下层,560a、560b和560c)和血液/PBS混合物(上层,562a、562b和562c)的三个离心管(550a、550b和550c)的照片。
图7是在离心和分离过程之后的图6中所示的三个离心管的照片。
图8是来自图7的管(A对应于650a,B对应于650b且C对应于650c)中的每一个的白细胞部分的流式细胞计分析的结果的图示,字母G指示白细胞部分中存在的粒细胞子群体,M指示单核细胞子群体,且L指示淋巴细胞子群体。FSC和SSC分别表示前向散射和侧向散射。
附图的详细描述
在图1中以三维透视的方式示出了根据本发明的插入件的实施例。插入件(100)包括盘(20),盘(20)具有尺寸或大小确定成适应于离心管(未示出)的直径,使得一旦其在管内就位,则其将把管分成上部分和下部分。插入件可大小确定成适应于任何离心管,包括由合适的材料(诸如塑料、金属或玻璃)制造的标准容积(诸如10ml、15ml或50ml)的离心管。插入件作用为使不同密度的液体的混合最小化,该混合在包含待分离到另一液体中的目标(诸如血细胞)的液体加入不同密度的第一液体时发生,因为这导致在离心时目标到第一液体中的较差分离。插入件还有助于在离心过程期间将目标分离到第一液体中。通常,第一液体是密度梯度介质,且包含目标的液体是含水血液样本。
盘(20)具有上表面(21),上表面(21)在形式上是凸起的且具有在其外边缘(22)或周围中的多个凹口(24);凹口可采取任何形式,但大体上是弯曲的,在形状上为半圆形或卵形。从盘(20)的下表面(未示出)延伸的支柱(30)作用为腿部,以当插入件(100)定位在管内时在离心管(未示出)的底部上方支撑盘(20)。支柱(30)的长度取决于待加入离心管的液体的体积而确定大小,使得当插入件加入此体积的液体时,盘的下侧将与液体的弯液面接触。握持元件(40)有助于插入件(100)在离心管内的定位和移除。插入件可从离心管手动地定位和/或移除,例如通过使用操作者的手指或合适的工具(诸如一副镊子),或者通过自动或机器人手段。
凹槽(28)将盘(20)的中心与凹口(24)连接。凹槽(28)的目的是将液体(该液体可倾倒到盘(20)的凸起的上表面(21)上)引导至凹口(24),使得液体在第一液体(诸如密度梯度介质,其存在于管的下部分中)的顶部上成层,带有最低限度的干扰或混合(因为这将损害分离过程)。
图2a、图2b和图2c分别是图1的插入件(200)的顶平面视图、前透视图和底平面视图。图2a提供了插入件(200)的顶平面视图,示出了从在盘(120)的中心的握持元件(140)延伸至盘(120)的外边缘(122)或边沿上的凹口(124)的凹槽或通道(128)的布置。插入件(200)的握持元件(140)和支柱(130)在图2b的前透视图中示出。插入件(200)的下侧平面视图的图2c示出了带有中心支柱(130)的盘(120)的凹入下表面(126)。
在图3a中示出了根据本发明的插入件(300)的实施例的盘(220)的示意顶平面视图。在示例中,盘(220)具有从其上表面(221)的其中心(229)沿径向延伸至外边缘(222)中的凹口(224)的扇形的凹槽,凹槽(228)在盘的中心处比在外边缘处窄。盘(220)的直径(D)将取决于插入件预期用于的离心管的大小或容积而变化;例如,用于50ml离心管的典型插入件将具有大约26mm直径的盘。对于这种插入件,弯曲的凹口将在宽度(W)上为大约4mm,且具有大约1mm的深度(D)(图3b)。
图4a、图4b和图4c示出了本发明的实施例的盘的一部分的示意图。图4a绘出了在盘的上表面(321)上的液体流(如由箭头的流动方向所示)。倾倒到盘的凸起的上表面的顶部上的液体流到扇形的凹槽(328)中,沿其长度向下流到凹口(324)中且然后离开盘的表面。凹槽(328)的深度从盘的中心(在那里其与握持元件(330)会合)增大至其外边缘(322)处的最大值。图4b是示出了在盘的外边缘(322)上的未被淹没的边沿的隆起高度(H)的示意细节,该高度(H)对于用于50ml离心管的插入件而言将为大约1mm。图4c示出了凹槽(328)的深度(D),该深度(D)对于示出的插入件而言将为大约1mm。深度D和高度H将取决于插入件的设计所针对的管的容积而变化。
图5a、图5b和图5c是定位在空离心管(图5a)以及离心之前(图5b)和离心之后(图5c)的填充的离心管内的根据本发明的插入件的示意图。
图5a示出了定位在常规离心管(450)内的根据本发明的插入件(500),该管具有封闭由其内壁(453)限定的中空内部(452)或腔的盖(451)。图5a的离心管(450)不包含任何液体。管的外壁(453)和内壁(454)都由惰性材料(诸如塑料、玻璃或金属)制成。离心管(450)可设计成适应一定范围的液体体积,诸如5ml、10ml、15ml和50ml,壁被标记(455)以指示腔(452)内存在的体积。
插入件(500)包括盘(420),带有握持元件(440)以允许定位在管(450)内且带有支柱(430)以在管的底部上方支撑盘。盘大小确定成使得外边缘(422)与管(450)的内壁(453)接触以存在液体不可渗透的屏障,使得液体不可从管的上部分行进至管的下部分,除非穿过凹口(424)。盘的外边缘中存在的凹口(424)设计成在没有离心力的情况下约束液体跨过盘流动。
图5b示出了在离心和将细胞从液体样本(462)分离到密度梯度介质中之前填充有两种液体(460和462)(密度梯度介质(460)和包含细胞的液体样本(462))的图5a的管(450)。为了制备图5b中所示的管,将预先限定的体积的密度梯度介质(460)倾倒到管的下部分(A)中且随后将插入件(500)插入,使得当其由支柱支撑在管的底部上方时,液体(460)的弯液面与插入件的盘(420)的下表面(426)流体连接。因此,支柱(430)的长度作用为间隔件以限定可在离心管的下部分(A)中存在的液体(460)或密度梯度介质的特定体积。将理解的是,支柱(430)的长度将取决于在离心和分离过程中使用的期望体积的液体或密度梯度介质(460)以及离心管的内部容积而变化。对于典型的50ml离心管,支柱(430)的长度大小确定成使得盘(420)位于管(450)的15ml标记处。
包含细胞(诸如血细胞)的液体样本(462)小心地倾倒到盘(420)的上表面上,以在其上方在管的上部分(B)中形成层。然后替换盖(451)且将管转移至离心机。
图5c是离心之后的图5b的管的示意图。管(450)中存在的液体已经基于密度分离成四个部分D、E、F和G。D部分主要包含血浆,E部分是Ficoll,F部分主要包括红细胞,且G部分包含白细胞。现在可通过小心地从管吸移各个部分来收集细胞的目标群体:例如,如果需要白细胞,则首先移除D部分且然后收集G部分。备选地,如果目标是红细胞,则丢弃D和G部分,小心地移除插入件(500)以避免干扰和剩余部分,且收集F部分。
实验
现在将参照以下特定示例来描述本发明。
对其辅助将血液装载到Ficoll-Paque密度梯度介质上而不在血液-Ficoll界面处混合的能力以及对其允许血液部分分离而不在离心力下混合的能力测试了根据本发明的插入件。
利用包含2%人类血清的磷酸盐缓冲盐水(PBS)将25ml的血液稀释两倍。将15ml的Ficoll-Paque加入3个50ml离心管。两个管是常规离心管(图6的550a和550c),而一个管(图6的550b)是AccuspinTM管(Sigma-Aldrich)。AccuspinTM管是特别设计的聚丙烯离心管,其中两个腔由多孔高密度聚乙烯屏障或熔块分开,以在离心期间辅助淋巴细胞和其它单核的细胞从全血和骨髓分离。
将25ml的血液/PBS混合物(562a、562b)小心地吸移到管550a和550b的Ficoll-Paque层的表面上。将根据本发明的插入件(600)加入第三管(550c)。通过吸移将25ml的血液/PBS混合物(562c)加入管550c中的插入件的顶部中心,以允许血液混合物沿凹槽向下流动且在Ficoll-Paque层上形成层。
图6是在通过离心分离之前的已经装载了Ficoll-Paque密度梯度介质(下层,560a、560b和560c)和血液/PBS混合物(上层,562a、562b和562c)的三个管(550a、550b和550c)的照片。可见的是,其中两个管550a和550c是常规离心管(管550c包含根据本发明的插入件600),而管550b是AccuspinTM管(Sigma-Aldrich)。
所有三个管在制动器关闭的情况下在400g下离心30分钟。
图7示出了在离心和分离过程之后的图6的相同的三个管。红细胞已经在管(650a、650b和650c)的Ficoll-Paque层(665a、665b和665c)的底部(664a、664b和664c)处成团,而白细胞(666a、666b和666c)已经在Ficoll-Paque(665a、665b和665c)和血浆(667a、667b和667c)层的界面处分离。
然后利用吸管采集来自每个管的白细胞部分,且使用核计数器(NC100,Sartorius)对其计数。通过流式细胞计(FACS Calibur, BD Bioscience)分析106细胞以确定它们的群体组成。
图8是来自图7的管(A对应于650a,B对应于650b且C对应于650c)中的每一个的白细胞部分的流式细胞计分析的结果的图示,字母G指示白细胞部分中存在的粒细胞子群体,M指示单核细胞子群体,且L指示淋巴细胞子群体。图还示出了白细胞群体中存在的每个子群体(粒细胞、单核细胞和淋巴细胞)的百分比。以下的表1给出了用于管中的每一个的白细胞恢复和细胞活力。
N=1
可见的是,在总细胞数、细胞活力或细胞群体方面,与使用根据本发明的插入件相比,使用常规Ficoll-Paque分层或使用AccuspinTM管采集的白细胞中没有可辨别的差异。
虽然描述了本发明的优选的示范性实施例,但本领域技术人员将了解的是,本发明可通过不同于所描述的实施例实践,描述的实施例是为了说明目的而提出且不作为限制。本发明仅由以下权利要求限制。
Claims (23)
1.一种用于离心管的插入件(100),包括:
盘(20),其大小确定成适应于离心管以用于将所述管分成上部分和下部分;
所述盘(20)包括凸起的上表面(21)和在其中具有一个或更多个凹口(24)的外边缘(22);和
支柱(30),其从所述盘(20)的下表面(26)延伸以用于当所述插入件(100)定位在所述管内时接触所述管的底部。
2.根据权利要求1所述的插入件,其特征在于,所述一个或更多个凹口(24)允许所述管的所述上部分和所述下部分之间的流体连通。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的插入件,其特征在于,所述一个或更多个凹口(24)大小确定成跨过所述一个或更多个凹口(24)产生表面张力以在没有离心力的情况下约束液体穿过其的流动。
4.根据权利要求1至权利要求3中任一项所述的插入件,其特征在于,所述上表面(21)另外包括连接至所述一个或更多个凹口(24)的一个或更多个凹槽(28)。
5.根据权利要求1至权利要求4中任一项所述的插入件,其特征在于,所述盘(20)的上表面(21)另外包括握持元件(40)。
6.根据权利要求5所述的插入件,其特征在于,所述握持元件(40)在所述盘(20)的上表面(21)的中心。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的插入件,其特征在于,所述握持元件(40)为杆的形式。
8.根据权利要求4至权利要求7中任一项所述的插入件,其特征在于,所述一个或更多个凹槽(26)将所述盘(20)的中心与所述一个或更多个凹口(24)连接。
9.根据权利要求4至权利要求8中任一项所述的插入件,其特征在于,所述凹槽(26)是扇形的,在所述盘(20)的中心处比在所述凹口(24)处窄。
10.根据权利要求1至权利要求9中任一项所述的插入件,其特征在于,所述盘(20)的下表面(28)在形式上是凸起的。
11.根据权利要求1至权利要求10中任一项所述的插入件,其特征在于,所述一个或更多个凹口(24)在形式上是半圆形或卵形的。
12.根据权利要求1至权利要求11中任一项所述的插入件,其特征在于,所述插入件由聚合物组成。
13.根据权利要求1至权利要求12中任一项所述的插入件,其特征在于,所述插入件已经处理成使微生物污染最小化。
14.一种包括权利要求1至权利要求13中任一项所述的插入件的离心管。
15.根据权利要求14所述的离心管,其特征在于,所述离心管另外包括密度梯度介质。
16.一种用于分离细胞的方法,包括以下步骤:
i) 将一定体积的密度梯度介质加入离心管;
ii) 将根据权利要求1至权利要求13中任一项所述的插入件定位在所述密度梯度介质的表面上,使得所述支柱与所述管的底部接触;
iii) 在所述盘的上表面上分配包含一个或更多个细胞的液体样本,以在所述密度梯度介质与所述样本之间形成界面;和
iv) 将所述管离心以从所述样本分离所述一个或更多个细胞。
17.根据权利要求16所述的方法,其特征在于,所述细胞选自由哺乳动物细胞、红细胞、白细胞和干细胞组成的组。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法,其特征在于,所述样本包括全血。
19.根据权利要求16至权利要求18中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法另外包括恢复所述一个或更多个细胞的步骤。
20.一种包括根据权利要求1至权利要求13中任一项所述的插入件和离心管的套件。
21.根据权利要求20所述的套件,其特征在于,所述套件另外包括一定体积的密度梯度介质。
22.一种包括根据权利要求1至权利要求13中任一项所述的插入件和一定体积的密度梯度介质的套件。
23.使用根据权利要求20至22中的任一项所述的套件用于从样本分离一个或更多个细胞。
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