CN106795502B - 用于免疫受损宿主的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供衍生自普遍存在的蛋白质的肽和编码所述肽的核酸。本发明延伸至这些肽和核酸例如作为用于疫苗的抗原本身和在产生预防、改善或治疗由脓毒症诱发细菌引起的感染的治疗药中使用的抗体的各种用途。本发明特别有益于例如新生儿、婴儿、儿童、育龄女性、妊娠女性、胎儿、年老者和糖尿病人等免疫受损宿主。

Description

用于免疫受损宿主的疫苗
发明领域
本发明涉及由脓毒症诱发细菌引起的疾病、病症和病况，具体但非唯一地讲，涉及脓毒症和脓毒症相关病理的治疗和预防。本发明延伸至新的肽及其编码核酸和利用这些肽产生通过免疫或通过被动抗体转移用于预防脓毒症诱发细菌所致感染的疫苗。本发明特别有益于免疫受损宿主，例如新生儿、婴儿、儿童、育龄女性、妊娠女性、胎儿、年老者和糖尿病人。
发明背景
脓毒症是新生儿发病率和死亡率的主要病因。按照世界卫生组织(WHO)，每年大约100万例死亡由新生儿脓毒症引起[1-3]。另外，30-50%生存的新生儿受累于长期后遗症，例如认知减退、癫痫发作或耳聋[4]。
新生儿感染可发生在出生前(子宫内)、分娩期间或出生后。子宫内感染由来自母亲生殖道的共栖细菌上行至羊水而引起[1]。发生在分娩期间感染由吸入定居在母亲生殖道粘膜上的微生物引起。在两种情况下，高达87%的感染由B群链球菌(GBS；亦称为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae/S. agalactiae))、大肠杆菌(Escherichia coli/E.coli)和克雷伯氏菌属菌种(Klebsiella spp.)引起[5-7]。虽然细菌的垂直传递也可以是发生在出生后感染的原因，但是这些感染的大多数由葡萄球菌属菌种(Staphylococcus spp.)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae/S. pneumoniae)或假单胞菌属菌种(Pseudomonas spp.)引起[2，3，7-12]。
子宫内感染也是早产的重要原因。实际上，50-80%在妊娠<32周的早产由上行性细菌感染引起[9，13-17]。
用于新生儿脓毒症的可获得的现行治疗只基于给予抗生素。然而，虽然由于实施分娩期抗生素预防GBS感染显著下降，但是对所用抗生素的宿主抗性提高以及其在妊娠者中有疑问的使用，突出显示了对替代预防策略的需要。然而，用于新生儿脓毒症的免疫疗法迄今为止仍全然令人迷惑。
新生儿免疫系统的独特性基于不同的环境。重要的是，出生代表了从由母亲子宫提供的几乎无菌的环境进入“不友好的”富抗原和病原体的外部世界的剧变性通行，婴儿的免疫系统需要学习耐受这样的外部世界。在此意义上，婴儿生命头几个月的特征在于积极的免疫耐受状态以控制对新抗原的过度应答，这进而可增加感染的风险。另一方面，由于子宫内有限暴露于抗原和充分描述的新生儿适应性免疫的缺陷，因此新生儿必须依靠其先天免疫系统以防止感染。实际上，中性粒细胞减少(一种特征在于异常低的嗜中性粒细胞数目的粒细胞病症)与重度脓毒症强相关[13，18-23]。
虽然中性粒细胞减少通常用新生儿免疫系统不成熟来解释，但本发明人之前描述了对GBS感染的新生儿易感性与在细菌攻击后快速产生大量的白介素-10 (IL-10) (一种免疫抑制分子)的新生儿易患病体质有关[24]。他们的结果表明由IL-10产生而不是新生儿免疫系统不成熟引起的这种早期的免疫抑制，是在GBS感染中观察到的中性粒细胞减少的主要原因[24]。然而，他们鉴定出胞外甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为造成这种早期IL-10产生的细菌因素[24，25]。他们在母体疫苗中使用重组GAPDH (rGAPDH)，并表明了这在保护后代免于致死GBS感染中非常有效[24]。他们已经证明这种保护还可通过GBS GAPDH的抗体中和或通过阻断IL-10与其受体结合而获得[24]。
脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides/N. meningitidis)，常称为脑膜炎球菌，是危及生命的脓毒症、脑膜炎及婴儿和幼儿中的其它形式的脑膜炎球菌疾病的主要原因，但在新生儿期极少发现。它还是儿童和年轻成年人中细菌脑膜炎的主要原因。血清型分布在全世界显著变化。例如，在美国，血清群B是疾病和死亡的主要原因，接着是血清群C；然而，血清群A在非洲和亚洲最流行。多种亚型妨碍了用于脑膜炎球菌疾病的通用疫苗的研发；然而，可获得针对个体或在一个病例中2个血清群的少数疫苗。
与新生儿、婴儿、幼儿和儿童一样，免疫受损成人例如年老者也非常易感染细菌感染和脓毒症[26]。肺炎、菌血症和脓毒症在年老者中十分常见，并构成死亡率和发病率的主要原因。这些感染一般是混合型的，通常由厌氧菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus/S. aureus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)所致，但是革兰氏阴性肠细菌(肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae/K. pneumoniae)和其它肠杆菌科（Enterobacteriaceae）)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeroginosa/P. aeruginosa)(在卧床患者中)和GBS也可能是原因[26]。
因此，重症监护室中观察到的与重度脓毒症和感染性休克有关的死亡率大约30%[27]。重要的是最近20年，免疫受损患者的发生率不断提高[28]，且免疫缺陷是越来越常被鉴定为与归因于重度脓毒症和感染性休克的增加的死亡率有关的预后因子[29]。
此外，糖尿病患者对由葡萄球菌属菌种和GBS引起的侵入性感染的易感性提高[30，31]。在东亚，糖尿病是众所周知的由肺炎克雷伯氏菌引起的肝脓肿的风险因素[32]。
因此文献中查到的数据表明，存在与在这些患者群中的脓毒症一致相关的少数微生物病原体。
发明概述
本发明人将其努力集中于GAPDH，现已证实这种酶是所有相关脓毒症诱发细菌的胞外毒力因子。本发明人认为他们现今首次（first ever）鉴定出能够诱导对细菌而非人的GAPDH有特异性的抗体的新的一系列GAPDH衍生肽。如本文的充分描述和例示，这些新的肽对疫苗的生产非常有用，所述疫苗用于预防在特别是诸如新生儿、婴儿、儿童、育龄女性、妊娠女性、胎儿、年老者和糖尿病人等免疫受损宿主中由脓毒症诱发细菌引起的感染性疾病。另外，诱导的抗体可用作治疗特别是这些患者群的既有感染的治疗剂。
因此，按照本发明的第一方面，提供与存在于一种或多种脓毒症诱发细菌的GAPDH内的肽有至少90%氨基酸序列同一性且与存在于人GAPDH内的肽有小于10%氨基酸序列同一性的分离的肽或其功能片段或功能变体。
本发明人从他们之前的研究了解到，对由GBS引起的脓毒症的易感性与宿主在与细菌GAPDH接触时产生高水平的IL-10的趋势强相关[24]。然而，对于本发明人，没有理由认为或觉得对于其它脓毒症诱发细菌，所述相关性也适用。实际上，虽然已知其它脓毒症诱发细菌具有GAPDH (因为这种酶普遍存在)，但并不知道或预期来自其它脓毒症诱发细菌的GAPDH引起宿主细胞产生IL-10。因此，本发明人发现GAPDH是所有相关脓毒症诱发细菌的胞外毒力因子是完全出乎意料的。
此外，目前没有有效保护新生儿和胎儿免于分别由脓毒症诱发细菌类的每一种引起的感染的疫苗。另外，用于对抗免疫受损成人(例如年老者和糖尿病人)的脓毒症的预防或治疗策略远非有效。如本文解释的，抗生素只解决一部分问题，因为在迟发性脓毒症的情况下，抗生素常常给药太迟，并且在预防脓毒症相关发病中无效。然而，抗生素不能够预防子宫内感染。因此第一方面的肽、片段和变体在产生特别用于这些患者群的各种有用和必须需要的疫苗中具有重要用途。
疫苗是用于感染性疾病的最有成本效益的治疗法，当同一疫苗可预防不同患者群中的由不同的人病原体引起的感染时甚至更是如此。本发明涉及预防、治疗和改善由脓毒症诱发细菌，特别是GBS、大肠杆菌、葡萄球菌属菌种、肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌、脑膜炎奈瑟氏球菌和/或假单胞菌属菌种(Pseudomonas spp)引起的感染性疾病。
发明详述
本文描述的发明基于本发明人的出乎意料的发现，即对于所有的脓毒症诱发细菌，对细菌脓毒症的易感性与宿主与细菌GAPDH接触时产生高水平的IL-10的趋势强相关。
在不同的风险组中，对脓毒症的易感性是极常见的。然而，在不同的易感染宿主群中，与脓毒症有关的微生物病原体是高度保守的。人类中与脓毒症最相关的细菌是GBS、大肠杆菌、葡萄球菌属菌种、肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌、假单胞菌属菌种和脑膜炎奈瑟氏球菌，本发明人出乎意外地发现所有这些细菌均分泌GAPDH。
因此，脓毒症诱发细菌可优选选自以下细菌：GBS、大肠杆菌、葡萄球菌属菌种、肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌和假单胞菌属菌种和脑膜炎奈瑟氏球菌。在一个实施方案中，葡萄球菌属菌种是金黄色葡萄球菌。在另一个实施方案中，假单胞菌属菌种是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa/P. aeruginosa)。在另一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌是脑膜炎奈瑟氏球菌血清型B (MenB)。在一个实施方案中，脓毒症诱发细菌不是GBS。
来自GBS、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌和MenB (菌株MC58)的GAPDH的氨基酸序列在本文中分别以SEQ ID NO: 1-7识别。
来自GBS的GAPDH的氨基酸序列(UniProt登记号Q8E3E8)在本文以如下的SEQ IDNO: 1识别：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
来自大肠杆菌的GAPDH的氨基酸序列(UniProt登记号D5D2F1)在本文中以如下的SEQ ID NO: 2识别：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
来自金黄色葡萄球菌的GAPDH的氨基酸序列(UniProt登记号A6QF81)在本文以如下的SEQ ID NO: 3识别：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
虽然此处只提供来自金黄色葡萄球菌的GAPDH的序列，但来自葡萄球菌属菌种的所有可获得的GAPDH序列具有超过98%序列相似性。
来自肺炎链球菌的GAPDH的氨基酸序列(UniProt登记号Q97NL1)在本文以如下SEQID NO: 4识别：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
来自肺炎克雷伯氏菌的GAPDH的氨基酸序列(UniProt登记号B5XRG0)在本文以如下的SEQ ID NO: 5识别：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
来自铜绿假单胞菌的GAPDH的氨基酸序列(UniProt登记号P27726)在本文以如下的SEQ ID NO: 6识别：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
虽然此处只提供来自铜绿假单胞菌的GAPDH的序列，但来自假单胞菌属菌种的所有可获得的GAPDH序列具有超过98%序列相似性。
来自MenB (菌株MC58)的GAPDH的氨基酸序列(UniProt登记号Q9JX95)在本文以如下的SEQ ID NO: 7识别：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
虽然此处只提供来自MenB (菌株MC58)的GAPDH的序列，但来自脑膜炎奈瑟氏球菌的不同血清型的所有可获得的GAPDH序列具有97.668%序列相似性(http://www.uniprot.org/align/A20150610146R8 0D4XR)。
描述了GBS的GAPDH蛋白的生化特征、酶促活性和表面定位[33]。还描述了来自大肠杆菌[34-36]、金黄色葡萄球菌[37-39]和肺炎链球菌[40]的GAPDH的胞外定位。本发明人认为他们是表明胞外存在铜绿假单胞菌和脑膜炎奈瑟氏球菌GAPDH的最早的作者。
GAPDH是与能量代谢有关的系统发生上保守的蛋白质，其存在于每个细胞类型中。微生物GAPDH与人GAPDH有约30-40%序列同一性。人GAPDH的氨基酸序列(UniProt登记号P04406)在本文以如下SEQ ID NO: 8识别：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
出人意外地，细菌GAPDH共有高达60%的其氨基酸序列，甚至更出人意外地，本发明人现已证实来自本文所述的优选脓毒症诱发细菌(即GBS、大肠杆菌、葡萄球菌属菌种、肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌、假单胞菌属菌种和脑膜炎奈瑟氏球菌)的GAPDH具有特别高程度的序列同一性(参见实施例7)。下表1提供在提交在本文以SEQ ID NO: 1-7识别的氨基酸序列(按照之前标示的UniProt登记号的FASTA格式)后获自ClustalW2服务器的多个比对和序列相似性百分比。图1中也显示了序列比对。
表1：细菌GAPDH的序列比较(GBS与其它细菌)
GAPDH序列比较 序列相似性(%)
GBS – 大肠杆菌 60.61
GBS – 葡萄球菌属菌种 69.05
GBS – 肺炎链球菌 91.94
GBS – 肺炎克雷伯氏菌 58.13
GBS – 假单胞菌属菌种 44.31
GBS – 脑膜炎奈瑟氏球菌(MenB) 70.66
因此，在一个优选的实施方案中，第一方面的肽与存在于一种或多种脓毒症诱发细菌的GAPDH内的肽具有至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性。
因此，优选肽与存在于以SEQ ID NO: 1-7识别的GAPDH序列的一个或多个的肽具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或甚至100%氨基酸序列同一性。
例如，在一个优选的实施方案中，第一方面的肽可与存在于SEQ ID NO: 1的肽(即来自GBS的GAPDH)具有至少90%氨基酸序列同一性。在另一个优选的实施方案中，第一方面的肽可与存在于SEQ ID NO: 2的肽(即来自大肠杆菌的GAPDH)具有至少95%氨基酸序列同一性。在又一个优选的实施方案中，肽可与存在于SEQ ID NO: 4的肽(即来自肺炎链球菌的GAPDH)具有至少98%氨基酸序列同一性。在另一个优选的实施方案中，肽可与存在于SEQ IDNO: 1的肽(即来自GBS的GAPDH)具有至少95%氨基酸序列同一性、与存在于SEQ ID NO: 4的肽(即来自肺炎链球菌的GAPDH)有至少98%氨基酸序列同一性和与存在于SEQ ID NO: 6的肽(即来自假单胞菌属菌种的GAPDH)有至少99%氨基酸序列同一性等等。应了解，本文所述可能的序列同一性和可能的脓毒症诱发细菌的任何组合是预期的，且其构成本发明的一部分。
出人意外地发现，GAPDH在脓毒症诱发细菌中是高度保守的，本发明人鉴定出与细菌GAPDH共有的，但不存在于人GAPDH中的多个肽序列(表述“与……共有的”可包括由所比对的细菌序列证实（borne out of）的共有氨基酸序列)。这些共有肽序列的4个优选实例在本文以SEQ ID NO: 9-12识别。具有SEQ ID NO: 9-12的氨基酸序列的肽在本文分别称为“肽1-4”，下文和表2中显示了这些肽。
衍生自GAPDH的肽1的氨基酸序列(即共同序列1)在本文以如下的SEQ ID NO: 9识别：
Figure DEST_PATH_IMAGE009
衍生自GAPDH的肽2的氨基酸序列(即共同序列2)在本文以如下的SEQ ID NO: 10识别：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
衍生自GAPDH的肽3的氨基酸序列(即共同序列3)在本文以如下的SEQ ID NO: 11识别：
Figure DEST_PATH_IMAGE011
衍生自GAPDH的肽4的氨基酸序列(即共同序列4)在本文以如下的SEQ ID NO: 12识别：
Figure DEST_PATH_IMAGE012
表2：用作疫苗的衍生自细菌GAPDH的肽
肽 氨基酸序列 SEQ ID NO.
1 RIQEVEGLEVTR 9
2 DVTVEENAAM 10
3 EVKDGHLIVNGKV 11
4 EHDAESLRVMGDR 12
作为示例，图2和3显示肽1和肽2从存在于来自GBS、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的GADPH的天然序列的衍生和相同序列不存在于人的GAPDH中的事实。肽3和肽4衍生自存在于来自大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和/或铜绿假单胞菌的GADPH中的天然序列，也如图2和/或3中所识别的一样。
因此，本发明的各个肽的氨基酸序列可与存在于脓毒症诱发细菌中的肽相同，或它可改变。然而，如果它改变，则优选肽具有有效地为脓毒症诱发细菌GAPDH的共有序列，而非人GADPH的共有序列的氨基酸序列。
因此，在一个优选的实施方案中，第一方面的肽具有基本如SEQ ID NO: 9-12的任一个所列出的氨基酸序列。
预期除了以SEQ ID NO: 9-12识别的共有序列以外，来自不同脓毒症诱发细菌的GAPDH带有另外的共有序列，其可用来产生本发明的肽用作疫苗。肽可具有任何序列，但所述序列必须实质上不被人的GAPDH所共有。
或者，来自脓毒症诱发细菌的GAPDH的天然氨基酸序列可用来产生本发明的肽。表3显示获自指定细菌的GAPDH的推定的肽序列，其可用于本发明的疫苗中以靶向至少指定的细菌。在分别将各细菌GAPDH氨基酸序列与人GAPDH比对后(ClustalW2服务器，接着目检和选择)，肽被鉴定为不与人GAPDH同种型共有共同序列相似性的细菌GAPDH肽。这些肽表明可存在于细菌的表面肽中并且用来产生本发明疫苗的更多得多的（many more）GAPDH肽。可使用天然序列内的任何肽序列，但所述序列必须实质上不被人的GAPDH所共有。
表3：衍生自脓毒症诱发细菌的用于疫苗的推定的GAPDH肽序列
Figure DEST_PATH_IMAGE013
Figure DEST_PATH_IMAGE014
因此，在另一个优选的实施方案中，第一方面的肽具有基本上如SEQ ID NO: 13-69的任一个所列出的氨基酸序列。
适宜地，第一方面的肽包含150个氨基酸或更少。例如，肽优选包含小于100个氨基酸，更优选小于50个氨基酸。甚至更优选肽包含小于30个氨基酸，最优选小于20个氨基酸。适宜地，本发明的肽包含至少3个氨基酸。优选本发明的肽包含至少5个氨基酸、更优选至少8个氨基酸，甚至更优选至少10个氨基酸。本发明的肽可为上述范围内的任何长度，但它们的长度通常会为5-100个氨基酸，优选长度会为5-50个氨基酸，最优选长度会为10-20个氨基酸。
适宜地，本发明的肽应位于各细菌GAPDH的表面，并且呈类似于完整蛋白质内它们具有的结构的3D结构(构象)。
可通过本领域已知的任何方法，包括通过重组方法，获得本发明的肽。例如，先前描述了来自GBS的rGAPDH (完整蛋白质)的产生[41]。所需肽可以类似方式产生。还考虑将GBS以外的细菌的GAPDH (完整蛋白质或肽)的重组产生作为本发明的一部分。或者，肽可采用本领域众所周知的技术(例如固相或液相合成)，通过蛋白质截短或从头合成获得。本发明因此延伸到编码本发明的肽的核酸分子。
因此，按照本发明的第二方面，提供编码第一方面的肽或其功能片段或功能变体的分离的核酸。
本领域经验丰富的研究者将能够容易地鉴定编码第一方面的肽或其功能片段或功能变体的合适的核酸序列。因此，技术人员根据本领域的现有知识和/或已发表文献提供的有关技术细节，将能够容易地实施本发明的这个方面(参见例如[25]，其描述了用于构建和纯化重组GAPH的有用方法)。
在一个实施方案中，分离的核酸是重组的或合成的。在一个实施方案中，分离的核酸是编码第一方面的肽或其功能片段或功能变体的cDNA分子。在一个实施方案中，分离的核酸经化学修饰，例如通过加入已知的修饰核苷酸。在一个实施方案中，分离的核酸与异源启动子可操作性连接。在一个实施方案中，分离的核酸与基质或标记等结合。这类修饰是本领域常见的，并会为技术人员已知的。
在第三方面，提供包含第二方面的核酸的遗传构建体。
本发明的遗传构建体可为表达盒的形式，其可适于编码的肽在宿主细胞中表达。在不掺入载体的情况下，可将遗传构建体导入宿主细胞中。例如，可以将可为核酸分子的遗传构建体掺入脂质体或病毒粒中。或者，可通过合适的方法，例如直接的胞吞摄取，将纯化的核酸分子(例如无组蛋白的DNA或裸DNA)直接插入宿主细胞中。可通过转染、感染、电穿孔、显微注射、细胞融合、原生质体融合或弹道轰击(ballistic bombardment)，将遗传构建体直接导入宿主受试者的细胞(例如细菌细胞)中。或者，可使用粒子枪(particle gun)，将本发明的遗传构建体直接导入宿主细胞中。或者，遗传构建体可含在重组载体内，以在合适的宿主细胞中表达。
因此，在本发明的第四方面，提供包含第三方面的遗传构建体的重组载体。
重组载体可以是质粒、黏粒或噬菌体。所述重组载体可用于用第五方面的遗传构建体转化宿主细胞，并用于在其中复制表达盒。技术人员应认识到，本发明的遗传构建体可与许多类型的骨架载体组合用于表达目的。重组载体可包括多种其它功能元件，其包括启动基因表达的合适的启动子。例如，可设计重组载体，使得它在宿主细胞的细胞溶胶中自主复制。在这种情况下，重组载体中可能需要诱导或调节DNA复制的元件。或者，可设计重组载体，使得它整合至宿主细胞的基因组中。可使用有利于靶定整合(例如通过同源重组)的DNA序列。
重组载体还可包含编码在克隆过程中可用作选择标记的基因的DNA，所述选择标记，即，能够选择经转染或转化的细胞并能够选择带有掺入异源DNA的载体的细胞。例如，氯霉素抗性是预期的。或者，选择标记基因可在不同载体中与含有目标基因的载体同时使用。载体还可包含参与调节编码序列表达或用于将表达的肽靶向至宿主细胞的某个部分的DNA。
因此，在第五方面，提供包含第三方面的遗传构建体或第四方面的重组载体的宿主细胞。
宿主细胞可以是细菌细胞，例如大肠杆菌。或者，宿主细胞可以是动物细胞，例如小鼠或大鼠细胞。优选宿主细胞不是人细胞。可采用已知技术，用本发明的遗传构建体或载体转化宿主细胞。用于将遗传构建体导入宿主细胞中的合适方法将取决于细胞的类型。
在第六方面，提供包含至少一种第五方面的宿主细胞的转基因宿主生物。
本发明的宿主细胞或转基因宿主生物的基因组可包含编码第一方面的肽、变体或片段的核酸序列。宿主生物可以是多细胞生物，其优选为非人的。例如，宿主生物可以是小鼠或大鼠。宿主可以是细菌。宿主可用于研发疫苗，所述疫苗用于使受试者免疫以免被例如GBS、大肠杆菌、葡萄球菌属菌种、肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌、脑膜炎奈瑟氏球菌和/或假单胞菌属菌种等脓毒症诱发细菌感染。实际上，对来自本文所述不同脓毒症诱发细菌的GAPDH的氨基酸序列的知识可有助于疫苗研发。
如本文所述，本发明人出乎意料地发现，GAPDH是与新生儿脓毒症以及年老者和糖尿病人的脓毒症有关的大多数有害细菌的胞外毒力因子。本发明人出人意外地发现，细菌GAPDH在感染的极早期在宿主中诱导IL-10产生，并且这些病原体利用GAPDH分泌作为逃避宿主免疫系统的形式(参见实施例5和6)。
本发明人还出人意外地发现，GAPDH通过与Toll样受体2 (TLR2)相互作用而作用于免疫细胞。有趣的是（interestingly），本发明人发现，细菌GAPDH能够接合（engage）B1淋巴细胞表面上的TLR2，并通过这些细胞诱导IL-10产生(参见实施例1和2)。本发明人发现，B1细胞是在GAPDH刺激时IL-10的主要生产者。
虽然本发明人从他们之前的研究了解到，TLR2介导的IL-10产生在由GBS引起的新生儿脓毒症的病理生理中起关键作用[42]，但出人意料的是，这种活性被GAPDH触发。按照文献[43，44]，预期TLR2识别细菌相关脂蛋白。本发明人因此总是假定TLR2介导的IL-10产生与GBS脂蛋白有关。因此，发现细菌GAPDH还可与TLR2结合并负责诱导IL-10产生的信号传导级联是出乎意料的。考虑到前述GAPDH是共有的毒力因子的出人意料的发现，同样完全出人意料的是，这种活性是除GBS以外的脓毒症诱发细菌所共有的(参见实施例3)。
发现其它白细胞，像巨噬细胞一样，在细菌GAPDH识别时也产生IL-10，虽然程度比B1细胞的低。另外，本发明人出人意外地发现，在由树突细胞或巨噬细胞产生的I型干扰素存在下，B1细胞的GAPDH诱导的(即TLR2介导的) IL-10产生显著增加，这在这些细胞识别细菌抗原后发生(参见实施例4)。这代表了完全新的毒力机制，其中细菌结构抗原和分泌的产物起协同作用以诱导宿主免疫抑制。
本发明人还发现，在细菌GAPDH存在下新生儿产生升高量的IL-10的趋势是其对这些感染的易感性提高的原因；虽然这对GBS是已知的[24]，但对于其它脓毒症诱发细菌是未知的或未预期的(参见实施例5)。通过中和细菌GAPDH还保护免疫受损成人(例如年老者和糖尿病人)免于脓毒症，这意味着在新生儿中观察到的相同机制对于这些人群也适用(参见实施例12和13)。然而，本发明人发现，细菌GAPDH还是人脐带血和成人白细胞中的IL-10的有效诱导剂，证实了在小鼠中观察到的相同机制也解释成人个体的机制（the samemechanism observed in mice is translated into human individuals）(参见实施例6)。
由于本发明人在其研究中研究了主要的脓毒症诱发细菌，他们假设会在任何其它脓毒症诱发细菌中观察到相同结果。考虑到这一点，本发明人研发了基于GAPDH的疫苗以预防特别是在诸如新生儿、婴儿、儿童、育龄女性、妊娠女性、胎儿、年老者和糖尿病人等免疫受损宿主中由脓毒症诱发细菌引起的感染性疾病。
因此，按照本发明第七方面，提供第一方面的肽、片段或变体在开发用于预防被脓毒症诱发细菌感染的疫苗中的用途。
脓毒症诱发细菌可优选选自以下细菌：GBS、大肠杆菌、葡萄球菌属菌种、肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌、假单胞菌属菌种和脑膜炎奈瑟氏球菌。在一个实施方案中，葡萄球菌属菌种是金黄色葡萄球菌。在另一个实施方案中，假单胞菌属菌种是铜绿假单胞菌。在另一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌是MenB。在一个实施方案中，脓毒症诱发细菌不是GBS。
第八方面，提供包含第一方面的肽、片段或变体的疫苗。
因为GAPDH是也存在于人中的蛋白质，所以用完整细菌GAPDH蛋白构成的疫苗可能引起自身免疫病理。有利的是，以实施例8-10为例，当第一方面的肽用作疫苗时，它导致对来自本文所述脓毒症诱发细菌的任一种的GAPDH的强抗体应答，同时避免了自身免疫病理。实际上，这类肽的使用被认为提高疫苗针对细菌GAPDH每个的特异性，这进而提高针对各细菌所提供的保护。如上所述(参见表1的序列比较)，在某些情况下，来自不同细菌的GAPDH间的序列相似性程度不那么高。通过使用不同的肽，因此可确保对细菌GAPDH的任一种的特异性免疫应答。使用单一GAPDH (完整蛋白质)作为疫苗，这将是不可能的。因此，本发明人出人意外地发现其中可将GAPDH衍生的疫苗给予有需要的受试者而不引起自身免疫病理的方法。特别就新生儿而言，新生儿B1细胞代表新生儿中总脾细胞的约30%。另一方面，成人B1细胞相当于总脾细胞的1-5% [45]。本发明人认为这增强了细菌GAPDH在新生儿对脓毒症的易感性中的作用。
第八方面(或如第七方面开发)的疫苗可包含以任何组合和以任何数目的本文所述或设想的不同肽的任一种或其片段或变体。因此在一个优选的实施方案中，疫苗可只包含本文所述肽的一个类型(例如SEQ ID NO: 9)。在另一个实施方案中，疫苗可包含本文所述或设想的肽的任何2 (例如SEQ ID NO: 9和10)、3 (例如SEQ ID NO: 9、10和11)、4、5、6、7、8、9、10种或更多种或其片段或变体。设想不同的肽或其片段或变体的任何组合，且其构成本发明的一部分。
在一个优选的实施方案中，疫苗包含表2所示肽(即具有SEQ ID NO: 9-12)的一种或更多种或其片段或变体。疫苗可包含任1种肽、任2种肽、任3种肽或甚至所有4种肽或其片段或变体。
在另一个优选的实施方案中，疫苗包含表3所示肽的一种或多种(即具有SEQ IDNO: 13-69)或其片段或变体。因此，疫苗可包含肽的任1种，或肽的任2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种或其片段或变体。
在又一个优选的实施方案中，疫苗包含表2所示肽(即具有SEQ ID NO: 9-12)的一种或多种和表3所示肽(即具有SEQ ID NO: 13-69)的一种或多种或其片段或变体。疫苗可包含肽的任1种，或肽的任2、3、4、5、6、7、8、9、10种或其片段或变体。
在一个最优选的实施方案中，疫苗含有表2所示所有4种肽(即具有SEQ ID NO: 9-12)或其片段或变体。纯粹出于方便起见，且不得解释为以任何方式予以限制，含有这4种肽的组合的疫苗在下文将称为新生儿疫苗(Neonatal Vaccine)。虽然其名称特别提及新生儿，但是新生儿疫苗意图用于本文所述的任何患者群并针对本文所述的任何疾病、病症或病况。在这一方面，早产和死产可能由被细菌感染诱导的加重的炎性反应引起。在细菌诱导的早产和死产的情况下，最常见的物质为GBS、大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌，即本文所述脓毒症诱发细菌。
在本文所述的疫苗中，肽、其片段或变体可连接在一起形成较大肽(或小的蛋白质)。在一个实施方案中，两种或更多种不同的肽(或片段或变体)连接在一起。在另一个实施方案中，相同肽(或片段或变体)的两个或更多个拷贝连接在一起。连接可以是直接的(即被连接的肽、片段或变体之间没有氨基酸)或间接的(即被连接的肽、片段或变体之间具有一个或多个氨基酸，因此所述氨基酸用作“间隔区（spacer）”)。可重复所述肽(或片段或变体)的一个或多个的某一形式以形成较大的肽/小的蛋白质。重复可以所谓串联重复彼此直接相邻，或它们可在各种情况下被一个或多个氨基酸间隔开来。或者连接的肽、片段或变体可以随机顺序出现。还预期上述排列的任何和全部组合，且其构成本发明的一部分。例如，可通过使相同肽、片段或变体的两个或更多个拷贝和两种或更多种不同的肽、片段或变体以某一形式,随机顺序或两种的组合连接在一起，来形成较大的肽。
因此，在一个优选的实施方案中，疫苗可包含仅一种类型的本文所述的肽、片段或变体(例如SEQ ID NO: 9)，但为该类型的两个或更多个连接的拷贝。在另一个实施方案中，疫苗可包含以刚刚在上文描述的任何排列的所述肽、片段或变体的任何2种(例如SEQ IDNO: 9和10)、3种(例如SEQ ID NO: 9、10和11)、4、5、6、7、8、9、10种或更多种连接的拷贝。
在一个优选的实施方案中，疫苗包含表2所示肽(即具有SEQ ID NO: 9-12)或其片段或变体的一个或多个连接的拷贝。疫苗可包含以本文所述任何连接排列的任一种肽、任2种肽、任3种肽或甚至所有4种肽或其片段或变体。
在另一个优选的实施方案中，疫苗包含表3所示肽(即具有SEQ ID NO: 13-69)或其片段或变体的一个或多个连接的拷贝。因此，疫苗可包含以本文所述的任何连接排列的肽的任1种，或肽的任何2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种或其片段或变体。
在又一个优选的实施方案中，疫苗包含以本文所述的任何连接排列的表2所示肽的一种或多种(即具有SEQ ID NO: 9-12)和表3所示肽的一种或多种(即具有SEQ ID NO:13-69)或其片段或变体。疫苗可包含以本文所述的任何连接排列的肽的任1种，或肽的任何2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种或其片段或变体。
在一个最优选的实施方案中，疫苗是新生儿疫苗，即含有以本文所述的任何连接排列的表2所示的所有4种肽(即具有SEQ ID NO: 9-12)或其片段或变体。
因此，第八方面(或如第七方面开发)的疫苗可包含任2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种第一方面的肽、片段或变体，其中肽、片段和/或变体的至少两种连接在一起。在这一方面，肽、片段或变体的任2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种可连接在一起。
本发明人出乎意料地观察到，衍生自脓毒症诱发细菌的GAPDH的肽和包含这些肽的疫苗能够引起保护性抗体应答。具体地讲，针对肽产生的抗体能够特异性识别并中和脓毒症诱发细菌的GAPDH。
因此，在第九方面，提供第一方面的肽、片段或变体或第八方面的疫苗用于刺激免疫应答的用途。
优选免疫应答包括对脓毒症诱发细菌的一个或多个菌种的GAPDH有特异性的抗体的产生。脓毒症诱发细菌可以是GBS、大肠杆菌、葡萄球菌属菌种、肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌、脑膜炎奈瑟氏球菌和/或假单胞菌属菌种。在一个实施方案中，葡萄球菌属菌种是金黄色葡萄球菌。在另一个实施方案中，假单胞菌属菌种是铜绿假单胞菌。在另一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌是MenB。因此，抗体对其具有特异性的GAPDH可以是具有SEQ ID NO:1-7提供的氨基酸序列的那些。在一个实施方案中，脓毒症诱发细菌不是GBS。
由于GAPDH是普遍存在的蛋白质，且如本文证实的在脓毒症诱发细菌中是保守的，所以本发明的肽、片段和变体能够诱导针对脓毒症诱发细菌的所有不同的血清型的保护，这是有利的。
先前，已表明针对9个GBS血清型的复合糖疫苗在动物中是免疫原性的，但不同表位特异性荚膜血清型的存在阻止了通用GBS疫苗的开发[46，47]。相比之下，GAPDH在所有已公开的GBS基因组中是结构保守的(同一性>99.8%)。如本发明人之前描述的，从GAPDH免疫的小鼠或兔的血清中纯化的抗GAPDH免疫球蛋白G (IgG)抗体因此用来证实属于不同血清型和/或MLSTypes的10个无关GBS临床分离株的培养上清液中存在GAPDH [24]。虽然GBSGAPDH显示分别与兔、小鼠和人GAPDH仅44.7、45.8和44.0%氨基酸同一性，但是，之前描述的“GBS疫苗”在给予哺乳动物时不诱导任何自身免疫[24]。鉴于本发明人目前发现GAPDH在所有脓毒症诱发细菌间是保守的，相同情况同样适用于本文所述肽、片段和变体。
肽、片段或变体的应用可以是体外、体内或离体应用。
优选肽、其片段或变体的应用是用于产生抗体的体外或离体应用。在一个特别优选的实施方案中，体外或离体应用是用于产生单克隆或多克隆抗体。
所述应用可包括第一方面的肽、片段或变体体外或离体与产抗体细胞相互作用，使得可产生对脓毒症诱发细菌的一个或多个菌种的GAPDH有特异性的抗体。本领域描述了合适的产抗体细胞和用于使所述细胞与本发明的肽、片段或变体接触以产生抗体的技术，且所述细胞和技术会为本领域技术人员已知的。例如，免疫的人和/或免疫的非人动物的血液制品可用来产生抗体。或者，第一方面的肽、片段或变体可用来产生对细菌GAPDH的不同表位有特异性的杂交瘤。可采用本领域可获得的标准技术产生杂交瘤。
在另一个优选的实施方案中，肽、其片段或变体的应用是体内应用，即用于刺激受试者的免疫应答。
可将肽、片段或变体直接给予待单独用它接种疫苗的受试者（a subject to bevaccinated on its own），即仅与存在于一种或多种脓毒症诱发细菌的GAPDH内的肽具有至少90%氨基酸序列同一性且与存在于人GAPDH内的肽具有小于10%氨基酸序列同一性的一种或多种分离的肽或其功能片段或功能变体。
可通过任何方法，包括通过注射或经粘膜，给予肽、片段或变体。优选经肌内、皮下、静脉内或真皮内给予肽、片段或变体。应认识到，将本发明的肽、片段或变体给予待接种的受试者会导致产生显示对肽、片段或变体有免疫特异性的相应抗体，且这些抗体有助于改善或治疗既有感染，并预防被脓毒症诱发细菌的后继感染。
因此在一个优选的实施方案中，肽、其片段或变体用于刺激对诸如GBS、大肠杆菌、葡萄球菌属菌种、肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌、脑膜炎奈瑟氏球菌和/或假单胞菌属菌种等脓毒症诱发细菌的GAPDH有特异性的抗体的产生。
技术人员应认识到，存在多种其中可根据本文所述抗原肽、片段和变体，例如SEQID NO: 9-69所列出的肽及其片段和变体制备疫苗的方法。例如，可构建基因工程疫苗，其中异源抗原(即肽、其片段或变体)与启动子或有利于在宿主载体(例如细菌如大肠杆菌，或病毒如腺病毒)中表达的基因融合。
疫苗可包含可用作佐剂的赋形剂。因此，在一个实施方案中，疫苗中的抗原肽、片段或变体可与微颗粒佐剂(例如脂质体或免疫刺激复合物(ISCOM))混合。肽、片段或变体可与佐剂(例如霍乱毒素或角鲨烯样分子)混合。可以使用任何佐剂，例如氢氧化铝(明矾)、破伤风类毒素或白喉毒素。溶媒可适宜地用于佐剂，这可包括但不限于水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、多元醇或葡萄糖溶液。
肽、其片段或变体还可适宜地与载体蛋白联用，以增加肽、片段或变体的有效大小。以这种方式，免疫系统将不仅仅识别肽或其片段或变体，而且还将具有对其的记忆。肽、其片段或变体可与任何载体蛋白有关，例如钥孔戚血蓝蛋白(KLH)。
因此本发明的疫苗适宜地包含本文所述的肽的一种或多种或其一种或多种片段或变体以及佐剂和/或载体蛋白。可使用所述肽的任一种，不论单独还是与其它所述肽的任一种组合。如本文所述，新生儿疫苗含有表2所示的所有4种肽(即具有SEQ ID NO: 9-12)或其片段或变体。然而，可代替地使用所述肽的任何组合。佐剂可以是经许可用于人的任一种，例如明矾、破伤风类毒素(TT)或白喉毒素(DT)。载体蛋白可以是KLH、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、TT和/或DT。适用于人的任何其它载体蛋白也可用于或备选用于疫苗中。
实施例7描述了其中可制备疫苗的一种方法。首先，可选择第一方面的肽、其片段或变体的一种或多种作为抗原，随后经接种的受试者会针对所述抗原产生相应抗体。然后可采用本领域已知技术，将编码指定肽、片段或变体的核酸分子或指定基因的序列克隆至合适的载体中以形成本发明第三方面的遗传构建体。
可将编码指定抗原的DNA序列插入编码已知蛋白质的宿主细菌细胞的任何已知靶基因中。可将编码抗原的DNA序列插入多个克隆位点。应认识到，可允许插入任何基因，只要宿主生物的生长和功能不受损，即插入是功能冗余的。
由此产生的遗传构建体可用于通过双交换重组转化营养期母细胞。或者，遗传构建体可以是整合载体，其可用于通过单交换重组转化营养期母细胞。
构建体可包含在宿主细胞中可选择的抗药基因，例如氯霉素抗性。在证实质粒克隆后，接着可通过合适的方法将质粒导入宿主细胞中。转化可以是DNA介导的转化或通过电穿孔。可通过测试质粒携带的现已导入基因组的抗药性来实现选择。
可采用蛋白质印迹法和探测大小分级分离的蛋白质(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳；SDS-PAGE)，利用识别所引入的抗原(即衍生自细菌GAPDH的肽、片段或变体)的抗体，来证实杂合或嵌合基因的表达。如果与宿主基因融合的抗原基因或核酸正确地表达，则出现新的条带，所述条带只被所述抗体识别，并且通常不存在于宿主中。可采用的其它技术为免疫荧光显微术和荧光激活细胞分选(FACS)分析，其可显示抗原在宿主表面上的表面表达。
可通过任何途径，包括肌内、皮下、真皮内、口服、可吸入、鼻内、直肠和静脉内途径，将所得疫苗给予受试者。口服给药可适宜地通过片剂、胶囊剂或混悬剂或乳剂。或者以细微粉剂或通过Dischaler®或Turbohaler®的气雾剂（aerosol via a Dischaler® orTurbohaler®）的形式给予疫苗。鼻内给药可适宜地为细微粉剂或气雾鼻腔喷雾剂或改良的Dischaler®或Turbohaler®的形式。直肠给药可适宜地通过栓剂。
配制本发明的疫苗以给予有需要的任何受试者，特别是免疫受损宿主例如新生儿、婴儿、儿童、育龄女性、妊娠女性、胎儿、老年受试者或糖尿病人。疫苗不必只给予已显示感染病征的人或被认为是由脓毒症诱发细菌引起的免疫受损或有较大感染风险的人。相反地，疫苗可给予表面上健康的受试者作为针对所述未来感染的可能性的纯粹预防性措施。例如，它可作为常规接种程序的一部分给予诸如新生儿、婴儿、儿童、育龄女性、妊娠女性、胎儿、年老者和糖尿病人等免疫受损宿主。
本文所用“免疫受损”意指具有受损的免疫系统，如以新生儿、婴儿、儿童、育龄女性、妊娠女性、胎儿、年老者和糖尿病人为例说明。
可配制本发明的疫苗用于给予任何年龄的指定受试者。这意指会将疫苗给予任何年龄的儿童，包括新生儿、婴儿、学步小童和学龄儿童。这意指会将疫苗给予妊娠女性和育龄女性，以保护母亲和胎儿免受感染。还意指在老年受试者晚年的任何时间会将疫苗给予老年受试者和在糖尿病人一生的任何时间点给予糖尿病人。
本文所用术语“新生儿”和“初生儿”可指从出生到约一个月龄的儿童。该术语适用于早产幼儿、过期产儿和足月幼儿。在出生前，使用术语“胎儿”。
本文所用术语“婴儿”和“幼儿”可指介于大约1月龄和大约1或2岁之间的幼小儿童(即当儿童学习走路和说话的年龄，此时可代之以使用术语“学步小童”)。
本文所用术语“儿童”是指年幼儿童，包括从学步小童到12岁左右(即青春期前)儿童。
本文所用术语“年老者”是指高龄受试者。例如，它可指年龄60或以上、65或以上、70或以上、75或以上或80或以上的男性和女性。该术语还包括处于相应的生命后期的非人类受试者。
本文所用术语“糖尿病人”是指患有1型糖尿病(亦称为幼年型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病)，处于该疾病的任何阶段的人。这是唯一与免疫系统病理有关的糖尿病类型，其使患者免疫受损。
可与其它既有疫苗，例如推荐用于免疫受损宿主例如婴儿、儿童、育龄女性、妊娠女性、年老者和糖尿病人的疫苗(例如破伤风和白喉疫苗)同时给予本发明的疫苗。
可特别通过肌内、皮下、真皮内、口服、鼻内或静脉内途径将本发明的疫苗给予育龄女性。该疫苗的加强免疫欲在妊娠末三月。疫苗欲保护育龄女性免于包括GBS、大肠杆菌、葡萄球菌属菌种、肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌、假单胞菌属菌种和脑膜炎奈瑟氏球菌在内的脓毒症诱发细菌引起的围产期感染。未出生幼儿(胎儿)获益于当其母体抗体穿过胎盘到达发育中的儿童、尤其在末三月时获得的被动免疫。如以实施例说明的一样，本发明的疫苗还可预防由因细菌(例如GBS、大肠杆菌和克雷伯氏菌属菌种)从生殖道上行至羊水所致子宫内感染引起的早产和死产。
可根据待接种疫苗的生物，使用合适的定量给药方案。例如，对于待接种疫苗的人类受试者，通常可采用3剂的10 mg/kg以片剂或胶囊剂的方式，以2个月为间隔。可抽血以分析血清(IgG)应答。可提取唾液、阴道液或粪便用于分析粘膜(分泌性IgA)应答。可采用间接酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析血清和粘膜样品中的抗体应答，以计量疫苗接种的功效。
如实施例中所述，本发明人表明本发明的肽能够诱导针对脓毒症诱发细菌的保护性抗体应答。本发明人在实施例中证实了本发明的疫苗能够预防由脓毒症诱发细菌引起的感染。优选疫苗用于预防GBS、大肠杆菌、葡萄球菌属菌种、肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌、脑膜炎奈瑟氏球菌和/或假单胞菌属菌种感染。在疫苗的研发中，且如上文所述，优选可将SEQID NO: 9-69的任一种或全部或其片段或变体用作抗原以引发待接种疫苗的受试者的免疫应答。疫苗是一种预防剂；这就是说，本文所述肽、片段或变体可用来预防感染，这包括之前感染的复发/再度定殖（relapse/recolonisation）。
因此，在第十方面中，提供用于疗法中的第一方面的肽、片段或变体。
在第十一方面中，本发明提供第一方面的肽、片段或变体或第八方面的疫苗，其用于预防由脓毒症诱发细菌引起的感染。
此外，按照本发明的第十二方面，提供预防由脓毒症诱发细菌引起的感染的方法，所述方法包括给予需要所述治疗的受试者第一方面的肽、片段或变体或第八方面的疫苗。
本发明的肽、片段、变体或疫苗可预防最常引起脓毒症的至少7种不同的病原体的一种或多种引起的全身感染，所述病原体优选：GBS、大肠杆菌、葡萄球菌属菌种、肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌、假单胞菌属菌种和脑膜炎奈瑟氏球菌。在一个实施方案中，葡萄球菌属菌种是金黄色葡萄球菌。在另一个实施方案中，假单胞菌属菌种是铜绿假单胞菌。在另一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌是MenB。在一个实施方案中，脓毒症诱发细菌不是GBS。本发明的肽、片段、变体或疫苗因此可预防脓毒症或由脓毒症诱发细菌的感染引起的任何其它疾病、病症或病况。这些其它疾病、病症或病况包括肺炎、脑膜炎、心内膜炎、小肠结肠炎、尿路感染、软组织感染、胃肠感染、血流感染和脑炎。
在一个优选的实施方案中，本发明的肽、片段、变体或疫苗用来预防早产和/或死产。如本文解释的，早产和死产由因细菌(例如GBS、大肠杆菌和克雷伯氏菌属菌种)从生殖道上行至羊水所致的子宫内感染引起。通过给孕妇接种本发明的肽、片段、变体或疫苗，在未出生后代中提供具有针对这类抗原产生的抗体的被动免疫。因此可通过母体接种保护胎儿和新生儿免受感染。
本发明人认识到，由所有脓毒症诱发细菌分泌的GAPDH、特别是这些分泌的GAPDH的序列相似性的知识也可被利用（harness）来制备用于治疗、预防或改善由脓毒症诱发细菌引起的感染的有用治疗药。例如，阻断分泌的GADPH与目标人或动物细胞结合的任何作用剂均可用作预防、治疗或改善该靶细胞中的感染的药物。
能够阻断分泌的GADPH与人或动物细胞结合的作用剂可以是抗体。例如，显示与本文所述的肽、片段或变体的任一种（包括SEQ ID NO: 9-69所列出的氨基酸序列的那些）有特异性的抗体将能够阻断分泌的GAPDH与人或动物细胞结合。例如，如果将疫苗经粘膜给予，它将在粘膜表面上产生分泌的IgA，且抗体(sIgA)会阻断GAPDH与宿主细胞上皮结合。如果全身给予疫苗，它将诱导IgG的产生，其将阻断细菌GAPDH与B1细胞表面上的TLR2结合，并防止由这些细胞引起的早期IL-10产生。
因此，按照本发明的第十三方面，提供对脓毒症诱发细菌的一个或多个菌种的GAPDH有特异性的抗体，所述抗体针对第一方面的肽、片段或变体产生。
术语“对……有特异性”，在本文结合抗体使用时，可指抗体的可变区专有地识别和结合其靶标，例如肽或多肽 (即尽管存在于肽或多肽家族中的序列同一性、同源性或相似性，也能够将靶标肽或多肽与其它类似的肽或多肽区分开来)。
同上，本发明第一方面的肽、片段或变体的氨基酸序列可以是存在于天然细菌GAPDH序列中的序列。所述序列因此可代表细菌GAPDH中的靶表位，其可用于阻断分泌的GAPDH与人或动物细胞结合。
因此，在第十四方面，提供对存在于脓毒症诱发细菌的一个或多个菌种的GAPDH中的表位有特异性的抗体，其中该表位具有基本如SEQ ID NO: 9-69所列出的任一个的氨基酸序列。
第十三方面和第十四方面的抗体能够阻断由脓毒症诱发细菌的一个或多个菌种分泌的GAPDH与人或动物细胞结合。同上，细胞可以是上皮细胞或B1细胞。还预期其它白细胞，例如巨噬细胞。例如，抗体可以是sIgA，且能够阻断GAPDH与人或动物上皮细胞结合。或者抗体可以是IgG，且能够阻断GAPDH与人或动物白细胞(例如B1细胞或巨噬细胞)表面上的TLR2结合。所述抗体因此适于阻断或中和人或动物细胞中的GAPDH诱导的IL-10产生。本发明包括单克隆和多克隆抗体两者。
按照本发明的第十五方面，提供产生对脓毒症诱发细菌的一个或多个菌种的GAPDH有特异性的抗体的方法，所述方法包括使产抗体细胞与第一方面的肽、片段或变体或第八方面的疫苗接触的步骤。
优选本发明上述方面提及的脓毒症诱发细菌为GBS、大肠杆菌、葡萄球菌属菌种、肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌、脑膜炎奈瑟氏球菌和/或假单胞菌属菌种。在一个实施方案中，葡萄球菌属菌种是金黄色葡萄球菌。在另一个实施方案中，假单胞菌属菌种是铜绿假单胞菌。在另一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌是MenB。因此，抗体对其具有特异性或抗体与之结合的GAPDH可以是具有以SEQ ID NO: 1-7识别的氨基酸序列的那些。在一个实施方案中，脓毒症诱发细菌不是GBS。
本发明的方法可以是体外、体内或离体方法。
合适的体外和离体方法是本发明的第九方面描述的方法，即用于产生对脓毒症诱发细菌的一个或多个菌种的GAPDH有特异性的(单克隆或多克隆)抗体的方法。
合适的体内方法是本发明的第九方面描述的方法，即疫苗接种的方法。
在第十六方面，提供治疗、改善或预防由脓毒症诱发细菌引起的感染的方法，所述方法包括给予需要所述治疗的受试者第十三方面或第十四方面的抗体或第八方面的疫苗。
优选抗体能够治疗、改善或预防GBS、大肠杆菌、葡萄球菌属菌种、肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌、脑膜炎奈瑟氏球菌和/或假单胞菌属菌种的感染。在一个实施方案中，葡萄球菌属菌种是金黄色葡萄球菌。在另一个实施方案中，假单胞菌属菌种是铜绿假单胞菌。在另一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌是MenB。因此，抗体对其具有特异性的GAPDH优选为具有以SEQ ID NO: 1-7提供的氨基酸序列的那些。在一个实施方案中，脓毒症诱发细菌不是GBS。
本发明的抗体因此可预防、治疗或改善脓毒症或由脓毒症诱发细菌的感染引起的任何其它疾病、病症或病况。这些其它疾病、病症或病况包括肺炎、脑膜炎、心内膜炎、小肠结肠炎、尿路感染、软组织感染、胃肠感染、血流感染和脑炎。因此还提供用于疗法、特别是用于预防、治疗或改善由脓毒症诱发细菌引起的感染，包括预防、治疗或改善前述疾病、病症和病况的本发明第十三方面和第十四方面的抗体。
优选抗体针对本发明第一方面定义的肽、片段或变体，或本发明第八方面定义的疫苗产生。
如上文结合本发明第十二方面的论述，针对本发明的肽、片段、变体或疫苗产生的抗体通过母体胎盘至未出生婴儿或在哺乳期的母乳中。在未出生后代中提供的这类被动免疫可防止脓毒症诱发细菌引起的感染，并预防早产和/或死产。因此在一个优选的实施方案中，第十六方面的方法是预防未出生婴儿感染的方法，并因此是预防早产和/或死产的方法。在这个实施方案中，会将抗体给予孕妇，作为替代分娩期抗生素预防的合适策略。因此还提供用于预防早产和/或死产的本发明第十三方面和第十四方面的抗体。
本文所用术语“抗体”不只包括完整IgG，还包括其一部分，包括Fab和F(ab’)2片段。它还包括sIgA。
因此，除使用本发明的疫苗接种外，用本文所述的肽、片段、变体或疫苗诱导的抗体，不论完整sIgA或IgG抗体还是其一部分，包括Fab或F(ab’)2片段，都可用作特别如下的受感染个体和/或未接受疫苗的母亲的治疗：
a) 待给予已证实或疑似脓毒症或脓毒症诱发细菌引起的感染的新生儿的治疗方法—完整IgG或Fab/F(ab’)2片段；
b) 待给予自未接受疫苗的母亲出生的新生儿的针对脓毒症诱发细菌引起的感染的预防方法—完整IgG或Fab/F(ab’)2片段；
c) 待给予未接受疫苗、处于接种末三月（in the third trimester ofvaccination）的母亲或育龄女性的针对脓毒症诱发细菌引起的感染的预防方法—完整IgG；和
d) 用于患有经证实由脓毒症诱发细菌引起的脓毒症或侵入性感染的孕妇或育龄女性的治疗方法。
被动给予抗GAPDH抗体构成相对于基于给予抗生素的现有治疗方的重大改进，所述给予抗生素引起抗性菌株的选择。当将另一受试者的抗体给予个人时，导致被动免疫。当将这些抗体引入所述人的体时，“借来的”抗体有助于预防或对抗某些感染性疾病。被动免疫提供的保护是短暂的，通常只持续几周或几月，但它提供即时保护。
如本文所证实的，当将抗体作为药物给予未免疫个体时，可人为诱导被动免疫。同上，这些抗体可来自有免疫的人的合并和纯化的血液制品或来自非人免疫动物，例如马、绵羊和兔。如实施例所示，将抗体被动给予新生小鼠提供保护免于被GBS、大肠杆菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌的致死感染。将这些抗体给予未接受本发明的疫苗接种的母亲和/或未接种疫苗母亲的新生儿。如本文的论述，还可通过将本发明的肽、作用剂、疫苗、抗体和药物给予孕妇，在胎儿中诱导被动免疫。未出生幼儿(胎儿)获益于当其母亲的抗体通过胎盘达到发育中的儿童(尤其在末三月)时获得的被动免疫。因此这是替代分娩期抗生素预防的合适策略。
应认识到，本发明的肽、作用剂、疫苗、抗体和药物可用于治疗、改善或预防被脓毒症诱发细菌感染的单一疗法(即只使用该肽、作用剂、疫苗、抗体或药物)。或者，本发明的肽、作用剂、疫苗、抗体和药物可作为治疗、改善或预防被脓毒症诱发细菌感染的已知疗法的辅助剂使用或与已知疗法组合使用。例如，肽、作用剂、疫苗、抗体或药物可与治疗脓毒症诱发细菌感染的已知作用剂组合使用。例如，肽、作用剂、疫苗、抗体或药物可与治疗由真菌或病毒引起的新生儿脓毒症的已知作用剂组合使用。它可与已知的抗反转录病毒剂组合使用。
没有限制将哪些本文所述的肽、作用剂、疫苗、抗体或药物给予哪些患者。相反地，预期可将本文所述肽、作用剂、疫苗、抗体和药物的任一种给予本文所述的任何患者。实际上，本发明人明确计划本发明包括每种肽、作用剂、疫苗、抗体或药物的组合和规定的患者组。本发明因此包括治疗剂和规定的患者组的每种可能的组合。在诸如新生儿、婴儿、儿童、育龄女性、妊娠女性、胎儿、年老者和糖尿病人等免疫受损宿主中使用新生儿疫苗是优选的。
可将本发明的肽、作用剂、疫苗、抗体和药物在具有多种不同形式的组合物中组合，所述形式特别取决于其中使用组合物的方式。因此，例如，组合物可为散剂、片剂、胶囊剂、液体、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、水凝胶、气雾剂、喷雾剂、胶束溶液、经皮贴剂、脂质体混悬剂的形式或可给予需要治疗的人或动物的任何其它合适的形式。应认识到，本发明药物的溶媒应是它所给予的受试者对其耐受良好且优选能够使得作用剂穿越血脑屏障递送的溶媒。
包含本发明的肽、作用剂、疫苗和抗体的药物可以多种方式使用。例如，可能需要口服给药，在此情况下，作用剂可包含在组合物内，所述组合物可为例如以片剂、胶囊剂或液体的形式口服摄入。包含本发明的肽、作用剂、疫苗、抗体和药物的组合物可通过吸入(例如鼻内)给予。还可配制组合物用于局部使用。例如，可将乳膏剂或软膏剂施用于皮肤。
还可将本发明的肽、作用剂、疫苗、抗体和药物掺入慢释或缓释装置中。例如可将所述装置插在皮肤上或插入皮肤之下，且药物可在几周或甚至几月内释放。装置可位于至少治疗部位的附近。在需要用按照本发明使用的作用剂长期治疗且所述治疗通常会需要频繁给药(例如至少每日注射)时，所述装置可以特别有利。
在一个优选的实施方案中，可通过注射入血流或直接注射入需要治疗的部位，将本发明的肽、作用剂、疫苗、抗体和药物给予受试者。注射可以是静脉内(推注或输注)或皮下(推注或输注)，或真皮内(推注或输注)。
应认识到，需要的肽、作用剂、疫苗、抗体或药物的量通过其生物活性和生物利用度确定，其进而取决于给药方式；肽、作用剂、疫苗、抗体和药物的物理化学性质；以及是用作单一疗法还是用作联合疗法。给药频率还将受作用剂在待治疗的受试者内的半寿期影响。待给予的最适剂量可由本领域技术人员确定，并且将随使用中的具体作用剂、药物组合物的强度、给药方式和细菌感染的进展而变化。取决于待治疗的具体受试者的其它因素会导致需要调整剂量，所述因素包括受试者年龄、体重、性别、饮食和给药时间。
一般而言，介于0.001 µg/kg体重和10 mg/kg体重之间的本发明的肽、作用剂、疫苗、抗体或药物的每日剂量可用于治疗、改善或预防细菌感染，这取决于使用哪一种肽、作用剂、疫苗、抗体或药物。更优选每日剂量介于0.01 μg/kg体重和1 mg/kg体重之间，更优选介于0.1 μg/kg和100 μg/kg体重之间，最优选介于约0.1 μg/kg和10 μg/kg体重之间。
可在细菌感染之前、期间或在发作后给予肽、作用剂、疫苗、抗体或药物。每日剂量可作为单次给药(例如单次每日注射)给予。或者，可能需要一天内两次或更多次给予肽、作用剂、疫苗、抗体或药物。例如，可作为介于0.07 μg和700 mg (即假设体重为70 kg)的两剂(或更多剂，这取决于待治疗细菌感染的严重程度)每日剂量给予肽、作用剂、疫苗、抗体和药物。接受治疗的患者可在醒时服用第一剂，然后晚上第二剂(如果以两剂方案)或之后以3或4小时间隔。或者，可使用慢释装置以向患者提供最适剂量的本发明的肽、作用剂、疫苗、抗体和药物，而不需要给予重复剂量。可采用已知方法，例如由制药工业(例如体内实验、临床试验等)常规采用的方法，以形成本发明的肽、作用剂、疫苗、抗体和药物的具体制剂和精确的治疗方案(例如作用剂的每日剂量和给药频率)。
在本发明的第十七方面，提供包含本发明第十三方面和第十四方面的抗体和任选药学上可接受的载体的脓毒症诱发细菌治疗组合物。
术语“脓毒症诱发细菌治疗组合物”或“抗脓毒症诱发细菌组合物”可意指用于治疗性改善、预防或治疗受试者的脓毒症诱发细菌感染的药物制剂。
本发明在第十八方面还提供用于制备本发明第十七方面的组合物的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明第十三方面和第十四方面的抗体与药学上可接受的载体混合。
作用剂(例如本发明的抗体)的“治疗有效量”是任何量，其是当给予受试者时所需要的治疗感染或产生所需作用的作用剂的量。
例如，所用作用剂(例如抗体)的治疗有效量可为约0.001 mg-约1000 mg，优选约0.01 mg-约500 mg。优选作用剂的量是约0.1 mg-约100 mg、最优选约0.5 mg-约50 mg的量。作为指导，用于本文所述实施例中的新生小鼠的抗体的剂量为40 mg/kg。
本文提及的“药学上可接受的载体”是本领域技术人员已知可用于配制药物组合物的任何已知的化合物或已知化合物的组合。
本文所用“受试者”可以是脊椎动物、哺乳动物或驯养动物。因此，本发明的肽、作用剂、疫苗、抗体和药物可用于治疗任何哺乳动物，例如家畜(例如马)、宠物，或可用于其它兽医应用。最优选受试者是人类。
在一个实施方案中，药学上可接受的载体可以是固体，且组合物可为散剂或片剂的形式。固体药学上可接受的载体可包括一种或多种物质，其还可用作调味剂、润滑剂、增溶剂、助悬剂、染料、填充剂、助流剂、压紧助剂、惰性基料（inert binders）、甜味剂、防腐剂、染料、包衣剂或片剂崩解剂。载体还可以是包封材料。在散剂中，载体是与本发明的细碎活性剂混合的细碎固体。在片剂中，活性剂可以合适比例与具有必需的压紧性质的载体混合，并按所需形状和大小压实。散剂和片剂优选含有高达99%的活性剂。合适的固体载体包括例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡和离子交换树脂。在另一个实施方案中，药用载体可以是凝胶，且组合物可为乳膏剂等的形式。
然而，药用载体可以是液体，且药物组合物为溶液的形式。液体载体用于制备溶液剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、酏剂和加压组合物。可将本发明的活性剂溶于或悬浮于药学上可接受的液体载体例如水、有机溶剂、两者的混合物或药学上可接受的油或脂肪中。液体载体可含有其它合适的药用添加剂例如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、助悬剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透压调节剂。对于口服和胃肠外给药，液体载体的合适实例包括水(部分含有上述添加剂，例如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包括一元醇和多元醇，例如二醇)及其衍生物和油(例如分馏椰子油和花生油)。对于胃肠外给药，载体还可为油性酯例如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。无菌液体载体可用于胃肠外给药的无菌液体形式的组合物。用于加压组合物的液体载体可以是卤化烃或其它药学上可接受的抛射剂。
可通过例如肌内、鞘内、硬膜外、腹膜内、静脉内和特别是皮下注射，使用作为无菌溶液剂或混悬剂的液体药物组合物。作用剂可制备成无菌固体组合物，在给药时可使用无菌水、盐水或其它合适的无菌注射介质将其溶解或悬浮。
本发明的作用剂和组合物可以无菌溶液剂或混悬剂的形式口服给予，所述溶液剂或混悬剂含有其它溶质或助悬剂(例如充足的盐水或葡萄糖以使溶液等渗)、胆汁盐、阿拉伯树胶、明胶、去水山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯80 (山梨糖醇的油酸酯及其与环氧乙烷共聚合的酐)等。按照本发明使用的作用剂也可以液体或固体组合物形式口服给予。适于口服给药的组合物包括固体形式(例如丸剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂和散剂)和液体形式(例如溶液剂、糖浆剂、酏剂和混悬剂)。可用于胃肠外给药的形式包括无菌溶液剂、乳剂和混悬剂。
应认识到，本发明延伸到任何核酸或肽或其变体、衍生物或类似物，其基本上包含本文提及的序列的任一个的氨基酸或核酸序列，包括其功能变体或功能片段。术语“基本上的氨基酸/核苷酸/肽序列”、“功能变体”和“功能片段”可以是与本文提及的序列的任一个的氨基酸/核苷酸/肽序列具有至少40%序列同一性(例如与以SEQ ID NO: 9-69识别的序列有40%同一性)的序列。
还预期与本文提及的序列的任一个具有大于50%、更优选大于65%、70%、75%序列同一性，甚至更优选大于80%序列同一性的氨基酸/核苷酸/肽序列。优选氨基酸/核苷酸/肽序列与本文提及的序列的任一个具有至少85%同一性，更优选与本文提及的序列的任一个具有至少90%、92%、95%、97%、98%同一性，最优选具有至少99%同一性。
技术人员应了解如何计算2个氨基酸/核苷酸/肽序列之间的百分比同一性。为了计算2个氨基酸/核苷酸/肽序列的百分比同一性，必须先准备2个序列之间的比对，接着计算序列同一性值。2个序列的百分比同一性可取不同的值，这取决于：(i)用来比对序列的方法，例如ClustalW、BLAST、FASTA、Smith-Waterman (在不同的程序中执行)，或3D比较的结构比对；和(ii)比对方法所用的参数，例如局部与全局比对，所用配对评分矩阵(例如BLOSUM62、PAM250、Gonnet等)和空位罚分，例如函数形式和常数。
完成比对后，有许多不同的计算2个序列之间的百分比同一性的方法。例如，可将同一性的数值除以：(i)最短序列的长度；(ii)比对的长度；(iii)序列的平均长度；(iv)无空位位置的数目；或(iv)不包括突出端的同等位置的数目。此外，应认识到，百分比同一性也是有很强的长度依赖性。因此，一对序列越短可预期偶然发生的序列同一性越高。
因此，应认识到，氨基酸或核酸序列的精确比对是一个复杂的过程。流行的多个比对程序ClustalW [48、49]是用于产生本发明的蛋白质或DNA的多种比对的优选方法。ClustalW的合适参数可如下：对于DNA比对：空位开放罚分= 15.0，空位延伸罚分= 6.66，阵列= Identity。对于蛋白质比对：空位开放罚分= 10.0，空位延伸罚分= 0.2，阵列=Gonnet。对于DNA和蛋白质比对：ENDGAP = -1，GAPDIST = 4。本领域技术人员应了解，对于最适序列比对，改变这些参数和其它参数可以是必需的。
优选，然后可从所述比对将2个氨基酸/核苷酸/肽序列之间的百分比同一性计算为(N/T)*100，其中N是序列共有相同残基的位置的数目，T为所比较位置的总数，包括空位位不包括突出端。因此，计算2个序列之间的百分比同一性的最优选的方法包括(i)应用使用一组合适的参数(例如上文列出的参数)的ClustalW程序准备序列比对；和(ii)将N和T值代入下式：序列同一性= (N/T)*100。
用于鉴定类似序列的备选方法会为本领域技术人员所知。例如，基本相似的核苷酸序列将是在严格条件下与编码第一方面的肽或其功能片段或功能变体的核苷酸序列或其互补序列杂交的序列。所谓严格条件意指核苷酸在3x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约45℃同与滤膜结合的DNA或RNA杂交，接着在0.2x SSC/0.1% SDS中在约20-65℃下的至少一次洗涤。或者，基本相似的肽可与SEQ ID NO: 9-69所列出的序列相比至少1个，但小于3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸不同。
由于遗传密码简并所致，显然可变动或改变本文所述任何核酸序列而不实质性地影响由其编码的肽、多肽或蛋白质的序列以提供其功能变体。合适的核苷酸变体是具有通过替换编码序列内相同氨基酸的不同密码子而改变的序列丙因此产生同义变化（silentchange）的那些。其它合适的变体是具有同源核苷酸序列并包含通过替换编码与其替换的氨基酸具有相似生物生理性质的侧链的氨基酸的不同密码子以产生保守变化而改变的全部或部分序列的那些。例如，小的非极性疏水氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。大的非极性疏水氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性的中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。因此应认识到，氨基酸可用具有相似生物生理性质的氨基酸替换，并且技术人员会了解编码这些氨基酸的核苷酸序列。
本文(包括任何随附权利要求、摘要和附图)所述所有特征和/或所公开的任何方法或过程的所有步骤可以任何组合与上述方面的任何结合，只是其中所述特征和/或步骤的至少一些相互排斥的组合除外。
为了更好地理解本发明并显示如何可以实现本发明的实施方案，现将举例参照随附的简图（diagrammatic drawings），其中：
图1显示主要脓毒症诱发细菌GBS、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌和脑膜炎奈瑟氏球菌的GAPDH的氨基酸序列比对。在提交本文以SEQ ID NO: 1-7 (按照之前标示的UniProt登记号的FASTA格式)识别的氨基酸序列后，从ClustalW2服务器获得多个比对。表1显示所得%序列相似性。
图2提供可用于本发明的疫苗的4种表面肽的实例。该表显示了4种示例性肽的氨基酸序列和具有各氨基酸序列的相应细菌。在表之下标示了相同的4种肽在不同细菌GAPDH中的表面定位。肽在本文以肽1-4 (SEQ ID NO: 9-12)识别，且它们组合使用以形成本文标识为新生儿疫苗的疫苗。
图3显示来自无乳链球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和人的GAPDH的氨基酸序列的比对。两个加框的区域显示肽1和肽2衍生自其中的序列。
图4-6显示在被细菌GAPDH刺激时新生儿B1细胞是IL-10的主要生产者。图4中的图A和B显示在脾单核细胞(MNC)、外周血嗜中性粒细胞(PMNC)、衍生自肝的巨噬细胞(FLM)或树突细胞(FLDC)和从新生小鼠脾纯化的B细胞(全部)、B1细胞和B2细胞用脂多糖(LPS)、rGAPDH或仅Roswell Park Memorial Institute (RPMI)培养基刺激后的IL-10浓度。图5显示在所示TLR2抑制剂(OxPAC)或Toll样受体4 (TLR4)抑制剂(CLI095)存在下在自新生小鼠的脾纯化的B1细胞用rGAPDH刺激后的IL-10浓度。图6的图A和B显示在自新生小鼠的脾纯化的全部细胞和B1细胞分别被rGAPDH、固定的GBS (GBSf)或仅RPMI培养基刺激后的IL-10浓度。图6的图C显示在衍生自胎肝的树突细胞和自新生儿脾纯化的B1细胞的共培养用rGAPDH、GBSf、一种对I型干扰素受体(αIFNAR)有特异性的单克隆抗体，或仅RPMI培养基的刺激后的IL-10浓度。图4-6中所有图描述的数据为至少2个独立实验的均值+SEM。
图7显示TLR2缺乏提高新生儿存活率并赋予对细菌脓毒症的保护。显示了被金黄色葡萄球菌菌株NEWMAN (图A)或大肠杆菌菌株IHE3034 (图B)攻击的新生小鼠的存活率。研究中包括野生型和TLR2-/-小鼠两者。结果表示从至少2个独立实验合并的数据。圆括号内的数字表示经历不同的感染性攻击后仍存活的动物数相对于受感染动物的总数。标明了TLR2缺陷型幼鼠与对照间的统计学差异(P值)。
图8显示阻断IL-10信号传导保护新生儿免于细菌脓毒症。显示了在注射对小鼠IL-10受体有特异性的单克隆抗体(抗IL10R)或同种型匹配的对照抗体(同种型IgG/对照)后被大肠杆菌菌株IHE3034 (图A)或金黄色葡萄球菌菌株NEWMAN (图B)攻击的新生小鼠的存活率。结果表示从3个独立实验合并的数据。圆括号内的数字表示经历不同的感染性攻击后仍存活的动物数相对于受感染动物的总数。标明了抗IL-10R治疗幼仔与对照间的统计学差异(P值)。
图9显示GAPDH分泌是共有的毒力机制。泳道1显示rGAPDH，其用作阳性对照。泳道2-6显示指定病原体(NEM316是GBS的菌株)的等价条带。数据表示5个独立实验。
图10显示用rGAPDH诱导的抗体保护新生小鼠免于除GBS以外的脓毒症诱发细菌引起的感染。显示了在注射rGAPDH诱导的抗体(抗rGAPDH IgG)或对照抗体(对照IgG)后被肺炎链球菌菌株Tigr4 (图A)、大肠杆菌菌株IHE3034 (图B)和金黄色葡萄球菌菌株NEWMAN(图C)攻击的小鼠幼仔的存活率。结果表示从2个独立实验合并的数据。圆括号内的数字表示经历不同感染性攻击后存活的动物的数目相对于受感染动物的总数。标明了免疫组与对照组间的统计学差异(P值)。
图11显示细菌GAPDH在人单核细胞中诱导IL-10产生。图A和B显示在从脐带血(图A)或外周血(图B)分离的人单核细胞用rGAPDH、TLR2抑制剂(TLR2 in)或仅RPMI培养基刺激后的IL-10浓度。图中描述的数据为至少2个独立实验的均值+ SEM。
图12显示来自大肠杆菌和人的GAPDH的氨基酸序列的比对。加框的区域显示来自图2的肽3。
图13显示来自铜绿假单胞菌和人的GAPDH的氨基酸序列的比对。氨基酸23处的加框的区域显示用于本发明的肽(SEQ ID NO: 62)。氨基酸59处加框的区域显示来自图2的肽4。
图14、15和16显示用本发明的疫苗诱导的抗体与细菌GAPDH反应。各凝胶的泳道1显示rGAPDH，其用作阳性对照。图14中的泳道2-6和图15和16中的泳道2显示指定病原体的等同条带。数据表示2个独立实验。
图17显示用新生儿疫苗诱导的抗体保护新生小鼠免于GBS感染。显示了在注射新生儿疫苗诱导的抗体(IgG)或对照IgG后用GBS NEM316攻击的小鼠幼仔的存活率。结果表示从2个独立实验合并的数据。圆括号内的数字表示经历感染性攻击后仍存活的动物数相对于受感染动物的总数。标明了免疫组与对照组间的统计学差异(P值)。
图18显示用新生儿疫苗诱导的抗体保护新生小鼠免于细菌脓毒症。显示了在注射新生儿疫苗诱导的抗体(IgG)或对照IgG后被肺炎链球菌菌株Tigr4 (图A)、大肠杆菌菌株IHE3034(图B)或金黄色葡萄球菌菌株NEWMAN (图C)攻击的新生小鼠的存活率。结果表示从至少2个独立实验合并的数据。圆括号内的数字表示经历不同的感染性攻击后仍存活的动物数相对于受感染动物的总数。标明了免疫组与对照之间的统计学差异(P值)。
图19显示抗GAPDH抗体的治疗应用可有效地治疗GBS诱导的脓毒症。显示了被GBSNEM316攻击且随后接受新生儿疫苗诱导的抗体(IgG)、对照IgG或盐水的新生小鼠的存活率。结果表示从2个独立实验合并的数据。圆括号内的数字表示经历感染性攻击后仍存活的动物数相对于受感染动物的总数。标明了免疫组与对照之间的统计学差异(P值)。
图20显示用新生儿疫苗诱导的抗体保护年老小鼠免于致死性GBS感染。显示在注射新生儿疫苗诱导的抗体(新生儿疫苗-IgG)或对照IgG (“假免疫”)后用GBS攻击的年老小鼠的存活率。结果表示从2个独立实验合并的数据。圆括号内的数字表示经历感染性攻击后仍存活的动物数相对于受感染动物的总数。标明了免疫组与对照组之间的统计学差异(P值)。
图21显示用新生儿疫苗诱导的抗体保护非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠免于致死GBS感染。显示了在注射新生儿疫苗诱导的抗体(新生儿疫苗-IgG)或对照IgG (“假免疫”)后用GBS攻击的NOD小鼠的存活率。结果表示从2个独立实验合并的数据。圆括号内的数字表示经历感染性攻击后仍存活的动物数相对于受感染动物的总数。标明了免疫组与对照组之间的统计学差异(P值)。
实施例
应用于实施例所述研究的材料与方法如下，除非另有说明：
小鼠
6-8周龄雄性和雌性BALB/c、C57BL/6和TLR2缺陷型C57BL/B6.129-Tlr2tm1Kir/J (TLR2-/-)小鼠和C57Bl/6年老小鼠(超过16个月)购自The Jackson Laboratory。NewZealand白兔和8周龄非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠购自Charles River Laboratories。在实验期间将动物保持在Institute Abel Salazar的动物设施中。所有程序按照用于实验和其它科学目的的脊椎动物保护的欧洲公约(European Convention for the Protection ofVertebrate Animals used for Experimental and Other Scientific Purposes) (ETS123)和86/609/EEC指导方针和葡萄牙条例(DL 129/92)进行。设计所有动物实验以使动物痛苦减到最小。
细菌
用于研究的细菌列于下表4中。所有菌株是获自被感染的新生儿的临床分离株。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、GBS和肺炎链球菌由法国巴黎Pasteur Institute的Patrick Trieu Cuot教授友情提供；肺炎克雷伯氏菌和脑膜炎奈瑟氏球菌由Microbiology Department of Hospital Geral de Santo António，Porto，Portugal提供。使GBS和肺炎链球菌在含有0.001 mg/mL硫酸多黏菌素和0.5 μg/mL oxalinic acid(Streptococcus Selective Supplement，Oxoid)的Todd-Hewitt液体培养基或琼脂(DifcoLaboratories)中生长。将大肠杆菌、铜绿假单胞菌、MenB和金黄色葡萄球菌在Todd-Hewitt液体培养基或琼脂培养基中培养。使细菌在37℃下生长。
表4：用于实施例所述研究的细菌
细菌 菌株
大肠杆菌 IHE 3034
金黄色葡萄球菌 NEWMAN
铜绿假单胞菌 PAO4
无乳链球菌，<i>GBS</i> NEM316
肺炎链球菌 Tigr4
脑膜炎奈瑟氏球菌 血清群B (MenB)
抗体治疗
抗体治疗在GBS感染前12小时的新生BALB/c小鼠(最多48时龄)和在GBS感染前24小时的C57Bl/6年老小鼠(超过16个月)和NOD小鼠中进行。对于被动免疫，给幼仔腹膜内注射100 μg抗rGAPDH IgG抗体。对照动物接受等量的对照IgG抗体。对于IL-10信号传导阻断，腹膜内给予100 μg抗IL10R抗体(1B1.3a，Schering-Plough Corporation)，而对照动物接收等量的匹配的同种型对照抗体。至于抗GAPDH抗体的治疗应用，在感染后6小时，小鼠幼仔用100 μg抗GAPDH IgG (或相应的对照IgG)治疗。
细菌感染的新生小鼠模型
用指定的细菌接种物以40 μl的最大体积给新生儿(48时龄)、BALB/c、C57BL/6野生型或TLR2-/-小鼠皮下注射。在整个实验期间使新生儿与其母亲保持在一起。测定12天实验期内的生存曲线。
rGAPDH
如之前所述产生并纯化rGAPDH [41]。
抗GAPDH IgG的纯化
以剂量间3周间隔，用含25 μg rGAPDH的PBS/明矾悬浮液使成年小鼠或兔免疫两次。在第2次免疫后10天收集血清。将合并的血清样品施加在G蛋白HP亲和柱(HiTrap，GEHealthcare Bio-Sciences AB)中，然后使纯化的IgG抗体通过具有固定化rGAPDH (Hi-trap NHS-activated HP，GE Health-care Bio-Sciences AB)的亲和柱。从用PBS/明矾悬浮液假免疫的小鼠或兔的血清中获得对照IgG，并在G蛋白HP亲和柱上纯化。使纯化的IgG抗体流分进一步在PBS中平衡，并以冷冻的等分样品保存在-80℃下。
脾总细胞培养物
通过轻拨补充青霉素(100 IU/ml)、链霉素(50 μg/ml)、2-ME (0.05 M)和10%胎牛血清(FBS) (Sigma-Aldrich)的RPMI 1640—完全RPMI (cRPMI)中的器官，获得来自新生小鼠(至多48时龄)脾的细胞。然后将细胞分布在96孔板(1 × 106个细胞/孔)上，在含有5%二氧化碳的潮湿环境中在37℃下用仅培养基、含有2.5 μg/ml LPS的培养基、含有25 μg/mlrGAPDH的培养基、含有1 μg/mL TLR2激动剂、PAM3CSK4 (Invivogen)的培养基培养12小时。对于用TLR抑制剂的实验，以10 μg/mL的浓度使用OxPAC (TLR2抑制剂)和CLI095 (TLR4抑制剂) (两者来自Invivogen)。
B细胞纯化
按照生产商说明书，使用小鼠B细胞纯化试剂盒(Miltenyi Biotech)，通过磁性细胞分选将B细胞从新生小鼠的脾(按上述制备)中纯化。
CD5 + B细胞纯化
按照生产商说明书，使用小鼠B1细胞纯化试剂盒(Miltenyi Biotech)，通过磁性细胞分选将B1细胞从新生小鼠的脾(按上述制备)中纯化。
新生儿肝衍生的巨噬细胞
巨噬细胞获自1日龄小鼠的肝。在无菌条件下取出肝，在Hanks平衡盐溶液(HBSS)中匀浆。将所得细胞悬液以500 × g离心，并重新悬浮于补充10% L929细胞条件培养液的cRPMI中。为了除去成纤维细胞或分化的巨噬细胞，将细胞在37℃下在5%二氧化碳气氛中的细胞培养皿中培养过夜。然后，用温热的cRPMI收集未贴壁细胞，以500 × g离心，以1 ×105个细胞/孔的密度分布在96孔板中，并在5%二氧化碳气氛中在37℃下孵育。在接种后4天，加入10% L929细胞条件培养液，在第七天更新培养基。在培养10天后，细胞完全分化成巨噬细胞。该方法允许保持这些吞噬细胞特有的形态、生理和表面标志物的巨噬细胞的均质原代培养物分化[50]。
新生儿肝衍生的树突细胞
树突细胞获自1日龄小鼠的肝。在无菌条件下取出肝，在HBSS中匀浆。将所得细胞悬液以500 x g离心，重新悬浮于补充30 ng/ml粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(Immunotools)的cRPMI (原代DC培养基)中。为了除去成纤维细胞或分化的巨噬细胞，将细胞在37℃下在5%二氧化碳气氛中的细胞培养皿中培养过夜。在第3天，除去75%培养基(连同未贴壁细胞)，加入原代DC培养基。在第6天，通过对板底轻轻吹吸培养基以轻轻地逐出未贴壁细胞，来从平板取出细胞。在此数分钟后，将细胞混合物转移到50 mL聚苯乙烯管中。然后将细胞以500 x g离心5-7分钟，并重新悬浮于原代DC培养基中。对细胞进行计数，并以5×105个细胞/孔的浓度接种。对于共培养实验，每孔接种5 × 104个树突细胞。在共培养实验中，按规定，使用20 μg/mL对I型干扰素受体有特异性的单克隆抗体(抗IFNAR)(Biolegend)。
血液嗜中性粒细胞的纯化
对于嗜中性粒细胞分离，从新生小鼠(至多48时龄)眶后出血来收集血液，并在含有BSA (0.1% w/v)和葡萄糖(1% w/v)的HBSS中1:2稀释。使细胞沉淀，红细胞通过低渗裂解除去。将血液制备物悬浮于Dulbecco’s PBS (GIBCO)中，在三层Percoll (GE-Healthcare)梯度(80、65和55%，在Dulbecco’s PBS中)分层，并在10℃下以1200 x g离心30分钟。回收在65%和80%流分界面处的成熟嗜中性粒细胞，纯度为85%，如使用抗Ly6G抗体(Biolegend)通过FACS分析测定。将分离的嗜中性粒细胞接种在96孔板中，按规定刺激12小时。
IL-10定量测定
按照生产商说明书，通过ELISA (R&D Systems)定量测定新生或成年细胞培养物的IL-10。
人血样品
在知情同意后，在Hospital Geral de Santo António获得人血样品。对于单核细胞的分离，将在RPMI 1640中1:2稀释的总血液的5 ml等分试样在2.5 ml Histopaque(Sigma-Aldrich)上分层，并在室温下以1000 g离心20分钟。然后从培养基-Histopaque界面中轻轻取出细胞，转移到无菌容器中，并在10 ml cRPMI中洗涤。将分离的单核细胞重新悬浮于cRPMI中，以5×105个细胞/孔的浓度接种，并用25 μg/mL rGAPDH、10 μg/mL OxPAC或仅培养基(RPMI)在37℃与5%二氧化碳下刺激12小时。
新生儿疫苗
使肽1-4 (SEQ ID NO: 9-12)与作为载体蛋白的KLH或OVA缀合。对于免疫方案，给雌性BALB/c小鼠腹膜内注射20 μg与载体蛋白缀合的各个肽。明矾在1:20 PBS悬浮液中用作佐剂。以剂量间3周间隔，使成年雌性BALB/c小鼠免疫3次。在最后一次免疫后10天，收集血液，并在4℃下凝血24小时后，获得“新生儿疫苗”抗血清。
在大鼠中使用相同的免疫方案用于脑膜炎奈瑟氏球菌研究(实施例8)。
实施例1-在细菌GAPDH刺激时新生儿B细胞亚群引起IL-10产生
之前公开的信息显示，GAPDH在使新生儿免疫系统失去对抗GBS感染的能力的作用[24]。虽然揭示了IL-10在GAPDH诱导的免疫抑制机制中的作用，但细胞机制仍未知。为了揭开哪个细胞群引起在新生儿GBS感染中观察到的早期IL-10产生，自新生小鼠纯化不同的白细胞群，并在体外用来自GBS的rGAPDH处理。
材料与方法
具体地说且如上所述，树突细胞和巨噬细胞获自新生儿肝前体，B细胞和单核细胞获自新生儿脾，而嗜中性粒细胞纯化自新生儿外周血。根据CD5的表面表达，获自新生儿脾的B细胞的更精细分离允许B1 (CD5+)细胞的分离。
不同的白细胞群在体外用0.5 μg/mL LPS (作为阳性对照；LPS是已知诱导多克隆B细胞活化的结构性微生物抗原)、25 μg/mL rGAPDH或仅RPMI培养基(作为阴性对照)在37℃与5%二氧化碳下刺激12小时。在所有条件下，使用5 × 105个细胞/孔，分离的B细胞研究除外，其中使用2.5 × 105个细胞/孔。
在细胞孵育后，在如上所述上清液中测量IL-10浓度。
在每种情况下进行至少2个独立实验。
结果
如图4A所述，当比较单核细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、树突细胞和总B细胞在GAPDH刺激时产生IL-10的能力时，仅B细胞保持产生大量IL-10的能力。
在分离新生儿B细胞后，本发明人观察到B1细胞保留产生IL-10的能力，而B2细胞只产生痕量的该细胞因子(图4B)。
讨论
该研究表明在细菌GAPDH刺激时新生儿B1细胞是IL-10的主要来源。
实施例2—TLR2是细菌GAPDH的表面受体
为了证实负责细菌GAPDH识别和诱导IL-10表达的细胞受体，本发明人比较了在不同模式识别受体的特异性抑制剂存在下GAPDH在纯化的B1细胞培养物中诱导IL-10产生的能力。
材料与方法
如上所述从新生小鼠的脾中纯化B1细胞。
在10 µg/ml TLR2或TLR4抑制剂存在下将2.5 × 105 B1个细胞/孔体外用25 μg/mL rGAPDH在37℃与5%二氧化碳下刺激12小时。所用的TLR2和TLR4抑制剂分别为OxPAC和CLI095。
在细胞孵育后，在如上所述上清液中定量测定IL-10。
进行了至少2个独立实验。
结果
本发明人发现GAPDH诱导的IL-10产生在TLR2抑制剂存在下被完全消除(图5)。
讨论
该结果表明，细菌GAPDH通过TLR2对B1细胞起作用以诱导IL-10产生。
实施例3—TLR2缺乏提高新生儿生存率并赋予对细菌脓毒症的保护
该研究的目的在于证实TLR2作为GAPDH的受体的重要性和新生儿对脓毒症的易感性的原因。
材料与方法
在出生后48小时，给新生野生型和TLR2-/-小鼠皮下注射5 × 105 CFU金黄色葡萄球菌菌株NEWMAN或500 CFU大肠杆菌菌株IHE3034。以每日为基础监测感染后小鼠的存活率。
进行了至少2个独立实验。
结果
在被指定细菌感染后，野生型小鼠不能够经历感染仍存活超过48小时(图7)。相比之下，大部分TLR2-/-小鼠在感染后12天仍存活。
讨论
结果表明与野生型小鼠相比，TLR2缺陷型新生小鼠提高了针对被大肠杆菌和金黄色葡萄球菌攻击性感染的存活率。TLR2因此在新生儿对脓毒症的易感性中起重要作用；这就是说，TLR2缺乏提高新生儿生存率并赋予对细菌脓毒症的保护。除实施例2获得的结果以外，这些数据因此证实在不同脓毒症诱发细菌的菌株中TLR2作为GAPDH的受体的重要性。
实施例4—通过由细菌诱导的树突细胞的I型干扰素的产生与GAPDH协同提高B1细胞中的IL-10产生
该研究的目的在于鉴定在GAPDH被其它白细胞群识别时B1细胞是否促进IL-10的产生，且以何种能力（capacity）促进IL-10的产生。
材料与方法
如上所述，总脾细胞获自新生小鼠，B1细胞纯化自总脾细胞群。
不同的脾细胞群在体外用25 μg/mL rGAPDH、异丙醇中固定的107个GBS细胞(GBSf)或仅RPMI培养基在37℃与5%二氧化碳下刺激12小时。在所有条件下，使用5 × 105个细胞/孔，纯化的B1细胞研究除外，其中使用2.5 × 105个细胞/孔。
如上所述，树突细胞衍生自胎肝。将树突细胞与2.5 ×105个自新生儿脾纯化的B1细胞以1:10比率共培养，并用25 μg/mL rGAPDH、107个GBSf细胞、20 μg/mL抗IFNAR或仅RPMI培养基在37℃与5%二氧化碳下刺激12小时。
在不同的细胞类型孵育后，在如上所述上清液中定量测定IL-10。
在每种情况下进行至少2个独立实验。
结果与讨论
总脾细胞中GAPDH诱导IL-10产生的能力在固定的细菌存在下明显提高(图6A)。然而，这种作用在纯化的B1细胞失去，其中加入固定的细菌不增加GAPDH诱导的IL-10产生(图6B)。
该结果表明，除B1细胞以外的不同的白细胞群被细菌抗原刺激，并有助于B1细胞在GAPDH识别时产生IL-10。
共培养研究使得能够理解其它白细胞亚群在影响B1细胞产生IL-10中的作用。本发明人观察到在树突细胞存在下，当同时用GAPDH加GBSf刺激时，B1细胞产生的IL-10量升高(图6C)。引人关注的是，当I型干扰素信号传导被阻断时，这种作用消失(图6C)。
该结果表明，在细菌识别时，树突细胞产生I型干扰素，其在用GAPDH刺激的B1细胞中增加IL-10产生。
实施例5—早期IL-10产生是被脓毒症诱发细菌利用以定居新生儿宿主的普遍机制
证实了产生大量IL-10的能力是新生儿对于GBS感染的易感性的主要原因[24]。本研究的目的在于研究GBS以外的细菌(尤其是大肠杆菌或金黄色葡萄球菌)引起的新生儿感染是否同样如此发生。与GBS一起，大肠杆菌和葡萄球菌是造成高达87%人类新生儿脓毒症病例的原因。
该研究的目的还在于其它细菌是否也具有胞外GAPDH，作为脓毒症诱发细菌所用以定居新生儿宿主的普遍的IL-10依赖性机制的指征。
材料与方法
在用大肠杆菌或金黄色葡萄球菌攻击前，如下将新生小鼠用对小鼠IL-10受体有特异性的阻断性抗体(抗IL10R)治疗。
如上所述，给新生小鼠腹膜内注射100 μg抗IL10R单克隆抗体或100 μg同种型对照IgG。12小时后，用500 CFU大肠杆菌菌株IHE3034或5 × 105 CFU金黄色葡萄球菌菌株皮下攻击小鼠。以每日为基础监测感染后小鼠的存活率。
进行了3个独立实验。
为了研究其它诱导脓毒症的病原体是否也具有胞外GAPDH，如下获得目标病原体的培养上清液中胞外蛋白质，通过SDS-PAGE分离，并使用抗rGAPDH抗体通过蛋白质印迹分析。
如上所述制备GBS菌株NEM316、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的培养物，并按照标准程序，从培养上清液中纯化胞外蛋白质。按照标准程序，使用如上所述获自rGAPDH免疫的兔的抗rGAPDH抗体(IgG)，进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。rGAPDH用作阳性对照。
进行了5个独立实验。
如下研究了中和由这些细菌分泌的GAPDH的作用以评价这些病原体是否也利用GAPDH分泌作为毒力机制。
如上所述给小鼠幼仔腹膜内注射80 μg抗rGAPDH抗体(IgG)或80 μg对照IgG。12小时后，用5 × 106 CFU肺炎链球菌菌株Tigr4、500 CFU大肠杆菌菌株IHE3034或5 × 105CFU金黄色葡萄球菌菌株NEWMAN皮下攻击小鼠。以每日为基础监测感染后小鼠的存活率。
进行了2个独立实验。
结果
引人关注的是，当与接受同种型匹配的对照抗体的幼仔相比时，阻断IL-10信号传导显著提高新生儿针对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌引起的感染的存活率(图8)。
还显示了其它脓毒症诱发细菌具有胞外GAPDH (图9)。显示了使用抗rGAPDH抗体中和这种分泌的GAPDH保护新生小鼠免于肺炎链球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌引起的感染(分别为图10A-C)。
讨论
结果表明，所观察到的新生儿对于GBS诱导的脓毒症的易感性的机制是与其它脓毒症诱发细菌通用的(transversal)。虽然本文提供由大肠杆菌和金黄色葡萄球菌引起的新生儿感染的IL-10数据，但是其它细菌也分泌GAPDH的事实是以下的强指示物，即新生儿在响应细菌GAPDH时产生大量IL-10的倾向是不同细菌病原体所用的普遍机制，其导致脓毒症的发生。该结果证实了针对GBS的基于GAPDH的疫苗对于其它脓毒症诱发细菌也将是可行的事实。
实施例6—GAPDH诱导的IL-10产生是人细胞中保守的机制
该研究的目的在于研究人细胞是否也在响应GAPDH时产生IL-10。
材料与方法
如上所述，从人脐带血或成人外周血分离单核细胞。
将细胞用25 μg/mL rGAPDH、10 μg/mL OxPAC (一种TLR2抑制剂)或仅RPMI培养基在37℃与5%二氧化碳下体外刺激12小时。
在细胞孵育后，在如上所述上清液中定量测定IL-10。
进行了至少2个独立实验。
结果
与在新生小鼠中观察到的一致，用rGAPDH刺激自人脐带血或成人外周血纯化的单核细胞诱导产生大量的IL-10 (分别图11A和图11B)。
引人关注的是，在TLR2抑制剂存在下人白细胞中GAPDH诱导的IL-10产生被完全消除。
讨论
该结果表明小鼠细胞中GAPDH诱导的IL-10产生的机制对人也适用。
然而，小鼠中研究的相同毒力机制可容易地转化到人中的事实强有力地支持使用小鼠作为研究人的细菌脓毒症的极好模型。
实施例7—新生儿疫苗的产生
根据本发明人的发现：新生儿在响应细菌GAPDH时产生大量IL-10的倾向是不同细菌病原体所用的普遍机制，本发明人提出使用GAPDH衍生肽作为抗原生产针对所述病原体的疫苗。
材料与方法
如上所述制备新生儿疫苗。
结果
本发明的疫苗由来自不同脓毒症诱发细菌的GAPDH的表面肽组成，所述肽具有不存在于人GAPDH中的氨基酸序列。因此，本发明人开发出由属于不被人GAPDH共有的微生物GAPDH的保守序列的肽组成的疫苗。
图2包括采用上述方法鉴定存在于本研究中的4种示例性肽的氨基酸序列和具有各氨基酸序列的各细菌的表格。表下是显示不同细菌GAPDH中相同的4种肽的表面定位的图像。
图3说明两种肽(在图2和3中以肽1和肽2识别)具有在某些细菌菌种间保守，但非在人中不保守的氨基酸序列的情况。
图12和13说明来自大肠杆菌和铜绿假单胞菌(在图2中分别以肽3和肽4识别)的其它两种肽具有不存在于人中的(细菌中保守的)氨基酸序列的情况。
将肽1-4组合用于本发明的优选疫苗(本文称为新生儿疫苗)的制备中。因此，新生儿疫苗适于针对图2的表中所列的全部细菌使用。
然而，肽1-4仅仅是实例；这就是说，可按上文阐述的相同方式，通过序列比对，鉴定适用于本发明疫苗的其它肽。可使用来自所述病原体的GAPDH的任何其它氨基酸序列。然而如本文解释的，优选避免也存在于人中的任何序列，以避免任何自身免疫病理。
如本文所述，可使用呈任何组合的任何数目的肽代替新生儿疫苗的肽1-4。这就是说，构成本发明的疫苗的肽的数目和性质（identity）可改变。
讨论
如本文解释的，细菌GAPDH在引起新生儿和免疫受损宿主的免疫抑制和促进细菌脓毒症中起作用。因此，本文所述疫苗，包括本实施例描述的具体新生儿疫苗旨在保护易感染宿主(包括新生儿、年老者和其它这样的免疫受损个体)免于由GBS、大肠杆菌、葡萄球菌属菌种、肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌和假单胞菌属菌种引起的感染。本发明人所采用的方法使得有可能仅仅通过选择其GAPDH上人GAPDH中不存在的表面暴露的肽来“定制”用于任何脓毒症诱发细菌的本发明疫苗。
实施例8—用新生儿疫苗诱导的抗体与细菌GAPDH反应
该研究的目的在于显示实施例7中生产的疫苗可用于产生识别细菌GAPDH的抗体。
材料与方法
如上所述用新生儿疫苗使小鼠和大鼠免疫。
如上所述，制备GBS菌株NEM316、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和MenB的培养物，并按照标准程序从培养上清液中纯化胞外蛋白质。按照标准程序，使用如上所述获自rGAPDH免疫的小鼠和大鼠的抗GAPDH抗体(IgG)，进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。rGAPDH用作阳性对照。
进行了2个独立实验。
结果
如图14-16所示，自用新生儿疫苗免疫的小鼠和大鼠中纯化的抗体与来自不同细菌的胞外GAPDH反应。
图15 (显示肺炎克雷伯氏菌的结果)显示了被用新生儿疫苗诱导的抗GAPDH抗体识别的2条带。引人关注的是，~45 KDa的条带精确对应于GBS GAPDH的相同分子量。另一条带(~35 KDa)对应于预测的肺炎克雷伯氏菌GAPDH的分子量(http://www.uniprot.org/uniprot/C4X7S6)。
图16 (显示MenB的结果)显示了~37 kDa的条带，其对应于预测的MenB GAPDH的分子量[51]。
讨论
该研究表明用新生儿疫苗诱导的抗体识别来自GBS菌株NEM316、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和MenB的GAPDH。这些数据因此提供共有的细菌肽序列可用于识别细菌GAPDH的疫苗中的概念验证。
虽然此处仅测试了脑膜炎奈瑟氏球菌的血清型B，但对于该细菌的所有其它血清型将预期类似结果。在这一方面，来自脑膜炎奈瑟氏球菌的不同血清型的GAPDH共有高(97.668%)同源性(http://www.uniprot.org/align/A20150610146R80D4XR)，且因此会预期用新生儿疫苗诱导的抗体识别来自其所有的GAPDH。因此认为本文所述疫苗对于脑膜炎奈瑟氏球菌的所有血清型都是有利的。
图15所阐述的结果还显示肺炎克雷伯氏菌引人关注地可具有GAPDH的2个同种型。
实施例9—新生儿疫苗保护新生儿免于GBS感染
该研究的目的在于显示实施例8中生产的抗体可用来保护新生小鼠免于GBS感染。
材料与方法
如上所述给小鼠幼仔腹膜内注射80 μg新生儿疫苗诱导的IgG或80 μg对照IgG。12小时后，用5 × 106 CFU GBS NEM316皮下攻击小鼠。以每日为基础监测感染后小鼠的存活率。
进行了2个独立实验。
结果
之前证实了用rGAPDH (完整蛋白质)的母体接种是预防由GBS引起的新生儿感染的有效策略[24]。然而，当在GBS感染前将用新生儿疫苗诱导的抗体用于幼仔被动免疫时，保护甚至更有效。实际上，用新生儿疫苗提供的保护为100% (图17)。
讨论
该结果表明与之前描述的相比，用于开发本发明的疫苗，包括新生儿疫苗的新方法(即使用本文所述精选肽序列代替完整蛋白质)将新生儿的免疫系统引导向针对以GBS为例说明的脓毒症诱发物质的更稳健和特异性的反应。
该结果还表明由新生儿疫苗提供的免疫是可再现的(100%有效)，这显然是有利的。
虽然该研究只关注GBS感染，但是要了解，在由其它脓毒症诱发细菌所致感染时会观察到相同结果(尤其是因为实施例8显示用新生儿疫苗诱导的抗体识别来自GBS菌株NEM316、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和脑膜炎奈瑟氏球菌(以MenB为例说明)的GAPDH)。
此外，图17所呈结果提供以下证据：母体接种新生儿疫苗(或因此用本发明的抗GAPDH抗体的母体治疗)将显著降低由阴道内GBS感染引起的死产和早产。实际上，如上文结合本发明第十二方面的论述，针对本发明的肽、片段、变体或疫苗产生的抗体可通过母体胎盘传给未出生婴儿。另外，且如图17所示，在用新生儿疫苗诱导的抗体免疫后赋予幼仔针对GBS的保护为100%。
由于GBS和本文所述其它脓毒症诱发细菌的GAPDH间的高序列相似性和功能同源性，所提供的数据还表明新生儿疫苗还将有效地防止由其它脓毒症诱发细菌引起的死产和早产。这是一个重要发现，因为细菌感染是造成全球每年约650,000例死产的原因[52，53]。另外，少于32周妊娠的约50%早产也是由细菌感染引起的[9，14，53-56]。绝大部分由从阴道上行到羊水的母体共栖细菌引起。GBS、大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌是存在于由上行性细菌感染引起的死产婴儿尸体解剖的最常见的病原体。
实施例10—中和细菌GAPDH是保护新生儿免于细菌脓毒症的通用方法
该研究的目的在于通过研究抗体介导的细菌GAPDH的中和是否可预防由其它相关脓毒症诱发细菌引起的新生儿感染，来延伸实施例9中所述的研究。
材料与方法
如上所述给小鼠幼仔腹膜内注射80 μg新生儿疫苗诱导的IgG或80 μg对照IgG。12小时后，用107 CFU肺炎链球菌菌株Tigr4、500 CFU大肠杆菌菌株IHE3034或5 x 105 CFU金黄色葡萄球菌菌株NEWMAN皮下攻击小鼠。以每日为基础监测感染后小鼠的存活率。
结果
如图18所示，将用新生儿疫苗诱导的抗体用于新生儿被动免疫中显著提高在细菌攻击时的存活率。此处显示肺炎链球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的结果(分别参见图18A-C)。
讨论
如本文的论述，目前没有针对最相关的脓毒症诱发细菌的任一种的可获得的疫苗。此处提供表明细菌GAPDH的抗体介导的中和预防由最相关的脓毒症诱发细菌引起的新生儿感染的数据。
实施例11—治疗性给予新生儿疫苗IgG抗体保护新生小鼠免于GBS感染
该研究的目的在于研究用新生儿疫苗诱导的抗体是否可治疗由脓毒症诱发细菌引起的既有新生儿感染。
材料与方法
在5 × 106 GBS NEM316 CFU皮下感染后6小时，给小鼠幼仔(至多48时龄)腹膜内注射新生儿疫苗IgG、对照IgG (80 μg)或盐水溶液(0.9% NaCl)。在治疗期间，所有小鼠呈现明显的感染病征，通过感染部位的严重皮疹评价。以12小时为基础监测感染后小鼠的存活率。
结果
如图19所示，仅接受新生儿疫苗诱导的IgG抗体的小鼠能够经历GBS感染后仍存活。实际上，在GBS感染后，小鼠幼仔用抗GAPDH IgG抗体治疗导致动物全部存活。相比之下，对照无一在感染后存活。
讨论
如本文的论述，新生儿脓毒症可获得的现行治疗仅基于给予抗生素。此处提供的数据表明，由新生儿疫苗诱导的抗体可用于治疗由GBS (最相关的脓毒症诱发细菌之一)引起的既有新生儿感染。
虽然该研究只关注GBS感染，但要了解，在被其它脓毒症诱发细菌感染时会观察到相同结果(尤其是因为实施例8显示用新生儿疫苗诱导的抗体识别来自GBS菌株NEM316、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和脑膜炎奈瑟氏球菌(以MenB为例说明)的GAPDH)。
本发明的第一方面的肽、片段和变体因此在产生用于指定患者群的多种有用和急需的基于抗体的疗法中具有重大作用。
实施例12—新生儿疫苗保护年老小鼠免于GBS感染
该研究的目的在于显示实施例8中生产的抗体可用于保护年老小鼠免于GBS感染。
材料与方法
持续3天每天给C57Bl/6年老小鼠(年龄超过16个月)腹膜内注射1 mg/kg新生儿疫苗诱导的IgG或相同量的同种型匹配的IgG作为对照。在最后剂量后24小时，用2 × 107CFU GBS NEM316皮下攻击小鼠。以每日为基础持续12天监测感染后小鼠的存活率。
进行了2个独立实验。
结果
显示了接种新生儿疫苗保护年老小鼠免于致死GBS感染。实际上，与10只对照中仅1只(10%)存活相比，注射新生儿疫苗的9只小鼠中有8只(~90%)在细菌攻击后仍存活(图20)。
讨论
该结果表明本发明的疫苗，包括新生儿疫苗，可与在新生儿中证明的平行方式(参见实施例9)，将年老小鼠的免疫系统引导向针对以GBS为例说明的脓毒症诱发物质的稳健的和特异性的反应。
因此本发明人坚定地认为，年老者中对由脓毒症诱发细菌引起的感染的易感性受与他们在新生儿中发现的同一机制支持（underpin）(即由GBS细菌分泌的GAPDH通过TLR2作用于B1细胞以诱导IL-10产生)。实际上，本文提供的数据显示新生儿疫苗可用于产生识别由GBS产生的细菌GAPDH的抗体，这显然在年老小鼠中具有保护作用，正像在新生儿中观察到的一样。本发明人因此还坚定地认为所述保护作用对其它这类免疫受损宿主也将适用。
虽然该研究只关注GBS感染，但要了解，在被其它脓毒症诱发细菌感染时可观察到相同结果(尤其是因为实施例8显示用新生儿疫苗诱导的抗体识别来自GBS菌株NEM316、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和脑膜炎奈瑟氏球菌(以MenB为例说明)的GAPDH)。因此在其它免疫受损宿主(例如年老小鼠)中可合理地预期在不同细菌菌株攻击的新生小鼠中用新生儿疫苗观察到的结果(参见实施例10)。
如本文所述，目前没有有效保护年老者免于由最相关的脓毒症诱发细菌的任一种引起的感染的可获得的疫苗。在这一组中对抗脓毒症的治疗策略也远非有效。本文提供表明细菌GAPDH的抗体介导的中和预防年老者中由最相关的脓毒症诱发细菌引起的感染的数据。疫苗接种是用于感染性疾病的最有成本效益的治疗法，当同一疫苗可预防不同年龄组的由不同人类病原体引起的感染时甚至更是如此，正如本文已证实的。
年老小鼠中获得的数据是新生小鼠中获得的其它结果在年老者和其它这类免疫受损宿主中也可获得的概念验证。因此预期将新生儿疫苗IgG抗体给予患有由脓毒症诱发细菌引起的既有感染的年老小鼠导致对其产生治疗，正如在新生儿中观察到的(参见实施例11)。由于针对脓毒症可获得的现行治疗只是基于给予抗生素，由新生儿疫苗诱导的抗体可用于治疗年老者以及新生儿和本文指定的其它患者群的由最相关的脓毒症诱发细菌引起的既有感染的事实，显然是有利的。
实施例13—新生儿疫苗保护NOD小鼠免于GBS感染
该研究的目的在于表明实施例8中生产的抗体可用于保护糖尿病转基因小鼠模型(NOD小鼠)免于GBS感染。
材料与方法
持续3天每日给NOD小鼠(8周龄)腹膜内注射1 mg/kg新生儿疫苗诱导的IgG或同量的同种型匹配的IgG作为对照。在最后一剂后24小时，小鼠用5 × 107 CFU GBS NEM316皮下攻击。以每日为基础连续12天监测感染后小鼠的存活率。
进行了2个独立实验。
结果
显示了使用新生儿疫苗诱导的IgG的被动免疫保护NOD小鼠免于致死GBS感染。实际上，与8只中的仅2只(25%)假免疫对照相比，注射新生儿疫苗诱导的IgG的8只小鼠中有7只(~90%)在经历细菌攻击后仍存活(图21)。
讨论
该结果表明本发明的疫苗，包括新生儿疫苗，可与在新生儿(参见实施例9)和年老者(参见实施例12)中所证明的平行方式，将糖尿病转基因小鼠模型的免疫系统引导向针对以GBS为例说明的脓毒症诱发物质的稳健的和特异性的反应。
因此本发明人坚定地认为，与年老者中一样，糖尿病患者中对脓毒症诱发细菌引起的感染的易感性受与他们在新生儿中发现的相同机制支持(即由GBS细菌分泌的GAPDH通过TLR2作用于B1细胞以诱导IL-10产生)。实际上，本文提供的数据显示新生儿疫苗可用来产生识别由GBS产生的细菌GAPDH的抗体，且这在糖尿病小鼠中明显具有保护作用，正如在新生儿(和年老者)中观察到的一样。本发明人因此也坚定地认为，所述保护作用对其它这类免疫受损宿主也将适用。
再次，虽然该研究只关注GBS感染，但要了解，在被其它脓毒症诱发细菌感染时可观察到相同结果(尤其是因为实施例8显示用新生儿疫苗诱导的抗体识别来自GBS菌株NEM316、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和脑膜炎奈瑟氏球菌(以MenB为例说明)的GAPDH)。因此在其它免疫受损宿主(例如糖尿病人)中也可合理地预期在不同细菌菌株攻击的新生小鼠中用新生儿疫苗观察到的结果(参见实施例10)。
如本文所述，糖尿病患者对脓毒症诱发细菌引起的感染的易感性提高。本文提供表明细菌GAPDH的抗体介导的中和在该患者组中预防由最相关的脓毒症诱发细菌引起的感染的数据。如所解释的，疫苗接种是用于感染性疾病的最有成本效益的治疗，当同一疫苗可在不同的年龄组中和在不同的疾病、病况和病症中预防由不同人类病原体引起的感染时甚至更是如此，正如此处已证实的。
糖尿病小鼠中获得的数据也是新生儿中获得的其它结果也将在糖尿病患者和其它这类免疫受损宿主中获得的概念验证。因此预期将新生儿疫苗IgG抗体给予患有由脓毒症诱发细菌引起的既有感染的糖尿病小鼠导致对其产生治疗，正如在新生儿中观察到的一样(参见实施例11)。
由于对于脓毒症目前可获得的治疗只基于给予抗生素，由新生儿疫苗诱导的抗体可用来治疗糖尿病患者以及新生儿、年老者和本文指定的其它患者群的由最相关的脓毒症诱发细菌引起的既有感染的事实，显然是有利的。
总结评论
实施例提供的数据表明本发明的疫苗和治疗(包括新生儿疫苗)保护免疫受损宿主例如新生儿、婴儿、儿童、育龄女性、妊娠女性、胎儿和年老者尤其免于细菌脓毒症的实用性（relevance）。
然而，本文所述的新生儿疫苗和其它疫苗和治疗的基本原理表明关于之前已公开的结果[24，25]的重要的新的创造性步骤，即：
a) 新生儿宿主中细菌GAPDH籍以诱导IL-10的机制；
b) GAPDH诱导的IL-10产生与对由不同病原体引起的细菌脓毒症的易感性有关；
c) GAPDH诱导的IL-10产生是在人脐带血细胞中保守的机制；
d) GAPDH诱导的IL-10产生是在自成年人外周血分离的白细胞中保守的机制；
e) 抗GAPDH抗体在预防由GBS引起的死产中的功效；
f) 由新生儿疫苗(和本文所述其它疫苗)诱导的抗体识别来自GBS、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌的胞外GAPDH。
g) 通过用新生儿疫苗(和本文所述其它疫苗)诱导的抗体的被动免疫中和细菌GAPDH保护新生儿免于由GBS、大肠杆菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌引起的脓毒症；
h) 衍生自脓毒症诱发细菌的GAPDH的肽和抗GAPDH IgG抗体作为针对新生儿脓毒症和本文指定的其它患者群的脓毒症的预防策略或治疗的用途。
参考文献
1. Edmond K, Zaidi A (2010) PLoS Med 7: e1000213。
2. Lukacs SL, Schrag SJ (2012) J Pediatr 160: 960-965 e961。
3. van den Hoogen A, Gerards LJ, Verboon-Maciolek MA等(2010)Neonatology 97: 22-28。
4. Stoll BJ, Hansen NI, Adams-Chapman I等(2004) JAMA 292: 2357-2365。
5. Edmond KM, Kortsalioudaki C, Scott S等(2012) Lancet 379: 547-556。
6. Smith A, Saiman L, Zhou J等(2010) Pediatr Infect Dis J 29: 831-835。
7. Stoll BJ, Hansen NI, Sanchez PJ等(2011) Pediatrics 127: 817-826。
8. Tazi A, Disson O, Bellais S等(2010) J Exp Med 207: 313-2322。
9. Hornik CP, Fort P, Clark RH等(2012) Early Hum Dev 88 Suppl 2: S69-74。
10. Kronforst KD, Mancuso CJ, Pettengill M等(2012) PLoS One 7:e43897。
11. Bourgeois-Nicolaos N, Cordier AG, Guillet-Caruba C等(2013) J ClinMicrobiol 51(4): 1305-6。
12. Watson RS, Carcillo JA, Linde-Zwirble WT等(2003) Am J Respir CritCare Med 167: 695-701。
13. Carr R, Brocklehurst P, Dore CJ等(2009) Lancet 373: 226-233。
14. Goldenberg RL, Hauth JC, Andrews WW (2000) N Engl J Med 342:1500-1507。
15. Kaufman D, Fairchild KD (2004) Clin Microbiol Rev 17: 638-680, 目录。
16. Stoll BJ, Hansen N, Fanaroff AA等(2002) N Engl J Med 347: 240-247。
17. Stoll BJ, Hansen NI, Higgins RD等(2005) Pediatr Infect Dis J 24:635-639。
18. Bishton M, Chopra R (2004) Br J Haematol 127: 501-508。
19. Groselj-Grenc M, Ihan A, Pavcnik-Arnol M等(2009) Intensive CareMed 35: 1950-1958。
20. Melvan JN, Bagby GJ, Welsh DA等(2010) Int Rev Immunol 29: 315-348。
21. Pammi M, Brocklehurst P (2011) Cochrane Database Syst Rev:CD003956。
22. Shann F (2009) Lancet 373: 188-190。
23. Wynn JL, Levy O (2010) Clin Perinatol 37: 307-337。
24. Madureira P, Andrade EB, Gama B等(2011) PLoS Pathog 7: e1002363。
25. Madureira P, Baptista M, Vieira M等(2007) J Immunol 178: 1379-1387。
26. Heppner HJ, Cornel S, Peter W等(2013) Crit Clin Care 29: 757-774。
27. Dellinger RP, Levy MM, Carlet JM等(2008) Crit Care Med 36: 296-327。
28. Linden PK (2009) Infect Dis Clin North Am 23: 535-556。
29. Brun-Buisson C, Doyon F, Carlet J等(1995) JAMA 274: 968-974。
30. Jacobsson G, Dashti S, Wahlberg T等(2007) Scand J Infect Dis 39:6-13。
31. Skoff TH, Farley MM, Petit S等(2009) Clin Infect Dis 49: 85-92。
32. Lin YT, Wang FD, Wu PF等(2013) BMC Infect Dis 13: 56。
33. Seifert KN, McArthur WP, Bleiweis AS等(2003) Can J Microbiol (5):350-6。
34. Aguilera L, Ferreira E, Giménez R等(2012) Int J Biochem Cell Biol44(6): 955-962。
35. Aguilera L, Giménez R, Badia J等(2009) Int Microbiol 12(3): 187-192。
36. Egea L, Aguilera L, Giménez R等(2007) Int J Biochem Cell Biol 39(6): 1190-1203。
37. Kerro-Dego O, Prysliak T, Perez-Casal J等(2012) Vet Microbiol 156(3-4): 443-447。
38. Purves J, Cockayne A, Moody PC等(2010) Infect Immun 78(12): 5223-5232。
39. Goji N, Potter AA, Perez-Casal J (2004) Vet Microbiol 99(3-4):269-279。
40. Ling E, Feldman G, Portnoi M等(2004) Clin Exp Immunol 138(2):290-298。
41. Madureira P, Baptista M, Vieira M等(2007) J Immunol 178(3): 1379-87。
42. Andrade EB, Alves J, Madureira P等(2013) J Immunol 191(9): 4759-4768。
43. Henneke P, Dramsi S, Mancuso G等(2008) J Immunol180: 6149-6158。
44. Machata S, Tchatalbachev S, Mohamed W等(2008) J Immunol181: 2028-2035。
45. Vosshenrich CA, Cumano A, Muller W等(2003) Nat Immunol 4(8): 773-779。
46. Johri AK, Paoletti LC, Glaser P等(2006) Nat Rev Microbiol 4: 932–942。
47. Doran KS, Nizet V (2004) Mol Microbiol 54: 23–31。
48. Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ (1994) Nucleic Acids Res 22(22): 4673-4680。
49. Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F等(1997) Nucleic Acids Res 25(24): 4876-4882。
50. Tushinski RJ, Oliver IT, Guilbert LJ等(1982) Cell 28: 71–81。
51. Tunio SA, Oldfield NJ, Ala'Aldeen DA等(2010) BMC Microbiol 10:280。
52. Goldenberg RL, McClure EM, Saleem S等(2010) Lancet 375: 1482-1490。
53. Lawn JE, Cousens S, Zupan J (2005) Lancet 365: 891-900。
54. Barton L, Hodgman JE, Pavlova Z (1999) Pediatrics 103: 446-451。
55. Mulholland EK, Adegbola RA (2005) N Engl J Med 352: 75-77。
56. Schrag SJ (2011) Lancet 378: 11-12。
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Claims (32)

1.一种分离的肽，其由如SEQ ID NO: 9-69的任一个所列的氨基酸序列组成。
2.权利要求1要求保护的分离的肽，其中所述肽能够诱发以下抗体，所述抗体结合并中和GBS、大肠杆菌(E. coli)、葡萄球菌属菌种(Staphylococcus spp.)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitidis)或假单胞菌属菌种(Pseudomonas spp.)的GAPDH但不结合人GAPDH。
3.权利要求1或2要求保护的分离的肽，其中所述分离的肽与载体蛋白缀合。
4.权利要求1要求保护的分离的肽，其中所述肽：
a) 长为小于30个氨基酸或小于20个氨基酸；
b) 长为至少10个氨基酸；和/或
c) 长为10-20个氨基酸。
5.一种分离的核酸，其编码权利要求1、2或4中的任一项要求保护的肽。
6.一种遗传构建体，其包含权利要求5要求保护的核酸。
7.一种重组载体，其包含权利要求6要求保护的遗传构建体。
8.一种宿主细胞，其包含权利要求6要求保护的遗传构建体或权利要求7要求保护的重组载体。
9.权利要求1-4中的任一项要求保护的肽在研发用于预防被脓毒症诱发细菌感染的疫苗中的用途，所述脓毒症诱发细菌选自GBS、大肠杆菌(E. coli)、葡萄球菌属菌种(Staphylococcus spp.)、肺炎链球菌(S. pneumoniae)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitidis)或假单胞菌属菌种(Pseudomonasspp.)。
10.一种疫苗，其包含权利要求1-4中的任一项要求保护的肽。
11.权利要求10要求保护的疫苗，其包含权利要求1-4中的任一项要求保护的两种或更多种肽，其中所述肽的至少两种连接在一起。
12.权利要求10-11中的任一项要求保护的疫苗，其包含具有如SEQ ID NO: 9-12所列的氨基酸序列的肽的任1种、2种、3种或所有4种。
13.权利要求10-11中的任一项要求保护的疫苗，其经配制用于给予优选选自以下的免疫受损宿主：新生儿、婴儿、儿童、育龄女性、妊娠女性、胎儿、糖尿病受试者和/或老年受试者。
14.权利要求1-4中的任一项要求保护的肽或权利要求10-13中的任一项要求保护的疫苗在制备用于刺激针对脓毒症诱发细菌的免疫应答的药物中的用途，所述脓毒症诱发细菌选自GBS、大肠杆菌(E. coli)、葡萄球菌属菌种(Staphylococcus spp.)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitidis)或假单胞菌属菌种(Pseudomonas spp.)。
15.权利要求14要求保护的用途，其中所述免疫应答包括对脓毒症诱发细菌的一个或多个菌种的GAPDH有特异性的抗体的产生。
16.权利要求14或权利要求15要求保护的用途，其中所述用途是：
a) 体外、体内或离体用途；和/或
b) 用于刺激单克隆或多克隆抗体产生的体外或离体用途。
17.权利要求1-4中的任一项要求保护的肽或权利要求10-13中的任一项要求保护的疫苗用于体外或离体刺激针对脓毒症诱发细菌的免疫应答的用途，所述脓毒症诱发细菌选自GBS、大肠杆菌(E. coli)、葡萄球菌属菌种(Staphylococcus spp.)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitidis)或假单胞菌属菌种(Pseudomonas spp.)。
18.权利要求17要求保护的用途，其中所述免疫应答包括对脓毒症诱发细菌的一个或多个菌种的GAPDH有特异性的抗体的产生。
19.权利要求17或权利要求18要求保护的用途，其中所述用途是用于刺激单克隆或多克隆抗体产生的体外或离体用途。
20.权利要求1-4中的任一项要求保护的肽或权利要求10-13中的任一项要求保护的疫苗在制备用于在有需要的受试者中预防由脓毒症诱发细菌引起的感染的药物中的用途；其中所述脓毒症诱发细菌选自GBS、大肠杆菌、葡萄球菌属菌种、肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌、假单胞菌属菌种和脑膜炎奈瑟氏球菌。
21.权利要求20要求保护的用途，其中所述药物用于预防脓毒症、肺炎、脑膜炎、心内膜炎、小肠结肠炎、尿路感染、软组织感染、胃肠感染、血流感染、脑炎、早产和死产的任一种或多种。
22.一种对脓毒症诱发细菌的一个或多个菌种的GAPDH有特异性的抗体，所述脓毒症诱发细菌选自GBS、大肠杆菌(E. coli)、葡萄球菌属菌种(Staphylococcus spp.)、肺炎链球菌(S. pneumoniae)、肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)或假单胞菌属菌种(Pseudomonas spp.)，所述抗体针对权利要求1-4中的任一项要求保护的肽或权利要求10-13中的任一项要求保护的疫苗产生。
23.一种对存在于脓毒症诱发细菌的一个或多个菌种的GAPDH中的表位有特异性的抗体，所述脓毒症诱发细菌选自GBS、大肠杆菌(E. coli)、葡萄球菌属菌种(Staphylococcusspp.)、肺炎链球菌(S. pneumoniae)、肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitidis)或假单胞菌属菌种(Pseudomonas spp.)，其中所述表位具有如SEQID NO: 9-69的任一个所列的氨基酸序列。
24.权利要求23要求保护的抗体，其中所述抗体针对权利要求1-4中的任一项要求保护的肽或权利要求10-13中的任一项要求保护的疫苗产生。
25.一种产生对脓毒症诱发细菌的一个或多个菌种的GAPDH有特异性的抗体的方法，所述脓毒症诱发细菌选自GBS、大肠杆菌(E. coli)、葡萄球菌属菌种(Staphylococcusspp.)、肺炎链球菌(S. pneumoniae)、肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitidis)或假单胞菌属菌种(Pseudomonas spp.)，所述方法包括使产抗体细胞与权利要求1-4中的任一项要求保护的肽或权利要求10-13中的任一项要求保护的疫苗接触的步骤，其中所述方法不是治疗方法。
26.权利要求25要求保护的方法，其中所述方法是体外、体内或离体方法。
27.权利要求26要求保护的方法，其中所述方法是
a) 产生单克隆或多克隆抗体的体外或离体方法；
b) 疫苗接种的体内方法。
28.权利要求22-24中的任一项要求保护的抗体在制备用于在有需要的受试者中治疗、改善或预防由脓毒症诱发细菌引起的感染的药物中的用途，所述脓毒症诱发细菌选自GBS、大肠杆菌(E. coli)、葡萄球菌属菌种(Staphylococcus spp.)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitidis)或假单胞菌属菌种(Pseudomonas spp.)。
29.权利要求28要求保护的用途，其中所述药物用于治疗、改善或预防脓毒症、肺炎、脑膜炎、心内膜炎、小肠结肠炎、尿路感染、软组织感染、胃肠感染、血流感染和脑炎的任一种或多种，和/或是预防早产和/或死产。
30.权利要求20或权利要求28要求保护的用途，其中所述需要治疗的受试者是优选选自以下的免疫受损宿主：新生儿、婴儿、儿童、育龄女性、妊娠女性、胎儿、糖尿病受试者和/或老年受试者。
31.一种脓毒症诱发细菌治疗组合物，其包含权利要求22-24中的任一项要求保护的抗体和任选药学上可接受的载体，其中所述脓毒症诱发细菌选自GBS、大肠杆菌(E. coli)、葡萄球菌属菌种(Staphylococcus spp.)、肺炎链球菌(S. pneumoniae)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitidis)或假单胞菌属菌种(Pseudomonasspp.)。
32.一种用于制备权利要求31要求保护的组合物的方法，所述方法包括将治疗有效量的权利要求22-24中的任一项要求保护的抗体与药学上可接受的载体组合。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ532894A (en) * 1998-04-29 2005-10-28 Univ Southern California Retroviral vectors including modified envelope escort proteins
JP2008529504A (ja) * 2005-02-08 2008-08-07 ニューヨーク ブラッド センター 重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルスに対する中和モノクローナル抗体
WO2007132461A2 (en) * 2006-05-11 2007-11-22 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Classification of protein sequences and uses of classified proteins
ES2298055A1 (es) * 2006-08-09 2008-05-01 Fundacion Marques De Valdecilla Peptidos inmunogenicos frente a los generos listeria y mycobacterium, anticuerpos y usos de los mismos.
US20120100172A1 (en) * 2009-06-25 2012-04-26 Michael Tal Immunogenic streptococcus pneumoniae peptides and peptide-multimers
JP2013503158A (ja) * 2009-08-26 2013-01-31 ザ・フェインスタイン・インスティチュート・フォー・メディカル・リサーチ 炎症性サイトカインカスケードによって媒介される病態を、ｇａｐｄｈ阻害剤を用いて治療する方法
WO2011067758A2 (en) * 2009-12-02 2011-06-09 Protea Vaccine Technologies Ltd. Immunogenic fragments and multimers from streptococcus pneumoniae proteins
EP2550529B1 (en) * 2010-03-23 2021-11-17 Iogenetics, LLC. Bioinformatic processes for determination of peptide binding
WO2014055897A2 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Human monoclonal anti-pd-l1 antibodies and methods of use
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