KR20200013809A - 면역약화된 숙주용 백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 보편적인(ubiquitous) 단백질로부터 유도된 펩타이드, 및 이러한 펩타이드를 암호화하는 핵산을 제공한다. 본 발명은 예를 들면, 패혈증-유도성 세균에 의해 야기된 감염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 백신 자체를 사용하기 위한 그리고 치료학적 약물에 사용하기 위한 항체의 생성에 사용하기 위한 항원으로서의 이들 펩타이드 및 핵산의 각종 용도로 확장된다. 본 발명은 특히 면역약화된 숙주, 예를 들면, 신생아, 유아, 소아, 가임 연령의 여성, 임신한 여성, 태아, 노인 및 당뇨병 환자에 이롭다.

Description

면역약화된 숙주용 백신{VACCINE FOR IMMUNOCOMPROMISED HOSTS}
본 발명은 패혈증-유도성 세균에 의해 야기된 질환, 장애 및 병태, 및 구체적으로, 전적으로는 아니지만 패혈증 및 패혈증-관련 병리의 치료 및 예방에 관한 것이다. 본 발명은 신규한 펩타이드 및 이들의 암호화 핵산으로, 그리고 면역화에 의한 또는 수동적 항체 전이(passive antibody transfer)에 의한 패혈증-유도성 세균에 의한 감염의 예방을 위한 백신을 생성하기 위한 이들 펩타이드의 용도로 확장된다. 본 발명은 구체적으로 면역약화된(immunocompromised) 숙주, 예를 들면, 신생아, 유아, 소아, 가임 연령의 여성, 임신한 여성, 태아, 노인 및 당뇨병 환자에 이롭다.
패혈증은 신생아 이환율 및 사망률의 주요 원인이다. 세계 보건 기구(WHO)에 의하면, 매년 대략 1백만명의 사망이 신생아 패혈증에 의해 야기된다[1-3]. 또한, 살아남은 신생아의 30 내지 50%는 장기 후유증, 예를 들면, 인지 장애, 발작 또는 난청을 앓는다[4].
신생아 감염은 출생 전에 (자궁 내에서(in utero)), 분만 동안에 또는 출생 후에 발생할 수 있다. 자궁내 감염은 모체의 생식관으로부터 양수로의 공생 세균의 상승에 의해 야기된다[1]. 분만 동안 발생하는 감염은 모체의 생식관으로부터의 점막을 콜로니화하는(colonising) 미생물의 흡인(aspiration)에 의해 야기된다. 상기 경우 둘 다에서, 감염의 87% 이하는 그룹 B 스트렙토코커스(Streptococcus)(GBS; 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae(S. agalactiae)로서도 공지되어 있음), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli(E. coli)) 및 클렙시엘라 종(Klebsiella spp)에 의해 야기된다[5-7]. 세균의 수직 전염은 또한 출생 후 발생하는 감염의 원인일 수 있고, 이들 감염의 대부분은 스태필로코커스(Staphylococcus) 종, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae(S. pneumoniae)) 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 종에 의해 야기된다[2,3,7-12].
자궁내 감염은 또한 조산의 중요한 원인이다. 실제로, 임신 32주 미만의 조산의 50 내지 80%는 상승된 세균 감염에 의해 야기된다[9,13-17].
신생아 패혈증에 이용가능한 현재 치료법은 항생제 투여에만 기초한다. 그러나, 분만시 항생제 예방의 실행으로 인하여 GBS 감염이 현저하게 감소하여 왔지만, 사용된 항생제에 대한 숙주 내성의 증가, 및 임신한 사람에서의 이의 미심쩍은 사용은 대안의 예방학적 전략에 대한 요구를 강조한다. 그러나, 신생아 패혈증에 적합한 면역치료요법은 이 시점까지 완전히 망상적이었다.
신생아의 면역계의 고유성(uniqueness)은 상이한 환경에 기초한다. 중요하게도, 출생은, 모체의 자궁에 의해 제공된 거의 멸균인 환경으로부터 "적대적(hostile)" 항원 및 병원체가 풍부한 외부 세계로의 극적인 이동(dramatic passage)을 나타내고, 이에 대해 유아의 면역계는 내성이 되도록 학습할 필요가 있다. 이러한 점에서, 유아의 삶의 첫 달은, 결국 감염의 위험을 증가시킬 수 있는 새로운 항원에 대한 과도한 반응을 제어하기 위한 활성 면역-내성 상태를 특징으로 한다. 한편, 자궁 내에서의 항원에 대한 제한 노출 및 익히-기술되어 있는 신생아 적응 면역(adaptive immunity)의 결함으로 인하여, 신생아는 감염에 대한 보호를 위해 이들의 선천적 면역계에 의존해야만 한다. 실제로, 호중구 감소증(비정상적으로 낮은 수의 호중구를 특징으로 하는 과립구 장애)은 중증의 패혈증과 강하게 관련되어 있다[13,18-23].
호중구 감소증은 일반적으로 신생아 면역계의 미성숙에 의해 설명되지만, 본 발명자들은 이전에 GBS 감염에 대한 신생아 감수성은 세균 챌린지(challenge) 후 신속하게 고량의 면역억제 분자인 인터류킨-10(IL-10)을 생산하는 신생아의 소인에 관련되어 있음을 기술하였다[24]. 본 발명자들의 결과는, IL-10 생산에 의해 야기된 이러한 조기 면역억제가 GBS 감염에서 관찰된 호중구 감소증의 주요 원인이었고, 신생아 면역계의 미성숙은 이의 주요 원인이 아니었음을 입증하였다[24]. 또한, 이들은 이러한 조기 IL-10 생산에 관여하는 세균성 인자로서의 세포외 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH)를 확인하였다[24,25]. 본 발명자들은 모체 백신에 재조합 GAPDH(rGAPDH)를 사용하였고, 이것이 치명적인 GBS 감염에 대해 자손을 보호하는데 매우 효과적임을 밝혔다[24]. 본 발명자들은, 이러한 보호가 또한 GBS GAPDH의 항체 중화에 의해 또는 이의 수용체에 대한 IL-10 결합을 차단함으로써 수득될 수 있음을 밝혔다[24].
흔히 수막구균(meningococcus)으로서도 칭하는 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis(N. meningitidis))는 유아 및 영아에서의 생명을 위협하는 패혈증, 수막염 및 다른 형태의 수막구균성 질환의 주요 원인이지만, 신생아기 동안 좀처럼 발견되지 않는다. 이는 소아 및 청소년에서의 세균성 수막염의 주요 원인이기도 하다. 혈청형 분포는 전 세계에 현저하게 다양하다. 미국에서, 예를 들면, 혈청 그룹 B는 질환 및 사망률의 우세한 원인이고, 이어서, 혈청 그룹 C가 우세하지만; 혈청 그룹 A는 아프리카 및 아시아에서 가장 우세하다. 다중 서브타입들은 수막구균성 질환의 보편적인 백신의 발달을 저해하였지만; 소수의 백신들은 개별 또는 한 경우에 2개의 혈청 그룹에 대해 이용할 수 있다.
신생아, 유아, 영아 및 소아와 마찬가지로, 면역약화된 성인, 예를 들면, 노인도 세균성 감염 및 패혈증에 매우 취약할 수 있다[26]. 폐렴, 균혈증 및 패혈증은 노인에서 매우 흔하고, 이환율 및 사망률의 중요한 원인을 구성한다. 이들 감염은 일반적으로 혼합된, 흔히 혐기성 미생물, 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae), 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus(S. aureus)) 및 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)로 인한 것이지만, 또한 그람-음성 장내 세균(클렙시엘라 뉴모니애(K. pneumoniae) 및 기타 장내세균(Enterobateriaceae)), (병상(bedridden) 환자에서의) 슈도모나스 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 GBS도 원인일 수 있다[26].
따라서, 중환자실(intensive care unit)에서 관찰된 중증의 패혈증 및 패혈성 쇼크와 관련된 사망률은 대략 30%이다[27]. 중요하게도, 면역약화된 환자의 발생률은 지난 20년간 꾸준히 증가하여 왔고[28] 면역결핍증은 중증의 패혈증 및 패혈성 쇼크에 기인한 증가된 사망률과 관련된 것으로 점점 더 자주 확인되는 예후 인자이다[29].
또한, 당뇨병 환자는 스태필로코커스 종 및 GBS에 의해 야기된 침습성 감염에 대한 감수성이 증가되었다[30,31]. 동아시아에서, 당뇨병은 케이. 뉴모니애에 의해 야기된 간 농양에 관한 익히-공지되어 있는 위험 인자이다[32].
따라서, 문헌에서 발견되는 데이터는 이들 환자 그룹에 걸친 패혈증과 지속적으로 관련되어 있는 소수의 미생물 병원체가 존재함을 나타낸다.
본 발명자들은, 이들의 노력을 GAPDH에 집중하면서, 이러한 효소가 모든 관련 패혈증-유도성 세균의 세포외 병독성 인자(virulence factor)임을 입증하였다. 본 발명자들은 그들이 사람보다는 세균성 GAPDH에 대해 특이적인 항체를 유발할 수 있는 GAPDH-유도된 펩타이드의 신규 어레이를 처음으로 동정한 것이라고 생각한다. 본원에 기술되고 완전히 예시되는 바와 같이, 이들 신규한 펩타이드들은 특히 면역약화된 숙주, 예를 들면, 신생아, 유아, 소아, 가임 연령의 여성, 임신한 여성, 태아, 노인 및 당뇨병 환자에서 패혈증-유도성 세균에 의해 야기된 감염성 질환을 예방하기 위한 백신의 생성에 매우 유용하다. 또한, 유발된 항체는 특히 이들 환자 집단에 존재하는 감염을 치료하기 위한 치료학적 제제로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제1 양상에 따르면, 하나 이상의 패혈증-유도성 세균의 GAPDH 내에서 발견된 펩타이드와 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 갖고, 사람 GAPDH 내에서 발견된 펩타이드와 10% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 단리된 펩타이드, 또는 이의 기능성 단편 또는 기능성 변이체가 제공된다.
본 발명자들은 이전 연구로부터 GBS에 의해 야기된 패혈증에 대한 감수성이 세균성 GAPDH와 접촉시 높은 수준의 IL-10을 생산하는 숙주의 경향과 강하게 관련되어 있음을 알고 있었다. 그러나, 본 발명자들은 다른 패혈증-유도성 세균에 대해서도 상기가 사실인 것으로 고려하거나 의심할 이유가 없었다. 실제로, 다른 패혈증-유도성 세균이 GAPDH를 보유하고 있는 것으로 공지되었지만(이 효소는 보편적이기 때문에), 다른 패혈증-유도성 세균으로부터의 GAPDH가, 숙주 세포에 의해 IL-10이 생산되는 것을 야기함은 알려지지 않았거나 예상되지 않았다. 따라서, GAPDH가 모든 관련 패혈증-유도성 세균의 세포외 병독성 인자라는 발명자들에 의한 발견은 완전히 놀라웠다.
또한, 현재 개별적으로 패혈증-유도성 세균 속(genus)의 각각에 의해 야기된 감염에 대해 신생아 및 태아를 효율적으로 보호하는 백신은 존재하지 않는다. 또한, 노인 및 당뇨병 환자와 같은 면역약화된 성인에서 패혈증을 퇴치하기 위해 사용되는 예방학적 또는 치료학적 전략은 전혀 효과적이지 않다. 본원에서 설명된 바와 같이, 항생제는 후기-발병(late-onset) 패혈증의 경우에 항생제가 흔히 너무 늦게 투여되고 패혈증-관련된 이환율을 예방하는데 효과적이지 않기 때문에 문제의 단지 일부만을 해결한다. 또한, 항생제는 자궁내 감염을 예방할 수 없다. 따라서, 제1 양상의 펩타이드, 단편 및 변이체는 특히 이들 환자 집단에 대해 각종 유용하고 더 많이 필요로 하는 백신을 생성시키는데 유의한 유용성을 갖는다.
백신은 감염성 질환에 대한 가장 비용-효율적인 치료이고, 심지어 동일한 백신이 상이한 환자 그룹에서 상이한 사람 병원체에 의해 야기된 감염을 예방할 수 있는 경우에 더욱 효과적이다. 본 발명은 패혈증-유도성 세균, 구체적으로는 GBS, 이. 콜라이, 스태필로코커스 종, 에스. 뉴모니애, 케이. 뉴모니애, 엔. 메닝기티디스 및/또는 슈도모나스 종에 의해 야기된 감염성 질환의 예방, 치료 및 개선에 관한 것이다.
본 발명을 더 잘 이해하고, 이의 실시형태가 어떻게 실시될 수 있는지를 보여주기 위해, 예로서 첨부된 도면을 참조할 것이고, 여기서:
도 1은 주요 패혈증-유도성 세균인 GBS, 이. 콜라이, 에스. 아우레우스, 에스. 뉴모니애, 케이. 뉴모니애, 피. 아에루기노사 및 엔. 메닝기티디스의 GAPDH에 대한 아미노산 서열 정렬을 보여준다. 다중 정렬은 (앞서 명시된 UniProt 등록번호의 FASTA 포맷에 따라) 서열번호 1 내지 서열번호 7로서 본원에서 확인된 아미노산 서열을 제시한 후, ClustalW2 서버로부터 수득하였다. 얻어진 서열 유사성 %을 표 1에 나타낸다.
도 2는 본 발명의 백신에 사용될 수 있는 4개의 표면 펩타이드의 예를 제공한다. 당해 표는 4개의 예시적 펩타이드의 아미노산 서열 및 각각의 아미노산 서열을 갖는 각각의 세균을 나타낸다. 표 아래에 상이한 세균성 GAPDH 내의 동일한 4개의 펩타이드의 표면 국소화를 표시한다. 펩타이드는 본원에서 펩타이드 1 내지 펩타이드 4(서열번호 9 내지 서열번호 12)로서 확인되고, 이들을 병용하여 신생아 백신으로서 본원에서 확인된 백신을 형성한다.
도 3은 에스. 아갈락티애, 에스. 뉴모니애, 에스. 아우레우스 및 사람으로부터의 GAPDH의 아미노산 서열의 정렬을 보여준다. 2개의 박스 영역은 펩타이드 1과 펩타이드 2가 유도된 서열을 보여준다.
도 4 내지 도 6은 신생아 B1 세포가 세균성 GAPDH에 의한 자극시 IL-10의 주요 생산자임을 보여준다. 도 4a 및 도 4b는 간 및 B 세포(전체), 리포폴리사카라이드(LPS), rGAPDH 또는 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI) 배지 단독으로 신생아 마우스의 비장으로부터 정제된 B1 세포 및 B2 세포로부터 유도된 비장 단핵구 세포(MNC), 말초 혈액(PMNC), 대식세포(FLM) 또는 수지상 세포(FLDC)로부터의 호중구의 자극에 따른 IL-10 농도를 나타낸다. 도 5는 TLR2 억제제(OxPAC) 또는 Toll-유사 수용체 4(TLR4) 억제제(CLI095)의 존재 하에 rGAPDH를 갖는 신생아 마우스의 비장으로부터 정제된 B1 세포의 자극 후의 IL-10 농도를 보여준다. 도 6a 및 도 6b는 rGAPDH, 고정된 GBS(GBSf) 또는 RPMI 배지 단독으로 신생 마우스의 비장으로부터 정제된 각각 총 세포 및 B1 세포의 자극 후의 IL-10 농도를 보여준다. 도 6c는, 태아 간 세포로부터 유도된 수지상 세포 및 신생아 비장으로부터 정제된 B1 세포를 rGAPDH, GBSf, I형 인터페론 수용체(αIFNAR)에 특이적인 모노클로날 항체 또는 RPMI 배지 단독과 함께 공동-배양 자극한 후의 IL-10 농도를 보여준다. 도 4 내지 도 6에 대한 모든 패널에 도시된 데이터는 적어도 2회의 독립적인 실험의 평균 + SEM이다.
도 7은 TLR2 결핍이 신생아 생존율을 향상시키고 세균성 패혈증에 대한 보호를 부여함을 보여준다. 에스. 아우레우스 스트레인 NEWMAN(도 7a) 또는 이. 콜라이 스트레인 IHE3034(도 7b)로 챌린지된 신생아 마우스의 생존을 보여준다. 야생형과 TLR2 -/- 마우스 둘 다 연구에 포함되었다. 결과는 적어도 2회의 독립적인 실험으로부터 풀링된 데이터를 나타낸다. 괄호 안의 숫자는 상이한 감염성 챌린지에서 생존한 동물의 수 대 감염된 동물의 총 수를 나타낸다. TLR2-결핍 새끼와 대조군 사이의 통계적 차이(P 값)가 표시된다.
도 8은 IL-10 신호전달의 차단이 신생아를 세균성 패혈증으로부터 보호한다는 것을 보여준다. 마우스 IL-10 수용체(항-IL-10R)에 특이적인 모노클로날 항체 또는 이소타입-매칭된 대조군(isotype-matched control) 항체(이소I형gG/대조군)를 주사한 후, 이. 콜라이 스트레인 IHE3034(도 8a) 또는 에스. 아우레우스 스트레인 NEWMAN(도 8b)으로 챌린지된 신생아 마우스의 생존을 나타낸다. 결과는 3회의 독립적 실험으로부터 풀링된 데이터를 나타낸다. 괄호 안의 숫자는 상이한 감염성 챌린지에서 생존한 동물의 수 대 감염된 동물의 총 수를 나타낸다. 항-IL-10R-처리된 새끼와 대조군 사이의 통계적 차이(P 값)가 표시되어 있다.
도 9는 GAPDH 분비가 공유된 병독성 메커니즘임을 보여준다. 양성 대조군으로서 사용된 rGAPDH는 레인 1에 나타낸다. 레인 2 내지 레인 6은 명시된 병원체(GBS 스트레인인 NEM316)에 대한 등가의 밴드를 보여준다. 데이터는 5회의 독립적인 실험을 대표한다.
도 10은 rGAPDH로 유발된 항체가 GBS 이외의 패혈증-유도성 세균에 의한 감염으로부터 신생 마우스를 보호한다는 것을 보여준다. rGAPDH-유도된 항체(항-rGAPDH IgG) 또는 대조군 항체(대조군 IgG)를 주사한 후, 에스. 뉴모니애 스트레인 Tigr4(패널 A), 이. 콜라이 스트레인 IHE3034(패널 B) 및 에스. 아우레우스 스트레인 NEWMAN(패널 C) 또는 대조군 항체(대조군 IgG)로 챌린지된 마우스 새끼의 생존을 나타낸다. 결과는 2회의 독립적인 실험으로부터 풀링된 데이터를 나타낸다. 괄호 안의 숫자는 감염된 동물의 총 수 대 다양한 감염성 챌린지에서 생존한 동물의 수를 나타낸다. 면역화 대 대조군 그룹 사이의 통계적 차이(P 값)가 표시된다.
도 11은 세균성 GAPDH가 사람 단핵구 세포에서 IL-10 생산을 유도함을 보여준다. 도 11a 및 도 11b는 rGAPDH, TLR2 억제제(TLR2 in) 또는 RPMI 배지 단독으로 제대혈(도 11a) 또는 말초 혈액(도 11b)으로부터 분리된 사람 단핵구 세포의 자극 후의 IL-10 농도를 나타낸다. 도면에 표시된 데이터는 적어도 2회의 독립적인 실험의 평균 + SEM입니다.
도 12는 이. 콜라이 및 사람으로부터의 GAPDH의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다. 박스 영역은 도 2로부터의 펩타이드 3을 보여준다.
도 13은 피. 아에루기노사 및 사람으로부터의 GAPDH의 아미노산 서열의 정렬을 보여준다. 아미노산 23에서의 박스 영역은 본 발명에 사용하기 위한 펩타이드를 보여준다(서열번호 62). 아미노산 59에서의 박스 영역은 도 2로부터의 펩타이드 4를 보여준다.
도 14, 도 15 및 도 16은 본 발명의 백신으로 유발된 항체가 세균성 GAPDH와 반응함을 보여준다. 양성 대조군으로서 사용된 rGAPDH는 각각의 겔의 레인 1에 나타낸다. 도 14에서의 레인 2 내지 6 및 도 15 및 도 16에서의 레인 2는 명시된 병원체에 대해 등가인 밴드를 보여준다. 데이터는 2회의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 17은 신생아 백신으로 유발된 항체가 신생 마우스를 GBS 감염으로부터 보호함을 보여준다. 신생아 백신-유도된 항체(IgG) 또는 대조군 IgG를 주사한 후 GBS NEM316으로 챌린지된 마우스 새끼의 생존을 나타낸다. 결과는 2회의 독립적인 실험들로부터 풀링된 데이터를 나타낸다. 괄호 안의 숫자는 감염된 동물의 총 수 대 다양한 감염성 챌린지에서 생존한 동물의 수를 나타낸다. 면역화 대 대조군 그룹 사이의 통계적 차이(P 값)가 표시된다.
도 18은 신생아 백신으로 유발된 항체가 신생 마우스를 세균성 패혈증으로부터 보호함을 보여준다. 신생아 백신-유도된 항체(IgG) 또는 대조군 IgG를 주사한 후 에스. 뉴모니애 스트레인 Tigr4(도 18a), 이. 콜라이 스트레인 IHE3034(도 18b) 또는 에스. 아우레우스 스트레인 NEWMAN(도 18c)으로 챌린지된 신생 마우스의 생존을 보여준다. 결과는 적어도 2회의 독립적인 실험으로부터 풀링된 데이터를 나타낸다. 괄호 안의 숫자는 상이한 감염성 챌린지에서 생존한 동물의 수 대 감염된 동물의 총 수를 나타낸다. 면역화 대 대조군 사이의 통계적 차이(P 값)가 표시된다.
도 19는 항-GAPDH 항체의 치료학적 사용이 GBS-유도된 패혈증을 효과적으로 치료할 수 있음을 보여준다. GBS NEM316으로 챌린지되고 후속적으로 신생아 백신-유도된 항체(IgG), 대조군 IgG 또는 염수를 투여받은 신생 마우스의 생존을 보여준다. 결과는 2회의 독립적인 실험으로부터 풀링된 데이터를 나타낸다. 괄호 안의 숫자는 감염성 챌린지에서 생존한 동물의 수 대 감염된 동물의 총 수를 나타낸다. 면역화 대 대조군 사이의 통계적 차이(P 값)가 표시된다.
도 20은 신생아 백신으로 유발된 항체가 치사 GBS 감염에 대해 노령의 마우스를 보호함을 보여준다. 신생아 백신-유도된 항체(신생아 백신-IgG) 또는 대조군 IgG('샴-면역화됨')('sham-immunized')를 주사한 후 GBS로 챌린지된 노령의 마우스의 생존을 보여준다. 결과는 2회의 독립적인 실험으로부터 풀링된 데이터를 나타낸다. 괄호 안의 숫자는 감염성 챌린지에서 생존한 동물의 수 대 감염된 동물의 총 수를 나타낸다. 면역화 대 대조군 그룹 사이의 통계적 차이(P 값)가 표시된다.
도 21은 신생아 백신으로 유발된 항체가 치사 GBS 감염에 대해 비-비만(non-obese) 당뇨병(NOD) 마우스를 보호함을 보여준다. 신생아 백신-유도된 항체(신생아 백신-IgG) 또는 대조군 IgG('샴-면역화됨')를 주사한 후 GBS로 챌린지된 NOD 마우스의 생존을 보여준다. 결과는 2회의 독립적인 실험으로부터 풀링된 데이터를 나타낸다. 괄호 안의 숫자는 감염성 챌린지에서 생존한 동물의 수 대 감염된 동물의 총 수를 나타낸다. 면역화 대 대조군 그룹 사이의 통계적 차이(P 값)가 표시된다.
본원에 기술된 본 발명은 세균성 패혈증에 대한 감수성이 모든 패혈증-유도성 세균에 대해 세균성 GAPDH와 접촉시 높은 수준의 IL-10을 생산하는 숙주의 경향과 강하게 관련되어 있다는 본 발명자들의 놀라운 발견에 기초한다.
패혈증에 대한 감수성은 상이한 위험 그룹에서 매우 빈번하다. 그럼에도 불구하고, 패혈증과 관련되어 있는 미생물 병원체는 감수성 숙주의 상이한 그룹에 고도로 보존되어 있다. 사람에서 패혈증과 가장 관련되어 있는 세균은 GBS, 이. 콜라이, 스태필로코커스 종, 에스. 뉴모니애, 케이. 뉴모니애, 슈도모나스 종 및/또는 엔. 메닝기티디스이고, 본 발명자들은 놀랍게도 이들 세균 모두가 GAPDH를 분비한다는 것을 발견하였다.
이와 같이, 패혈증-유도성 세균은 바람직하게는 GBS, 이. 콜라이, 스태필로코커스 종, 에스. 뉴모니애, 케이. 뉴모니애, 및 슈도모나스 종 및 엔. 메닝기티디스로 이루어진 세균 그룹으로부터 선택될 수 있다. 한 실시형태에서, 스태필로코커스 종은 에스. 아우레우스이다. 다른 실시형태에서, 슈도모나스 종은 슈도모나스 아에루기노사(피. 아에루기노사)이다. 다른 실시형태에서, 엔. 메닝기티디스는 엔. 메닝기티디스 혈청형 b(MenB)이다. 한 실시형태에서, 패혈증-유도성 세균은 GBS가 아니다.
GBS, 이. 콜라이, 에스. 아우레우스, 에스. 뉴모니애, 케이. 뉴모니애, 피. 아에루기노사 및 MenB(스트레인 MC58)로부터의 GAPDH의 아미노산 서열은 각각 본원에서 서열번호 1 내지 서열번호 7로서 확인된다.
GBS로부터의 GAPDH의 아미노산 서열(UniProt 등록번호 제Q8E3E8호)은 본원에서 하기와 같은 서열번호 1로서 확인된다:
Figure pat00001
이. 콜라이로부터의 GAPDH의 아미노산 서열(UniProt 등록번호 제D5D2F1호)은 본원에서 하기와 같은 서열번호 2로서 확인된다:
Figure pat00002
에스. 아우레우스로부터의 GAPDH의 아미노산 서열(UniProt 등록번호 제A6QF81호)은 본원에서 하기와 같은 서열번호 3으로서 확인된다:
Figure pat00003
에스. 아우레우스로부터의 GAPDH의 서열만이 본원에 제공되지만, 스태필로코커스 종으로부터의 입수가능한 GAPDH 서열은 모두 98% 초과의 서열 유사성을 갖는다.
에스. 뉴모니애로부터의 GAPDH의 아미노산 서열(UniProt 등록번호 제Q97NL1호)은 본원에서 하기와 같은 서열번호 4로서 확인된다:
Figure pat00004
케이. 뉴모니애로부터의 GAPDH의 아미노산 서열(UniProt 등록번호 제B5XRGo호)은 본원에서 하기와 같은 서열번호 5로서 확인된다:
Figure pat00005
피. 아에루기노사로부터의 GAPDH의 아미노산 서열(UniProt 등록번호 제P27726호)은 본원에서 하기와 같은 서열번호 6으로서 확인된다:
Figure pat00006
피. 아에루기노사로부터의 GAPDH의 서열만이 본원에 제공되지만, 슈도모나스 종으로부터의 입수가능한 GAPDH 서열은 모두 98% 초과의 서열 유사성을 갖는다.
MenB(스트레인 MC58)로부터의 GAPDH의 아미노산 서열(UniProt 등록번호 제Q9JX95호)은 본원에서 하기와 같은 서열번호 7로서 확인된다:
Figure pat00007
MenB(스트레인 MC58)로부터의 GAPDH의 서열만이 본원에 제공되지만, 엔. 메닝기티디스의 상이한 혈청형으로부터의 입수가능한 GAPDH 서열은 모두 97.668%의 서열 유사성을 갖는다(http://www.uniprot.org/align/A20150610146R8 0D4XR).
GAPDH 단백질의 생화학적 특징, 효소적 활성 및 표면 국소화(localisation)는 GBS에 대해 기술되어 왔다[33]. 세포외 국소화는 또한 이. 콜라이[34-36], 에스. 아우레우스[37-39], 및 에스. 뉴모니애[40]로부터의 GAPDH에 대해서도 기술되어 왔다. 본 발명자들은 이들이 피. 아에루기노사 및 엔. 메닝기티디스 GAPDH의 세포외 존재를 지적한 최초의 저자인 것으로 생각한다.
GAPDH는 모든 세포 유형 내에 존재하는, 에너지 대사와 관련된 세포계통적으로(phylogenetically) 보존된 단백질이다. 미생물 GAPDH는 사람 GAPDH와 대략 30 내지 40%의 서열 동일성을 갖는다. 사람 GAPDH의 아미노산 서열(UniProt 등록번호 제P04406호)은 본원에서 하기와 같은 서열번호 8로서 확인된다:
Figure pat00008
놀랍게도, 세균성 GAPDH는 이들의 아미노산 서열의 60%까지 공유하고, 본 발명자들은 더욱 놀랍게도 본원에서 본원에 기술되는 바람직한 패혈증-유도성 세균(즉, GBS, 이. 콜라이, 스태필로코커스 종, 에스. 뉴모니애, 케이. 뉴모니애, 슈도모나스 종 및 엔. 메닝기티디스)으로부터의 GAPDH는 특히 높은 정도의 서열 동일성을 갖는다는 것을 입증하였다(실시예 7 참조). 하기 표 1은 (이전에 나타낸 UniProt 등록 번호의 FASTA 포맷에 따른) 서열번호 1 내지 서열번호 7로서 본원에서 확인되는 아미노산 서열을 입력한 후 ClutalW2 서버로부터 얻어진 다중 정렬 및 서열 유사성 백분율을 제공한다. 서열 정렬은 또한 도 1에 나타낸다.
Figure pat00009
따라서, 바람직한 실시형태에서, 제1 양상의 펩타이드는 하나 이상의 패혈증-유도성 세균의 GAPDH 내에서 발견되는 펩타이드와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
따라서, 바람직하게는 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 7로서 확인되는 GAPDH 서열들 중 하나 이상 내에서 발견되는 펩타이드와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 심지어 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
예를 들면, 한 바람직한 실시형태에서, 제1 양상의 펩타이드는 서열번호 1에서 발견되는 펩타이드(즉, GBS로부터의 GAPDH)와 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 제1 양상의 펩타이드는 서열번호 2에서 발견되는 펩타이드(이. 콜라이로부터의 GAPDH)와 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 펩타이드는 서열번호 4에서 발견되는 펩타이드(즉, 에스. 뉴모니애로부터의 GAPDH)와 적어도 98%의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 펩타이드는 서열번호 1에서 발견되는 펩타이드(즉, GBS로부터의 GAPDH)와 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성, 서열번호 4에서 발견되는 펩타이드(즉, 에스. 뉴모니애로부터의 GAPDH)와 적어도 98%의 아미노산 서열 동일성, 및 서열번호 6에서 발견되는 펩타이드(즉, 슈도모나스 종으로부터의 GAPDH)와 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성 등을 가질 수 있다. 본원에 기술되는 가능한 서열 동일성과 가능한 패혈증-유도성 세균의 임의의 조합이 예상되고, 이는 본 발명의 일부를 구성함이 이해될 것이다.
본 발명자들은, 놀랍게도 GAPDH가 패혈증-유도성 세균들 사이에서 고도로 보존됨을 발견하면서, 세균성 GAPDH에 공통이지만 사람 GAPDH에는 존재하지 않는 다수의 펩타이드 서열을 확인하였다(표현 "에 공통"은 정렬된 세균 서열로부터 유래되는 컨센서스 아미노산 서열을 포함할 수 있다). 이들 공통적 펩타이드 서열의 4개의 바람직한 예는 본원에 서열번호 9 내지 서열번호 12로서 확인된다. 서열번호 9 내지 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 본원에 각각 "펩타이드 1 내지 펩타이드 4"로서 나타내고, 이들은 하기 표 2에 나타낸다.
GAPDH로부터 유도된 펩타이드 1의 아미노산 서열(즉, 공통 서열 1)은 본원에서 하기와 같은 서열번호 9로서 확인된다:
Figure pat00010
GAPDH로부터 유도된 펩타이드 2의 아미노산 서열(즉, 공통 서열 2)은 본원에서 하기와 같은 서열번호 10으로서 확인된다:
Figure pat00011
GAPDH로부터 유도된 펩타이드 3의 아미노산 서열(즉, 공통 서열 3)은 본원에서 하기와 같은 서열번호 11로서 확인된다:
Figure pat00012
GAPDH로부터 유도된 펩타이드 4의 아미노산 서열(즉, 공통 서열 4)은 본원에서 하기와 같은 서열번호 12로서 확인된다:
Figure pat00013
Figure pat00014
실례로서, GBS, 에스. 아우레우스 및 에스. 뉴모니애로부터의 GADPH에서 발견되는 천연 서열로부터의 펩타이드 1 및 펩타이드 2의 유도 및 동일한 서열이 사람의 GAPDH에 존재하지 않는다는 사실이 도 2 및 도 3에 도시되어 있다. 펩타이드 3 및 펩타이드 4는 또한 도 2 및/또는 도 3에서 확인되는 바와 같이 이. 콜라이, 케이. 뉴모니애 및/또는 피. 아에루기노사로부터의 GADPH에서 발견되는 천연 서열로부터 유도되었다.
따라서, 본 발명에 따른 각각의 펩타이드의 아미노산 서열은 패혈증-유도성 세균에서 발견되는 것과 동일한 것일 수 있거나, 이는 다를 수 있다. 그러나, 이것이 다른 경우, 바람직하게 상기 펩타이드는, 패혈증-유도성 세균 GAPDH에 대해서는 실질적으로 컨센서스 서열이지만 사람 GAPDH에 대해서는 그렇지 않은 아미노산 서열을 갖는다.
따라서, 한 바람직한 실시형태에서, 제1 양상의 펩타이드는 실질적으로 서열번호 9 내지 서열번호 12 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
상이한 패혈증-유도성 세균으로부터의 GAPDH는, 백신으로서 사용하기 위해, 본 발명에 따른 펩타이드를 생성하는데 사용될 수 있는 서열번호 9 내지 서열번호 12로 확인되는 것들 이외에 추가의 컨센서스 서열을 보유하는 것으로 예상된다. 상기 펩타이드는 임의의 서열을 가질 수 있지만, 상기 서열은 사람에서 GAPDH에 의해 실질적으로 공유되지 않아야만 한다.
대안으로, 패혈증-유도성 세균으로부터의 GAPDH의 천연 아미노산 서열이 본 발명의 펩타이드를 생성하는데 사용될 수 있다. 표 3은, 적어도 명시된 세균을 표적화하는데 본 발명의 백신에 사용될 수 있는 명시된 세균의 GAPDH로부터 취한 추정 펩타이드 서열을 나타낸다. 펩타이드는, 각각의 세균성 GAPDH 아미노산 서열을 사람 GAPDH(ClustalW2 서버, 육안 검사 및 선별)와 개별적으로 정렬시킨 후, 사람 GAPDH 이소형과 공통 서열 유사성을 공유하지 않는 세균성 GAPDH 펩타이드로서 동정되었다. 이들 펩타이드는 세균의 표면 펩타이드들 중에서 발견될 수 있는 다수의 GAPDH 펩타이드들의 예로서, 본 발명의 백신을 생성하는데 사용된다. 천연 서열 내의 임의의 펩타이드 서열이 사용될 수 있지만, 상기 서열은 사람에서 GAPDH에 의해 실질적으로 공유되지 않아야만 한다.
Figure pat00015
Figure pat00016
따라서, 다른 바람직한 실시형태에서, 제1 양상의 펩타이드는 실질적으로 서열번호 13 내지 서열번호 69 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
적합하게는, 제1 양상의 펩타이드는 150개 이하의 아미노산을 포함한다. 예를 들면, 상기 펩타이드는 바람직하게는 100개 미만의 아미노산, 그리고 보다 바람직하게는 50개 미만의 아미노산을 포함한다. 보다 더 바람직하게, 상기 펩타이드는 30개 미만의 아미노산을 포함하고, 가장 바람직하게는 20개 미만의 아미노산을 포함한다. 적합하게는, 본 발명의 펩타이드는 적어도 3개의 아미노산을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 펩타이드는 적어도 5개의 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 8개의 아미노산, 그리고 보다 더 바람직하게는 적어도 10개의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 펩타이드는 상기 범위 내에서의 임의의 길이일 수 있지만, 전형적으로 5 내지 100개의 아미노산 길이이고, 바람직하게는 5 내지 50개의 아미노산 길이이고, 가장 바람직하게는 10 내지 20개의 아미노산 길이일 것이다.
적합하게는, 본 발명의 펩타이드는 각각의 세균성 GAPDH의 표면에 위치해야만 하고, 전체 단백질 내에 이들이 보유한 것과 유사한 3D 구조(입체 구조(conformation))를 나타내야만 한다.
본 발명의 펩타이드는 재조합 수단을 통한 것을 포함하여 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 수단에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, GBS로부터의 rGAPDH(전체 단백질)의 생산은 이전에 기술되었다[41]. 원하는 펩타이드가 유사한 방식으로 생산될 수 있다. GBS 이외의 세균에서의 GAPDH(전체 단백질 또는 펩타이드)의 재조합 생산 또한 본 발명의 일부로서 고려된다. 대안으로, 펩타이드는 단백질 절단에 의해 수득되거나 당해 분야에 익히 공지되어 있는 기술(예를 들면, 고체-상 또는 액체-상 합성)을 이용하여 새롭게 합성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자(nucleic molecule)로 확장된다.
따라서, 본 발명의 제2 양상에 따르면, 제1 양상에 따른 펩타이드 또는 이의 기능성 단편 또는 기능성 변이체를 암호화하는 단리된 핵산이 제공된다.
당해 분야의 숙련된 연구자는 제1 양상에 따른 펩타이드, 또는 이의 기능성 단편 또는 기능성 변이체를 암호화하는 적합한 핵산 서열을 용이하게 확인할 수 있을 것이다. 당해 분야 숙련가는 당해 분야의 기존 지식 및/또는 공개된 문헌(예를 들면, 재조합 GAPH를 작제하고 정제하는데 유용한 방법을 기술하는 [25]를 참조한다)에 제공되는 관련 기술 세부사항에 기초하여 본 발명의 이러한 양상을 용이하게 수행할 수 있을 것이다.
한 실시형태에서, 상기 단리된 핵산은 재조합 또는 합성이다. 한 실시형태에서, 상기 단리된 핵산은 제1 양상에 따른 펩타이드, 또는 이의 기능성 단편 또는 기능성 변이체를 암호화하는 cDNA 분자이다. 한 실시형태에서, 상기 단리된 핵산은 예를 들면, 공지의 변형된 뉴클레오타이드의 포함을 통해 화학적으로 변형된다. 한 실시형태에서, 상기 단리된 핵산은 이종 프로모터에 작동가능하게 링크된다. 한 실시형태에서, 상기 단리된 핵산은 기질 또는 표지 등에 결합된다. 이러한 변형은 당해 분야에서 일반적이고 당해 분야 숙련가에게 공지될 것이다.
제3 양상에서, 제2 양상에 따른 핵산을 포함하는 유전적 작제물이 제공된다.
본 발명의 유전적 작제물은 발현 카세트의 형태로 존재할 수 있고, 이는 숙주 세포에서의 암호화된 펩타이드의 발현에 적합할 수 있다. 유전자 작제물은 벡터에 혼입되지 않고 숙주 세포에 도입될 수 있다. 예를 들면, 핵산 분자일 수 있는 유전자 작제물은 리포솜 또는 바이러스 입자 내에 혼입될 수 있다. 대안으로, 정제된 핵산 분자(예를 들면, 히스톤-불포함 DNA 또는 네이키드(naked) DNA)는 적합한 수단, 예를 들면, 직접적 세포내이입 흡수(endocytotic uptake)에 의해 숙주 세포에 직접 삽입될 수 있다. 유전적 작제물은 형질감염, 감염, 전기천공, 미세 주사, 세포 융합, 원형질체 융합 또는 탄도 충격(ballistic bombardment)에 의해 숙주 대상체의 세포(예를 들면, 세균 세포)에 직접적으로 도입될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 유전적 작제물은 입자 총(particle gun)을 사용하여 숙주 세포에 직접적으로 도입될 수 있다. 대안으로, 적합한 숙주 세포에서의 발현을 위해 재조합 벡터 내에 유전적 작제물을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 제4 양상에서, 제3 양상에 따른 유전적 작제물을 포함하는 재조합 벡터가 제공된다.
재조합 벡터는 플라스미드, 코스미드(cosmid) 또는 파지(phage)일 수 있다. 이러한 재조합 벡터는 숙주 세포를 제5 양상의 유전적 작제물로 형질감염시키는데 그리고 그 안에서 발현 카세트를 복제하는데 유용하다. 숙련된 기술자는 본 발명의 유전적 작제물이 발현 목적을 위해 많은 유형의 백본(backbone) 벡터와 결합될 수 있음을 이해할 것이다. 재조합 벡터는 유전자 발현을 개시하기에 적합한 프로모터를 포함하는 다양한 다른 기능성 요소들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 재조합 벡터는 숙주 세포의 세포질에서 자체적으로 복제되도록 고안될 수 있다. 이 경우, DNA 복제를 유도하거나 조절하는 요소가 재조합 벡터에 요구될 수 있다. 대안으로, 재조합 벡터는 숙주 세포의 게놈에 통합되도록 고안될 수 있다. (예를 들면, 상동성 재조합에 의한) 표적화된 통합을 선호하는 DNA 서열이 사용될 수 있다.
재조합 벡터는 또한 클로닝 프로세스에서 선택가능한 마커로서 사용될 수 있는 유전자, 즉, 형질감염되거나 형질전환된 세포의 선택을 가능하게 하고 이종 DNA가 혼입된 벡터를 보유하는 세포의 선택을 가능하게 하는 유전자를 암호화하는 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들면, 클로람페니콜 내성이 예상된다. 대안으로, 선택가능한 마커 유전자는 목적하는 유전자를 함유하는 벡터와 동시에 사용될 상이한 벡터 내에 존재할 수 있다. 벡터는 암호화 서열의 발현을 조절하거나 또는 발현된 펩타이드를 숙주 세포의 소정 부분에 표적화하는데 관여하는 DNA를 포함할 수도 있다.
따라서, 제5 양상에서, 제3 양상에 따른 유전적 작제물 또는 제4 양상에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
숙주 세포는 세균 세포, 예를 들면, 이. 콜라이일 수 있다. 대안으로, 숙주 세포는 동물 세포, 예를 들면, 마우스 또는 래트 세포일 수 있다. 숙주 세포는 사람 세포가 아닌 것이 바람직하다. 숙주 세포는 공지의 기술을 이용하여 본 발명에 따른 유전적 작제물 또는 벡터로 형질전환될 수 있다. 숙주 세포에 유전적 작제물을 도입하기에 적합한 수단은 세포의 유형에 의존할 것이다.
제6 양상에서, 제5 양상에 따른 적어도 하나의 숙주 세포를 포함하는 유전자전이 숙주 유기체가 제공된다.
본 발명의 숙주 세포 또는 유전자전이 숙주 유기체의 게놈은 제1 양상에 따른 펩타이드, 변이체 또는 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 숙주 유기체는 바람직하게는 비-사람인 다세포 유기체일 수 있다. 예를 들면, 숙주 유기체는 마우스 또는 래트일 수 있다. 숙주는 세균일 수 있다. 숙주는, 패혈증-유도성 세균, 예를 들면, GBS, 이. 콜라이, 스태필로코커스 종, 에스. 뉴모니애, 케이. 뉴모니애, 엔. 멩기니티디스 및/또는 슈도모나스 종으로의 감염에 대해 대상체를 면역화하기 위한 백신 개발에 사용될 수 있다. 실제로, 본원에 기술되는 상이한 패혈증-유도성 세균으로부터의 GAPDH의 아미노산 서열의 지식은 백신 개발에 이용될 수 있다.
본원에 기술되는 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 GAPDH가 신생아 패혈증 및 노인 및 당뇨병 환자에서의 패혈증과 관련된 가장 유해한 세균의 세포외 병독성 인자임을 발견하였다. 본 발명자들은 놀랍게도 세균성 GAPDH가 숙주에서 감염시 매우 초기에 IL-10의 생산을 유도하고, 이들 병원체는 숙주 면역 시스템으로부터의 도피(escape)의 형태로서 GAPDH 분비를 이용하고 있음을 밝혔다(실시예 5 및 실시예 6을 참조한다).
본 발명자들은 놀랍게도 GAPDH가 Toll-유사 수용체 2(TLR2)와의 상호작용을 통해 면역 세포에 작용함을 발견하였다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 세균성 GAPDH가 B1 림프구의 표면 상의 TLR2와 결합하여 이들 세포에 의한 IL-10 생산을 유도할 수 있음을 발견하였다(실시예 1 및 실시예 2를 참조한다). 본 발명자들은 B1 세포가 GAPDH 자극시 IL-10의 주요 생산자임을 발견하였다.
본 발명자들은 TLR2-매개된 IL-10 생산이 GBS에 의해 야기된 신생아 패혈증의 병태생리학에서 주요 역할을 한다는 것을 이들의 이전 연구에서 인지하고 있었지만[42], 이 활성이 GAPDH에 의해 유발된다는 것은 놀라웠다. 문헌[43,44]에 따르면, TLR2가 세균-관련 지단백질을 인식하는 것으로 예상되었다. 따라서, 본 발명자들은 TLR2-매개된 IL-10 생산이 GBS 지단백질과 연관되어 있었던 것으로 항상 가정했다. 따라서, 세균성 GAPDH가 또한 TLR2에 결합하여 IL-10 생산을 유도하는 신호전달 캐스케이드(cascade)에 관여할 수 있음을 발견하는 것은 놀라웠다. GAPDH가 공유된 병독성 인자라는 상기 언급된 놀라운 발견을 고려하면, 이 활성이 GBS 이외의 패혈증-유도성 세균에 의해 공유된다는 것도 매우 놀랍다(실시예 3을 참조한다).
대식세포와 같은 다른 백혈구도 B1 세포보다 더 적지만 세균성 GAPDH 인식시 IL-10을 생산하는 것이 발견되었다. 또한, 본 발명자들은 놀랍게도 B1 세포에 의한 GAPDH-유도된(즉, TLR2-매개된) IL-10 생산이 수지상 세포 또는 대식세포에 의해 생산된 I 형 인터페론의 존재 하에 유의하게 증강되고, 이는 이들 세포에 의해 세균 항원의 인식 후에 발생함을 발견하였다(실시예 4를 참조한다). 이는 세균 구조적 항원과 분비된 생성물이 상승작용적으로 작용하여 숙주 면역억제를 유도하는 완전히 새로운 병독성 메커니즘을 나타낸다.
본 발명자들은 또한 신생아가 세균성 GAPDH의 존재 하에 상승된 양의 IL-10을 생산하는 경향이 이들 감염에 대한 신생아의 증가된 감수성에 관한 이유임을 발견하였고; 이는 GBS에 대해 공지되어 있지만[24], 다른 패혈증-유도성 세균에 대해서는 공지되어 있지 않았거나 예상되지 않았다(실시예 5를 참조한다). 노인 및 당뇨병 환자와 같은 면역약화된 성인도 세균성 GAPDH의 중화에 의해 패혈증으로부터 보호되고, 이는 신생아에서 관찰된 동일한 메커니즘이 이들 그룹에도 적용된다는 것을 의미한다(실시예 12 및 실시예 13을 참조한다). 또한, 본 발명자들은, 세균성 GAPDH가 사람 제대혈 및 성인 백혈구에서 IL-10의 강력한 유도제이기도 하고, 이는 마우스에서 관찰된 동일한 메커니즘이 사람 개체로 전임됨을 입증한다(실시예 6을 참조한다).
본 발명자들은 이들의 연구에서 주요 패혈증-유도성 세균을 연구하였고, 이들은 임의의 다른 패혈증-유도성 세균에서 동일한 결과가 관찰될 것이라고 가정한다. 이를 고려하여, 본 발명자들은 면역약화된 숙주, 예를 들면, 특히, 신생아, 유아, 소아, 가임 연령의 여성, 임신한 여성, 태아, 노인 및 당뇨병 환자에서의 패혈증-유도성 세균에 의해 야기된 감염성 질환을 예방하기 위한 GAPDH-기반 백신을 개발하였다.
따라서, 본 발명의 제7 양상에 따르면, 패혈증-유도성 세균으로의 감염을 예방하기 위한 백신 개발시, 제1 양상에 따른 펩타이드, 단편 또는 변이체의 용도가 제공된다.
패혈증-유도성 세균은 GBS, 이. 콜라이, 스태필로코커스 종, 에스. 뉴모니애, 케이. 뉴모니애, 슈도모나스 종, 및 엔. 메닝기티디스로 이루어진 세균의 그룹으로부터 바람직하게 선택될 수 있다. 한 실시형태에서, 스태필로코커스 종은 에스. 아우레우스이다. 다른 실시형태에서, 슈도모나스 종은 피. 아에루기노사이다. 다른 실시형태에서, 엔. 메닝기티디스는 MenB이다. 한 실시형태에서, 패혈증-유도성 세균은 GBS가 아니다.
제8 양상에서, 제1 양상에 따른 펩타이드, 단편 또는 변이체를 포함하는 백신이 제공된다.
GAPDH는 사람에게도 존재하는 단백질이므로, 전체 세균성 GAPDH 단백질로 구성된 백신은 자가면역 병리학을 일으킬 수 있다. 유리하게, 그리고 실시예 8 내지 실시예 10에 예시된 바와 같이, 제1 양상의 펩타이드가 백신으로서 사용되는 경우, 이는 자가면역 병리학을 회피하면서 동시에 본원에 기술된 임의의 패혈증-유도성 세균으로부터의 GAPDH에 대한 강한 항체 반응을 초래한다. 실제로, 이러한 펩타이드의 사용은 각각의 세균성 GAPDH에 대한 백신의 특이성을 증가시키는 것으로 생각되고, 이는 결국 각각의 세균에 대해 제공되는 보호를 증가시킨다. 상기 기술한 바와 같이(표 1의 서열 비교를 참조한다), 일부 경우, 상이한 세균으로부터의 GAPDH 사이의 서열 유사성의 정도는 그다지 높지 않다. 상이한 펩타이드들을 사용함으로써, 임의의 세균성 GAPDH에 대한 특이적 면역 반응이 보장될 수 있다. 이것은, 단일 GAPDH(전체 단백질)를 백신으로 사용해서는, 불가능할 것이다. 따라서, 놀랍게도, 본 발명자들은, 자가면역 병리학을 야기하지 않으면서 GAPDH-유도된 백신을 필요로 하는 대상체에게 GAPDH-유도된 백신을 투여할 수 있는 방법을 발견하였다. 특히 신생아에 관해서, 신생아 B1 세포는 신생아의 총 비장 세포의 대략 30%를 나타낸다. 반면, 성인 B1 세포는 전체 비장 세포의 1 내지 5%에 상당한다[45]. 본 발명자들에 의해 패혈증에 대한 신생아 감수성에서의 세균성 GAPDH의 역할을 강화하는 것으로 생각된다.
제8 양상의(또는 제7 양상에서 전개된 바와 같은) 백신은 본원에 기술되거나 예상된 상이한 펩타이드들, 또는 이들의 단편 또는 변이체 중 임의의 것을 임의의 조합 및 임의의 수로 포함할 수 있다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 백신은 본원에 기술된 단지 하나의 유형의 펩타이드(예를 들면, 서열번호 9)를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 백신은 임의의 2개(예를 들면, 서열번호 9 및 서열번호 10), 3개(예를 들면, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11), 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 본원에 기술되거나 예상된 펩타이드, 및 이의 단편 또는 변이체 등을 포함할 수 있다. 상이한 펩타이드, 또는 이의 단편 또는 변이체의 임의의 조합이 구상되어 본 발명의 일부를 형성한다.
한 바람직한 실시형태에서, 백신은 표 2에 나타낸(즉, 서열번호 9 내지 서열번호 12를 갖는) 펩타이드들, 또는 이들의 단편 또는 변이체 중 하나 이상을 포함한다. 백신은 임의의 1개의 펩타이드, 임의의 2개의 펩타이드들, 임의의 3개의 펩타이드들 또는 실제로 전부 4개의 펩타이드들, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다.
다른 바람직한 실시형태에서, 백신은 표 3에 나타낸(즉, 서열번호 13 내지 서열번호 69를 갖는) 펩타이드들, 또는 이들의 단편 또는 변이체 중 하나 이상을 포함한다. 따라서, 백신은 펩타이드들 중 임의의 하나, 또는 펩타이드들 중 임의의 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 백신은 표 2에 나타낸(즉, 서열번호 9 내지 서열번호 12를 갖는) 펩타이드들 중 하나 이상 및 표 3에 나타낸(즉, 서열번호 13 내지 서열번호 69를 갖는) 펩타이드들 중 하나 이상, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함한다. 백신은 펩타이드들 중 임의의 하나, 또는 펩타이드들 중 임의의 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다.
가장 바람직한 실시형태에서, 백신은 표 2에 나타낸(서열번호 9 내지 서열번호 12를 갖는) 전부 4개의 펩타이드들, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함한다. 단지 편의를 위해서, 그리고 임의의 방식으로 제한되도록 구성되지 않으면서, 이들 4개의 펩타이드들의 조합을 포함하는 백신은 이후에 신생아 백신(Neonatal Vaccine)으로서 나타낼 것이다. 신생아 백신의 명칭은 특히 신생아를 언급하지만, 신생아 백신은 본원에 기술된 임의의 환자 집단에서 그리고 본원에 기술된 임의의 질환, 장애 또는 병태에 대해 사용하기 위한 것으로 의도된다. 이와 관련하여, 조산 및 사산은 세균 감염에 의해 유도된 악화된 염증성 반응에 의해 야기될 수 있다. 세균-유도된 조산 및 사산의 경우에, 가장 일반적인 제제(agent)는 GBS, 이. 콜라이 및 케이. 뉴모니애, 즉, 본원에 기술된 패혈증-유도성 세균이다.
본원에 기술된 바와 같은 백신에서, 펩타이드, 이의 단편 또는 변이체는 함께 링크되어 보다 큰 펩타이드(또는 소형 단백질)를 형성한다. 한 실시형태에서, 2개 이상의 상이한 펩타이드들(또는 단편 또는 변이체)은 함께 링크된다. 다른 실시형태에서, 동일한 펩타이드(또는 단편 또는 변이체)의 2개 이상의 카피는 함께 링크된다. 결합은 직접적일 수 있거나(즉, 링크되는 펩타이드, 단편 또는 변이체 사이에 아미노산을 갖지 않거나), 간접적일 수 있다(즉, 링크되는 펩타이드, 단편 또는 변이체 사이에 1개 이상의 아미노산을 갖고, 따라서, '스페이서'로서 작용할 수 있다). 기술된 펩타이드(또는 단편 또는 변이체) 중 하나 이상의 패턴이 반복되어 보다 큰 펩타이드/소형 단백질을 형성할 수 있다. 반복은 소위 직렬 반복(tandem repeat)으로 서로 직접적으로 인접할 수 있거나, 각각의 경우에 하나 이상의 아미노산에 의해 이격될(spaced) 수 있다. 대안으로, 링크된 펩타이드, 단편 또는 변이체는 무작위 순서로 나타날 수 있다. 또한, 상기 배열의 임의의 조합 및 모든 조합도 예상되고 본 발명의 일부를 형성한다. 예를 들면, 동일한 펩타이드, 단편 또는 변이체의 2개 이상의 카피 및 2개 이상의 상이한 펩타이드, 단편 또는 변이체를 함께 패턴, 무작위 순서 또는 이 둘의 조합으로 링크함으로써 보다 큰 펩타이드를 형성할 수 있다.
따라서, 바람직한 실시형태에서, 백신은 단지 한 유형의 본원에 기술된 펩타이드, 단편 또는 변이체(예를 들면, 서열번호 9)를 포함할 수 있지만, 이 유형의 2개 이상의 링크된 카피를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 백신은 바로 위에 기술된 배열들 중 임의의 배열에, 기술된 펩타이드, 단편 또는 변이체의 임의의 2개(예를 들면, 서열번호 9 및 서열번호 10), 3개(예를 들면, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11), 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 링크된 카피를 포함할 수 있다.
한 바람직한 실시형태에서, 백신은 표 2에 나타낸(즉, 서열번호 9 내지 서열번호 12를 갖는) 펩타이드들, 또는 이들의 단편 또는 변이체의 하나 이상의 링크된 카피를 포함한다. 백신은, 본원에 기술된 임의의 링크 배열에, 임의의 1개의 펩타이드, 임의의 2개의 펩타이드들, 임의의 3개의 펩타이드들, 또는 실제로 전부 4개의 펩타이드들, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다.
다른 바람직한 실시형태에서, 백신은 표 3에 나타낸(즉, 서열번호 13 내지 서열번호 69를 갖는) 펩타이드들, 또는 이들의 단편 또는 변이체의 하나 이상의 링크된 카피를 포함한다. 따라서, 백신은, 본원에 기술된 임의의 링크 배열에, 펩타이드들 중 임의의 하나, 또는 펩타이드들 중 임의의 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 백신은, 본원에 기술된 임의의 링크 배열에, 표 2에 나타낸(즉, 서열번호 9 내지 서열번호 12를 갖는) 펩타이드들 중 하나 이상 및 표 3에 나타낸(즉, 서열번호 13 내지 서열번호 69를 갖는) 펩타이드들 중 하나 이상, 또는 이들의 단편 또는 변이체을 포함한다. 백신은, 본원에 기술된 임의의 링크 배열에, 펩타이드들 중 임의의 하나, 또는 펩타이드들 중 임의의 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다.
가장 바람직한 실시형태에서, 백신은 신생아 백신이고, 즉, 본원에 기술된 임의의 링크 배열에, 표 2에 나타낸(즉, 서열번호 9 내지 서열번호 12를 갖는) 전부 4개의 펩타이드들, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함한다.
따라서, 제8 양상의(또는 제7 양상에서 개발된 바와 같은) 백신은 제1 양상의 임의의 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 펩타이드들, 단편 또는 변이체를 포함할 수 있고, 여기서, 펩타이드, 단편 및/또는 변이체 중 적어도 2개는 함께 링크된다. 펩타이드, 단편 또는 변이체 중 임의의 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상은 이러한 관점에서 함께 링크될 수 있다.
본 발명자들은 놀랍게도 패혈증-유도성 세균의 GAPDH로부터 유도된 펩타이드 및 이들 펩타이드를 포함하는 백신이 보호 항체 반응을 유발할 수 있음을 관찰하였다. 특히, 상기 펩타이드들에 대해 생성된 항체는 패혈증-유도성 세균의 GAPDH를 특이적으로 인식하고 중화시킬 수 있다.
따라서, 제9 양상에서는, 면역 반응을 자극하기 위한, 제1 양상에 따른 펩타이드, 단편 또는 변이체, 또는 제8 양상에 따른 백신의 용도가 제공된다.
바람직하게, 면역 반응은 1종 이상의 패혈증-유도성 세균의 GAPDH에 대해 특이적인 항체의 생산을 포함한다. 패혈증-유도성 세균은 GBS, 이. 콜라이, 스태필로코커스 종, 에스. 뉴모니애, 케이. 뉴모니애, 엔. 메닝기티디스 및/또는 슈도모나스 종일 수 있다. 한 실시형태에서, 스태필로코커스 종은 에스. 아우레우스이다. 다른 실시형태에서, 슈도모나스 종은 피. 아에루기노사이다. 다른 실시형태에서, 엔. 메닝기티디스는 MenB이다. 따라서, 항체가 특이성을 갖는 GAPDH는 서열번호 1 내지 서열번호 7로서 제공된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 한 실시형태에서, 패혈증-유도성 세균은 GBS가 아니다.
GAPDH는 보편적인 단백질이고, 본원에서 입증된 바와 같이, 패혈증-유도성 세균 사이에 보존되고, 본 발명의 펩타이드, 단편 및 변이체는 패혈증-유도성 세균의 상이한 혈청형 모두에 대한 보호를 유도할 수 있어 유리하다.
이전에, 9개의 GBS 혈청형에 대한 당접합체(glycoconjugate) 백신이 동물에서 면역원성인 것으로 밝혀졌지만, 별개의 에피토프-특이적 캡슐형 혈청형의 존재는 전세계 GBS 백신 개발을 방해하였다[46,47]. 대조적으로, GAPDH는 전부 8개의 공개된 GBS 게놈에서 구조적으로 보존되어 있다(동일성 > 99.8%). 본 발명자들이 이전에 기술한 바와 같이, GAPDH-면역화된 마우스 또는 토끼의 혈청으로부터 정제된 항-GAPDH 면역글로불린 G(IgG) 항체를 사용하여 상이한 혈청형 및/또는 MLSType에 속하는 10개의 비관련 GBS 임상학적 단리물의 배양 상청액에서 GAPDH의 존재를 입증하였다[24]. GBS GAPDH는 토끼, 마우스 및 사람 GAPDH와 각각 단지 44.7%, 45.8% 및 44.0%의 아미노산 동일성을 나타내지만, 이전에 기술된 'GBS 백신'은 포유동물에서 투여시 자가면역을 유도하지 않는다. GAPDH가 모든 패혈증-유도성 세균 사이에서 보존된다는 본 발명자들의 현재 발견을 고려하면, 본원에 기술된 펩타이드, 단편 및 변이체에 대해서도 동일한 것이 적용된다.
상기 펩타이드, 단편 또는 변이체의 사용은 시험관내, 생체내 또는 생체외 사용일 수 있다.
바람직하게는, 펩타이드, 이의 단편 또는 변이체의 사용은 항체 생산을 위한 시험관내 또는 생체외 사용이다. 특히 바람직한 실시형태에서, 시험관내 또는 생체외 사용은 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 생산을 위한 것이다.
이러한 용도는 1종 이상의 패혈증 유발 세균의 GAPDH에 특이적인 항체가 생산될 수 있도록 시험관내에서의 또는 생체외에서의 항체-생산성 세포와 제1 양상의 펩타이드, 단편 또는 변이체의 상호작용을 포함할 수 있다. 적합한 항체-생산성 세포 및 항체를 생산하기 위해 상기 세포를 본 발명의 펩타이드, 단편 또는 변이체와 접촉시키는 기술은 당해 기술 분야에 기술되어 있고 당해 분야 숙련가에게 익히 공지될 것이다. 예를 들면, 면역 사람 및/또는 비-사람 면역 동물의 혈액 제제(blood product)를 사용하여 항체를 생성할 수 있다. 대안으로, 제1 양상의 펩타이드, 단편 또는 변이체는 세균성 GAPDH의 상이한 에피토프에 대해 특이적인 하이브리도마를 생산하는데 사용될 수 있다. 당해 분야에서 이용가능한 표준 기술을 사용하여 하이브리도마를 생산할 수 있다.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기 펩타이드, 이의의 단편 또는 변이체의 사용은 생체내 사용이고, 즉, 대상에서의 면역 반응을 자극하기 위한 것이다.
펩타이드, 단편 또는 변이체는 백신접종될 대상체에게 그 자체로, 즉, 하나 이상의 패혈증-유도성 세균의 GAPDH 내에서 발견되는 펩타이드와 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 갖고, 사람 GAPDH 내에서 발견되는 펩타이드 또는 이의 기능성 단편 또는 기능성 변이체와 10% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단리된 펩타이드로 직접 투여될 수 있다.
펩타이드, 단편 또는 변이체는 주사 또는 점막에 의한 것을 포함하는 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는, 펩타이드, 단편 또는 변이체는 근육내, 피하, 정맥내 또는 피부내 투여된다. 백신접종될 대상체에의 본 발명의 펩타이드, 단편 또는 변이체의 투여가 펩타이드, 단편 또는 변이체에 대한 면역 특이성을 나타내는 상응하는 항체의 생산을 초래할 것이고, 이들 항체가 패혈증-유도성 세균과 함께 기존의 감염을 개선시키거나 치료하고 후속적 감염을 예방하는 것을 돕는다는 것이 이해될 것이다.
따라서, 바람직한 실시형태에서, 펩타이드, 이의 단편 또는 변이체는 패혈증-유도성 세균, 예를 들면, GBS, 이. 콜라이, 스태필로코커스 종, 에스. 뉴모니애, 케이. 뉴모니애, 엔. 메닝기티디스 및/또는 슈도모나스 종의 GAPDH에 대해 특이적인 항체의 생산을 자극하기 위한 것이다.
당해 분야 숙련가는 백신이 본원에 기술된 항원성 펩타이드, 단편 및 변이체, 예를 들면, 서열번호 9 내지 서열번호 69로서 나타내어진 펩타이드, 및 이의 단편 및 변이체에 기초하여 제조될 수 있는 다양한 방법이 있음을 이해할 것이다. 예를 들면, 숙주 벡터에서 발현을 촉진시키는 프로모터 또는 유전자(예를 들면, 이. 콜라이와 같은 세균 또는 아데노 바이러스와 같은 바이러스)에 이종 항원(즉, 상기 펩타이드, 이의 단편 또는 변이체)이 융합된 유전적으로 조작된 백신을 작제할 수 있다.
백신은 항원 보강제(adjuvant)로서 작용할 수 있는 부형제를 포함할 수 있다. 따라서, 한 실시형태에서, 백신에서의 항원성 펩타이드, 단편 또는 변이체는 미세입자 항원 보강제, 예를 들면, 리포솜 또는 면역 자극성 복합체(ISCOM)와 배합할 수 있다. 상기 펩타이드, 단편 또는 변이체는 콜레라 독소 또는 스쿠알렌-유사 분자와 같은 항원 보강제와 배합할 수 있다. 임의의 항원 보강제, 예를 들면, 수산화 알루미늄(명반), 파상풍 톡소이드(toxoid) 또는 디프테리아 독소가 사용될 수 있다. 비히클(vehicle)은 항원 보강제에 적합하게 사용될 수 있고, 이는 물, 포스페이트 완충된 염수(PBS), 폴리올 또는 덱스트로스 용액을 포함할 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 펩타이드, 이의 단편 또는 변이체는 담체 단백질과 함께 적합하게 사용하여 상기 펩타이드, 단편 또는 변이체의 유효 크기를 증가시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 면역계는 펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체를 인식할 뿐만 아니라 이에 대한 기억을 가질 것이다. 상기 펩타이드, 이의 단편 또는 변이체는 예를 들면, 키홀 림펫(keyhole limpet)으로부터의 헤모시아닌(KLH)과 같은 임의의 담체 단백질과 결합될 수 있다.
따라서, 본 발명의 백신은 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩타이드, 또는 이의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 항원 보강제 및/또는 담체 단백질과 함께 적절하게 포함한다. 기술된 펩타이드들 중 임의의 것을 단독으로 또는 다른 기술된 펩타이드들과 함께 사용할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 신생아 백신은 표 2에 나타낸(즉, 서열번호 9 내지 서열번호 12를 갖는) 전부 4개의 펩타이드들 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함한다. 그러나, 기술된 펩타이드들의 임의의 조합을 대신에 사용할 수 있다. 항원 보강제는 명반, 파상풍 톡소이드(TT) 또는 디프테리아 독소(DT)와 같이 사람 용도로 허가된 임의의 것일 수 있다. 담체 단백질(들)은 KLH, 소 혈청 알부민(BSA), 오브알부민(OVA), TT 및/또는 DT일 수 있다. 사람에서의 사용에 적합한 임의의 다른 담체 단백질은 또한 또는 대안으로 백신에 사용될 수 있다.
실시예 7은 백신을 제조할 수 있는 한 방법을 기술한다. 우선, 제1 양상에 따른 하나 이상의 펩타이드, 단편 또는 변이체는, 후속적으로 백신접종된 대상체가 상응하는 항원에 대해 항체를 생산할 것인 항원으로서 선택될 수 있다. 지정된 펩타이드, 단편 또는 변이체를 암호화하는 지정된 유전자 또는 핵산 분자의 서열은 당해 분야에 공지되어 있는 기술을 사용하여 본 발명의 제3 양상의 유전적 작제물을 형성하기 위해 적합한 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
지정된 항원을 암호화하는 DNA 서열은 공지된 단백질을 암호화하는 숙주 세균 세포로부터 임의의 공지된 표적 유전자에 삽입될 수 있다. 항원을 암호화하는 DNA 서열은 다중 클로닝 부위에 삽입될 수 있다. 숙주 유기체의 성장 및 기능이 손상되지 않는 한, 즉, 삽입이 기능적으로 중복되는 한, 임의의 유전자 내로의 삽입이 허용가능함이 이해될 것이다.
이로써 생성된 유전적 작제물은 이중 교차(cross-over) 재조합에 의해 영양적 모체 세포(vegetative mother cell)를 형질전환시키는데 사용될 수 있다. 대안으로, 유전자 작제물은 단일 교차 재조합에 의해 영양 모체 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있는 통합 벡터일 수 있다.
상기 작제물은 숙주 세포에서 선택가능한 약물-내성 유전자, 예를 들면, 클로람페니콜 내성을 포함할 수 있다. 플라스미드 클론의 확인 후, 플라스미드는 적합한 수단에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 형질전환은 DNA-매개된 형질전환이거나 또는 전기천공에 의한 것일 수 있다. 선택은 플라스미드에 의해 운반되는 약물 내성을 시험함으로써 달성되고, 그리고 나서 게놈에 도입될 수 있다.
하이브리드 또는 키메라 유전자의 발현은 도입된 항원을 인식하는 항체(즉, 세균성 GAPDH로부터 유도된 펩타이드, 단편 또는 변이체)를 사용하여 크기-분획화된 단백질(소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; SDS-PAGE)의 웨스턴 블로팅(Western blotting) 및 프로빙(probing)을 사용하여 확인될 수 있다. 숙주 유전자에 융합된 항원성 유전자 또는 핵산이 정확하게 발현되면, 항체에 의해서만 인식되고 숙주에서 정상적으로 발견되지 않는 새로운 밴드가 나타난다. 사용될 수 있는 다른 기술로는 숙주 표면 상의 항원의 표면 발현을 나타낼 수 있는 면역 형광 현미경 및 형광-활성화된 세포 분류(FACS) 분석이 있다.
얻어진 백신은 근육내, 피하, 피부내, 경구, 흡입, 비강내, 직장 및 정맥내 경로를 포함하는 임의의 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 경구 투여는 적합하게는 정제, 캡슐 또는 액체 현탁액 또는 에멀젼을 통해 이루어질 수 있다. 대안으로, 백신은 Dischaler® 또는 Turbohaler®를 통해 미세 분말 또는 에어로졸의 형태로 투여될 수 있다. 비강내 투여는 미세 분말 또는 에어로졸 비강 스프레이 또는 변형된 Dischaler® 또는 Turbohaler®의 형태로 적합하게 이루어질 수 있다. 직장 투여는 좌제를 통해 적합하게 이루어질 수 있다.
본 발명의 백신은 이를 필요로 하는 임의의 대상체, 특히, 신생아, 유아, 소아, 가임 연령의 여성, 임신한 여성, 태아, 노인 대상체 또는 당뇨병 환자와 같은 면역약화된 숙주에의 투여용으로 제형화한다. 백신은 패혈증-유도성 세균에 의해, 이미 감염의 징후가 나타내거나 면역약화되거나 감염의 위험이 보다 크다고 여겨지는 환자에게만 투여할 필요가 있는 것은 아니다. 오히려, 장래에 이러한 감염의 가능성에 대한 순전한 예방 수단으로서 명백히 건강한 대상체에게 백신을 투여할 수 있다. 예를 들면, 신생아, 유아, 소아, 가임 연령의 여성, 임신한 여성, 태아, 노인 및 당뇨병 환자와 같은 면역약화된 숙주에게 일반적인 백신접종 프로그램의 일부로서 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 "면역약화된"은 신생아, 유아, 소아, 가임 연령의 여성, 임신한 여성, 태아, 노인 및 당뇨병 환자에 의해 예시되는 약화된 면역 시스템을 갖는 것을 의미한다.
본 발명의 백신은 임의의 연령에서 명시된 대상체에의 투여용으로 제형화될 수 있다. 신생아, 유아, 영아 및 학령기 소아를 포함하는 모든 연령대의 소아에게 투여될 것임이 의도된다. 산모와 태아 둘 다를 감염으로부터 보호하기 위해 임신한 여성 및 가임 연령의 여성에게 투여될 것임이 의도된다. 또한, 노인 대상체에게는 노년기 동안 언제든지, 그리고 당뇨병 환자에게는 평생 동안 언제든지 투여될 것임이 의도된다.
본원에서 사용되는 용어 '신생아'('neonate' 및 'newborn')는 출생으로부터 대략 1개월령의 소아를 나타낼 수 있다. 상기 용어는 미숙아(premature infant), 과숙아(postmature infant) 및 만기아(full term infant)에 적용된다. 출생 전에는 용어 '태아'를 사용한다.
본원에서 사용되는 용어 "유아(baby)" 및 "영아(infant)"는 대략 1개월령 내지 대략 1 또는 2년령 사이의 어린 소아(즉, 소아가 걷고 말하는 것을 배우는 때, 대신에 용어 '토들러(toddler)'가 사용될 수 있는 때의 연령)를 나타낼 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "소아(child)"는 토들러부터 대략 12년령, 즉, 프리-틴(pre-teen)까지의 소아에 걸친 어린 소아를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '노인'은 고령의 대상체를 나타낸다. 예를 들면, 60세 이상, 65세 이상, 70세 이상, 75세 이상 또는 80세 이상의 남성과 여성을 지칭할 수 있다. 상응하는 후년생(later years of life)의 비-사람 대상체도 이 용어에 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 '당뇨병 환자'는 임의의 병기의 1형 진성 당뇨병(연소성(juvenile) 또는 인슐린-의존성 당뇨병으로서도 공지되어 있음)을 앓고 있는 사람을 말한다. 이는 환자를 면역약화되게 하는 면역계 병리학과 관련된 유일한 유형의 당뇨병이다.
본 발명의 백신은 다른 기존 백신, 예를 들면, 유아, 소아, 가임 연령의 여성, 임신한 여성, 노인 및 당뇨병 환자와 같은 면역약화된 숙주에게 권고되는 백신(예를 들면, 파상풍 및 디프테리아 백신)과 동시에 투여될 수 있다.
본 발명의 백신은 특히 근육내, 피하, 피부내, 구강, 비강내 또는 정맥내 경로에 의해 가임 연령의 여성에게 투여될 수 있다. 이 백신의 보강(boost)은 임신 후기(the third trimester of gestation)에 의도된다. 이 백신은 GBS, 이. 콜라이, 스태필로코커스 종, 에스. 뉴모니애, 케이. 뉴모니애, 슈도모나스 종 및 엔. 메닝기티디스를 포함하는 패혈증-유도성 세균에 의해 야기되는 생체내 감염으로부터 가임 연령의 여성을 보호하는 것으로 의도된다. 태어나지 않은 영아(태아)는 이의 모체의 항체가 특히 임신 후기에 발달하고 있는 태아에게 도달할 때에 획득된 수동 면역으로부터 이익을 얻는다. 실시예에 예시된 바와 같이, 본 발명의 백신은 또한 생식관으로부터 양수로의 세균의 상행(ascending)으로 인한 자궁내 감염에 의해 야기되는 조산 및 사산을 예방할 수 있다.
백신접종될 유기체에 따라 적합한 투약 용법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 백신접종될 사람 대상체의 경우, 일반적으로 2개월 간격으로 정제 또는 캡슐제로서 10mg/kg의 3회 용량을 사용할 수 있다. 혈액은 혈청(IgG) 반응의 분석을 위해 채혈될 수 있다. 점액(분비성 IgA) 반응의 분석을 위해 타액, 질액 또는 분변을 채취할 수 있다. 간접적 효소-링크된 면역 흡착 분석법(ELISA)은 혈청 및 점막 샘플의 항체 반응을 분석하여 백신접종의 효능을 측정하는데 사용될 수 있다.
실시예에 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드가 패혈증-유도성 세균에 대한 보호 항체 반응을 유도할 수 있음을 밝혔다. 본 발명자는 실시예에서 본 발명의 백신이 패혈증-유도성 세균에 의한 감염을 예방할 수 있음을 입증하였다. 바람직하게는, 상기 백신은 GBS, 이. 콜라이, 스태필로코커스 종, 에스. 뉴모니애, 케이. 뉴모니애, 엔. 메닝기티디스 및/또는 슈도모나스 종 감염을 예방하기 위한 것이다. 백신 개발에 있어서, 그리고 상기 기술된 바와 같이, 서열번호 9 내지 69 또는 이의 단편 또는 변이체 중 임의의 것 또는 모든 것이 백신접종될 대상체에서 면역 반응을 유발하기 위한 항원으로서 사용될 수 있는 것이 바람직하다. 백신은 예방학적이고; 즉, 본원에 기술된 펩타이드, 단편 또는 변이체는 이전 감염의 재발/재콜로니화(recolonisation)를 예방하는 것을 포함하여 감염을 예방하는데 사용될 수 있다.
따라서, 제10 양상에서, 치료요법에 사용하기 위한 제1 양상의 펩타이드, 단편 또는 변이체가 제공된다.
제11 양상에서, 본 발명은 패혈증-유도성 세균에 의한 감염을 예방하는데 사용하기 위한, 제1 양상의 펩타이드, 단편 또는 변이체 또는 제8 양상에 따른 백신을 제공한다.
또한, 본 발명의 제12 양상에 따르면, 패혈증-유도성 세균에 의한 감염의 예방 방법으로서, 상기 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 제1 양상에 따른 펩타이드, 단편 또는 변이체 또는 제8 양상에 따른 백신을 투여함을 포함하는, 패혈증-유도성 세균에 의한 감염의 예방 방법이 제공된다.
본 발명의 펩타이드, 단편, 변이체 또는 백신은 패혈증의 가장 흔한 원인인 적어도 7개의 상이한 병원체, 바람직하게는 GBS, 이. 콜라이, 스태필로코커스 종, 에스. 뉴모니애, 케이. 뉴모니애, 슈도모나스 종 및 엔. 메닝기티디스 중 하나 이상에 의해 야기되는 전신 감염을 예방할 수 있다. 한 실시형태에서, 스태필로코커스 종은 에스. 아우레우스이다. 다른 실시형태에서, 슈도모나스 종은 피. 아에루기노사이다. 다른 실시형태에서, 엔. 메닝기티디스는 MenB이다. 한 실시형태에서, 패혈증-유도성 세균은 GBS가 아니다. 따라서, 본 발명의 펩타이드, 단편, 변이체 또는 백신은 패혈증 또는 패혈증-유도성 세균의 감염에 의해 야기되는 임의의 기타 질환, 장애 또는 병태를 예방할 수 있다. 이들 기타 질환, 장애 또는 병태로는 폐렴, 수막염, 심내막염, 소장결장염, 요로 감염, 연조직 감염, 위장 감염, 혈류 감염 및 뇌염이 포함된다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드, 단편, 변이체 또는 백신은 조산 및/또는 사산을 예방하는데 사용된다. 본원에서 설명되는 바와 같이, 조산 및 사산은 생식관으로부터 양수로의 세균(예를 들면, GBS, 이. 콜라이 및 클렙시엘라 종)의 상행으로 인한 자궁내 감염에 의해 야기된다. 본 발명의 펩타이드, 단편, 변이체 또는 백신으로 예비 모체(expectant mother)를 백신접종함으로써, 이러한 항원에 대해 생성된 항체로의 수동 면역이 출생전 자손에게 제공된다. 따라서, 태아와 신생아는 산모 백신접종을 통해 감염에 대해 보호될 수 있다.
본 발명자들은 모든 패혈증-유도성 세균에 의해 분비되는 GAPDH, 및 특히 이들 분비된 GAPDH의 서열 유사성에 대한 지식이 또한 패혈증-유도성 세균에 의한 감염을 치료하거나, 예방하거나 또는 개선하기 위한 유용한 치료학적 약물의 조제시에 이용될 수 있다는 것을 깨달았다. 예를 들면, 분비된 GADPH의 표적 사람 또는 동물 세포와의 결합을 차단하는 임의의 제제는 이 표적 세포에서의 감염을 예방하거나, 치료하거나 또는 개선하기 위한 의약으로서 사용될 수 있다.
분비된 GADPH의 사람 또는 동물 세포와의 결합을 차단할 수 있는 제제는 항체일 수 있다. 예를 들면, 서열번호 9 내지 서열번호 69에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것들을 포함하는, 본원에 기술된 임의의 펩타이드, 단편 또는 변이체에 대해 특이성을 나타내는 항체는, 사람 또는 동물 세포에의 분비된 GAPDH의 결합을 차단할 수 있다. 예를 들면, 백신을 점막 투여하면, 점막 표면에 분비성 IgA가 생성될 것이고, 항체(sIgA)는 숙주 세포 상피에의 GAPDH의 결합을 차단할 수 있다. 백신이 전신 투여되면, B1 세포의 표면 상의 TLR2에의 세균성 GAPDH의 결합을 차단하고 이들 세포에 의한 IL-10의 초기 생산을 예방할 것인 IgG 생산이 유도될 것이다.
따라서, 본 발명의 제13 양상에 따르면, 1종 이상의 패혈증-유도성 세균의 GAPDH에 대해 특이적인 항체가 제공되고, 상기 항체는 제1 양상의 펩타이드, 단편 또는 변이체에 대해 생성된다.
항체와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 '에 대해 특이적'은 항체의 가변 영역이 배타적으로 이들의 표적(예를 들면, 펩타이드 또는폴리 펩타이드)만을 인식하여 결합함(즉, 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 패밀리에서 발견되는 서열 동일성, 상동성 또는 유사성에도 불구하고 다른 유사한 펩타이드 또는 폴리펩타이드로부터 상기 표적 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 구별할 수 있음)을 의미할 수 있다.
상기와 같이, 본 발명의 제1 양상의 펩타이드, 단편 또는 변이체의 아미노산 서열은 천연 세균성 GAPDH 서열 내에서 발견되는 서열일 수 있다. 따라서, 이러한 서열은 세균성 GAPDH 상의 표적 에피토프를 나타내고, 이는 사람 또는 동물 세포에의 분비된 GAPDH의 결합의 차단에 이용될 수 있다.
따라서, 제14 양상에서, 1종 이상의 패혈증-유도성 세균의 GAPDH에서 발견되는 에피토프에 대해 특이적인 항체가 제공되고, 여기서, 상기 에피토프는 실질적으로 서열번호 9 내지 서열번호 69 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
제13 및 제14 양상의 항체는 사람 또는 동물 세포에의 1종 이상의 패혈증-유도성 세균에 의해 분비된 GAPDH의 결합을 차단할 수 있다. 상기와 같이, 상기 세포는 상피 세포 또는 B1 세포일 수 있다. 대식세포와 같은 다른 백혈구도 고려된다. 예를 들면, 상기 항체는 sIgA일 수 있고, 사람 또는 동물 상피 세포에의 GAPDH의 결합을 차단할 수 있다. 대안으로, 상기 항체는 IgG일 수 있고, B1 세포 또는 대식세포와 같은 사람 또는 동물 백혈구의 표면 상의 TLR2에의 GAPDH의 결합을 차단할 수 있다. 그 결과, 이러한 항체는 사람 또는 동물 세포에서 GAPDH-유도된 IL-10 생산을 차단하거나 중화시키는데 적합하다. 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체 둘 다는 본 발명에 포함된다.
본 발명의 제15 양상에 따르면, 1종 이상의 패혈증-유도성 세균의 GAPDH에 대해 특이적인 항체의 생산 방법으로서, 상기 방법은 항체-생산 세포를 제1 양상의 펩타이드, 단편 또는 변이체 또는 제8 양상에 따른 백신과 접촉시키는 단계를 포함하는, 1종 이상의 패혈증-유도성 세균의 GAPDH에 대해 특이적인 항체의 생산 방법이 제공된다.
바람직하게, 본 발명의 상기 양상들에서 언급된 패혈증-유도성 세균은 GBS, 이. 콜라이, 스태필로코커스 종, 에스. 뉴모니애, 케이. 뉴모니애, 엔. 메닝기티디스 및/또는 슈도모나스 종이다. 한 실시형태에서, 스태필로코커스 종은 에스. 아우레우스이다. 다른 실시형태에서, 슈도모나스 종은 피. 아에루기노사이다. 다른 실시형태에서, 엔. 메닝기티디스는 MenB이다. 따라서, 항체가 특이성을 갖거나 이에 항체가 결합하는 GAPDH는 서열번호 1 내지 서열번호 7로서 확인되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 한 실시형태에서, 패혈증-유도성 세균은 GBS가 아니다.
본 발명의 방법은 시험관내, 생체내 또는 생체외 방법일 수 있다.
적합한 시험관내 및 생체외 방법은 본 발명의 제9 양상에서 기술된 방법, 즉, 1종 이상의 패혈증-유도성 세균의 GAPDH에 특이적인 (모노클로날 또는 폴리클로날) 항체의 생산 방법이다.
적합한 생체내 방법은 본 발명의 제9 양상에 기술된 방법, 즉, 백신접종 방법이다.
제16 양상에서, 패혈증-유도성 세균에 의한 감염을 치료하거나 개선하거나 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 제13 또는 제12 양상에 따른 항체 또는 제18 양상에 따른 백신을 투여함을 포함하는, 패혈증-유도성 세균에 의한 감염을 치료하거나 개선하거나 또는 예방하는 방법이 제공된다.
바람직하게, 상기 항체는 GBS, 이. 콜라이, 스태필로코커스 종, 에스. 뉴모니애, 케이. 뉴모니애, 엔. 메닝기티디스 및/또는 슈도모나스 종으로의 감염을 치료하거나 개선하거나 또는 예방할 수 있다. 한 실시형태에서, 스태필로코커스 종은 에스. 아우레우스이다. 다른 실시형태에서, 슈도모나스 종은 피. 아에루기노사이다. 다른 실시형태에서, 엔. 메닝기티디스는 MenB이다. 따라서, 항체가 특이성을 갖는 GAPDH는 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 7로서 제공되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 한 실시형태에서, 패혈증-유도성 세균은 GBS가 아니다.
따라서, 본 발명의 항체는 패혈증-유도성 세균의 감염에 의해 야기되는 패혈증 또는 임의의 기타 질환, 장애 또는 병태를 예방하거나, 치료하거나 또는 개선할 수 있다. 이들 기타 질환, 장애 또는 병태로는 폐렴, 수막염, 심내막염, 소장결장염, 요로 감염, 연조직 감염, 위장 감염, 혈류 감염 및 뇌염이 포함된다. 따라서, 치료요법에 사용하기 위한, 그리고 특히 상기 언급된 질환, 장애 및 병태를 예방하거나 치료하거나 또는 개선시키는 것을 포함하는 패혈증-유도성 세균에 의한 감염을 예방하거나, 치료하거나 또는 개선시키는데 사용하기 위한 본 발명의 제13 및 제14 양상의 항체도 제공된다.
바람직하게, 항체는 본 발명의 제1 양상에 정의된 펩타이드, 단편 또는 변이체, 또는 본 발명의 제8 양상에 정의된 백신에 대해 생성된다.
본 발명의 제12 양상과 관련하여 상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 펩타이드, 단편, 변이체 또는 백신에 대해 생성된 항체는 모체의 태반을 통해 출생전 유아에게 또는 모유수유 동안 모유로 전달될 수 있다. 출생전 자손에 제공되는 이러한 수동 면역은 패혈증-유도성 세균에 의한 감염에 대해 보호할 수 있고, 조산 및/또는 사산을 예방할 수 있다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 제16 양상의 방법은 출생전 유아에서의 감염의 예방 방법, 및 조산 및/또는 사산의 예방 방법이다. 이러한 실시형태에서, 분만시 항생제 예방법을 대체하기 위한 적합한 전략으로서 항체를 예비 모체에 투여될 수 있다. 따라서, 조산 및/또는 사산을 예방하는데 사용하기 위한 본 발명의 제13 및 제14 양상의 항체도 제공된다.
본원에 사용되는 용어 '항체'는 전체 IgG뿐만 아니라 Fab 및 F(ab')2 단편도 포함하는 IgG의 부분도 포함한다. 이는 또한 sIgA도 포함한다.
따라서, 본 발명의 백신을 이용한 백신접종에 추가하여, 본원에 기술된 펩타이드, 단편, 변이체 또는 백신으로 유발되는 항체는, 전체 sIgA 또는 IgG 항체 또는 Fab 또는 F(ab')2를 포함하는 이들의 부분에 관계없이 백신을 투여받지 않은 감염된 개체 및/또는 모체에 대한 치료제로서 구체적으로는 하기와 같이 사용될 수 있다:
a) 패혈증-유도성 세균에 의한 패혈증 또는 감염이 의심되거나 증명된 신생아에게 투여되는 치료학적 접근법 - 전체 IgG 또는 Fab/F(ab')2 단편;
b) 백신을 투여받지 않은 모체로부터 출생한 신생아에게 투여되는 패혈증-유도성 세균에 의한 감염에 대한 예방학적 접근법 - 전체 IgG 또는 Fab/F(ab')2 단편;
c) 백신을 투여받지 않은 백신접종의 후기의 여성에게 또는 가임 연령의 여성에게 투여되는 패혈증-유도성 세균에 의한 감염에 대한 예방학적 접근법 - 전체 IgG; 및
d) 패혈증-유도성 세균에 의해 야기된 패혈증 또는 침습성 감염이 증명된 가임 연령의 여성 또는 예비 모체에 대한 치료학적 접근법.
항-GAPDH 항체의 수동 투여는 내성 스트레인의 선택을 야기하는 항생제 투여에 기초한 현재의 치료학적 접근법에 비해 유의한 개선을 이룬다. 수동 면역은 사람에게 다른 대상체의 항체가 주어질 때 발생한다. 이들 항체가 사람의 신체에 도입되는 경우, '론드(loaned)' 항체가 소정 전염성 질환을 예방하거나 퇴치하는 것을 돕는다. 수동 면역화에 의해 제공되는 보호는 수명이 짧고, 대개 단지 수주 또는 수개월 지속되지만, 이는 보호를 보조한다.
본원에 입증되는 바와 같이, 수동 면역은 항체가 비-면역성 개체에게 의약으로서 제공될 때 인위적으로 유도될 수 있다. 상기와 같이, 이들 항체는 면역성 사람 또는 말, 양 및 토끼와 같은 비-사람 면역성 동물의 풀링되고(pooled) 정제된 혈액 제제로부터 유래할 수 있다. 실시예에 나타내는 바와 같이, 신생 마우스에 대한 항체의 수동 투여는 GBS, 이. 콜라이, 에스. 뉴모니애 및 에스. 아우레우스로의 치사(lethal) 감염으로부터의 보호를 부여한다. 이들 항체는 본 발명의 백신이 백신접종되지 않은 모체에게 그리고/또는 백신접종되지 않은 모체로부터의 신생아에게 투여해야 한다. 본원에 논의된 바와 같이, 수동 면역은 또한 예비 모체에게 본 발명의 펩타이드, 제제, 백신, 항체 및 의약을 투여함으로써 태아에서 유도될 수 있다. 출생전 영아(태아)는 이의 모체의 항체가 특히 임신 후기에 발달하고 있는 태아에게 도달할 때에 획득된 수동 면역으로부터 이익을 얻는다. 따라서, 이는 분만시 항생제 예방법을 대체하기 위한 적합한 전략이다.
본 발명에 따른 펩타이드, 제제, 백신, 항체 및 의약은 패혈증-유도성 세균으로의 감염을 치료하거나, 개선하거나 또는 예방하기 위한 단일 치료요법(즉, 해당 펩타이드, 제제, 백신, 항체 또는 의약의 단일 사용)으로 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 대안으로, 본 발명의 펩타이드, 제제, 백신, 항체 및 의약은 패혈증-유도성 세균으로의 감염을 치료하거나, 개선하거나 또는 예방하기 위한 공지의 치료요법에 대한 보조로서 또는 이들과 병용하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 펩타이드, 제제, 백신, 항체 또는 의약은 패혈증-유도성 세균 감염을 치료하기 위한 공지의 제제와 병용하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 펩타이드, 제제, 백신, 항체 또는 의약은 진균 또는 바이러스에 의해 야기된 신생아 패혈증을 치료하기 위한 공지의 제제와 병용하여 사용할 수 있다. 이는 공지의 항-레트로바이러스 제제와 병용하여 사용할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 펩타이드, 제제, 백신, 항체 또는 의약이 어느 환자에게 투여되어야 하는지에 대한 제한은 없다. 오히려, 본원에 기술된 임의의 펩타이드, 제제, 백신, 항체 및 의약은 본원에 기술된 임의의 환자에게 투여될 수 있는 것으로 의도된다. 실제로, 펩타이드, 제제, 백신, 항체 또는 의약 및 명시된 환자 그룹의 각각의 그리고 모든 조합이 본 발명에 포함된다는 것은 본 발명자에 의해 명백하게 의도된다. 따라서, 본 발명은 치료학적 제제 및 명시된 환자 그룹의 각각의 그리고 모든 가능한 조합을 포함한다. 신생아, 유아, 소아, 가임 연령의 여성, 임신한 여성, 태아, 노인 및 당뇨병 환자와 같은 면역약화된 숙주에서의 신생 백신의 사용이 바람직하다.
본 발명에 따른 펩타이드, 제제, 백신, 항체 및 의약은, 특히 조성물이 사용되는 방식에 따라 다수의 상이한 형태를 갖는 조성물로 배합될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 조성물은 분말, 정제, 캡슐제, 액제, 연고, 크림, 겔, 하이드로겔, 에어로졸, 스프레이, 미셀 용액, 경피 패치, 리포솜 현탁액 또는 치료를 필요로 하는 사람 또는 동물에게 투여될 수 있는 임의의 다른 적합한 형태일 수 있다. 본 발명에 따른 의약의 비히클은 이것이 주어지는 대상체에 의해 내약성이 양호한 것이어야만 하고, 혈뇌 장벽에 가로지르는 상기 제제의 전달을 가능하게 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 펩타이드, 제제, 백신 및 항체를 포함하는 의약은 다수의 방법으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 경구 투여가 요구될 수 있고, 이 경우에 상기 제제는 예를 들면, 정제, 캡슐제 또는 액제의 형태로 경구로 섭취될 수 있는 조성물 내에 함유될 수 있다. 본 발명의 펩타이드, 제제, 백신, 항체 및 의약을 포함하는 조성물은 흡입(예를 들어, 비내)에 의해 투여될 수 있다. 조성물은 또한 국소 사용을 위해 제형화될 수 있다. 예를 들면, 크림이나 연고를 피부에 적용할 수 있다.
본 발명에 따른 펩타이드, 제제, 백신, 항체 및 의약은 또한 느리거나 지연된 방출 장치 내에 혼입될 수 있다. 이러한 장치는 예를 들면, 피부 위 또는 아래에 삽입될 수 있고, 의약은 수주 또는 수개월 동안 방출될 수 있다. 상기 장치는 적어도 치료 부위에 인접하게 위치할 수 있다. 이러한 장치는 본 발명에 따라 사용되는 제제로의 장기 치료가 요구될 때 특히 유리할 수 있고, 이는 통상적으로 빈번한 투여(예를 들면, 적어도 매일 주사)를 요구할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 펩타이드, 제제, 백신, 항체 및 의약은 혈류 내로의 주사에 의해 또는 치료를 요하는 부위에 직접적으로 투여할 수 있다. 주사는 정맥(볼루스 또는 주입) 또는 피하(볼루스 또는 주입) 또는 피내(볼루스 또는 주입) 주사일 수 있다.
요구되는 펩타이드, 제제, 백신, 항체 또는 의약의 양은 이의 생물학적 활성 및 생체이용률(bioavailability)에 의해 결정되고, 이는 결과적으로 투여 방식, 펩타이드, 제제, 백신, 항체 및 의약의 물리 화학적 특성, 그리고 단일 치료요법으로서 사용되는지 또는 복합 치료요법으로 사용되는지에 의존함이 이해될 것이다. 또한, 투여 빈도는 치료받는 대상체 내에서의 제제의 반감기에 의해 영향을 받을 것이다. 투여될 최적 용량은 당해 분야 숙련가에 의해 결정될 수 있고, 사용중인 특정 제제, 약제 조성물의 강도, 투여 방식, 및 세균 감염의 진행에 따라 달라질 것이다. 치료되는 특정 대상체에 따른 추가의 인자들은 용량을 조정할 필요성을 초래할 것이고, 이로는 대상체 연령, 체중, 성별,식이요법 및 투여 시간이 포함된다.
일반적으로, 0.001㎍/kg 체중 내지 10mg/kg 체중의 1일 용량의 본 발명에 따른 펩타이드, 제제, 백신, 항체 또는 의약은 어떠한 펩타이드, 제제, 백신, 항체 또는 의약이 사용되는지에 따라 세균성 감염을 치료하거나, 개선하거나 또는 예방하는데 사용할 수 있다. 보다 바람직하게, 1일 용량은 0.01㎍/kg 체중 내지 1mg/kg 체중이고, 보다 바람직하게는 0.1㎍/kg 내지 100㎍/kg 체중이고, 가장 바람직하게는 대략 0.1㎍/kg 내지 10㎍/kg 체중이다.
펩타이드, 제제, 백신, 항체 또는 의약은 세균 감염의 개시 전에, 개시 동안에 또는 개시 후에 투여될 수 있다. 1일 용량은 단일 투여(예를 들면, 1일 1회 주사)로서 제공될 수 있다. 대안으로, 펩타이드, 제제, 백신, 항체 또는 의약은 1일 동안 2회 이상의 투여를 요구할 수 있다. 한 예로서, 펩타이드, 제제, 백신, 항체 및 의약은 0.07㎍ 내지 700mg의 1일 용량(즉, 70kg 체중으로 가정)으로 2회(또는 치료되는 세균성 감염의 중증도에 따라 그 이상) 투여될 수 있다. 치료받는 환자는 잠에서 깨어날 때 제1 용량을, 이어서, 저녁에(2회-용량 용법의 경우) 또는 그 이후 3 내지 4시간 간격으로 제2 용량을 복용할 수 있다. 대안으로, 환자에게 반복적 용량을 투여할 필요없이 본 발명에 따른 펩타이드, 제제, 백신, 항체 및 의약의 최적 용량을 제공하기 위해 서방형 장치를 사용할 수 있다. 약제 산업에 통상적으로 사용되는 것과 같은 공지의 절차(예를 들면, 생체내 실험, 임상 시험 등)를 사용하여 본 발명에 따른 펩타이드, 제제, 백신, 항체 및 의약의 특정 제형 및 정확한 치료학적 용법(예를 들면, 제제의 1일 용량 및 투여 빈도)을 형성할 수 있다.
본 발명의 제17 양상에서, 본 발명의 제13 또는 제14 양상의 항체 및 임의로 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 패혈증-유도성 세균 치료 조성물이 제공된다.
용어 "패혈증-유도성 세균 치료 조성물" 또는 "항-패혈증-유도성 세균 조성물"은 대상체에서의 패혈증-유도성 세균 감염의 치료학적 개선, 예방 또는 치료에 사용되는 약제학적 제형을 의미할 수 있다.
또한, 본 발명은, 제18 양상에서, 제17 양상에 따른 조성물을 제조하기 위한 프로세스로서, 상기 프로세스는 본 발명의 제13 또는 제14 양상의 항체의 치료학적 유효량을 약제학적으로 허용되는 비히클과 배합함을 포함하는, 제17 양상에 따른 조성물을 제조하기 위한 프로세스를 제공한다.
제제(예를 들면, 본 발명의 항체)의 "치료학적 유효량"은 대상체에게 투여될 때 감염을 치료하거나 원하는 효과를 생성시키기 위해 필요한 제제의 양인 임의의 양이다.
예를 들면, 사용되는 제제(예를 들면, 항체)의 치료학적 유효량은 약 0.001mg 내지 약 1000mg, 바람직하게는 약 0.01mg 내지 약 500mg일 수 있다. 제제의 양은 약 0.1mg 내지 약 100mg, 가장 바람직하게는 약 0.5mg 내지 약 50mg의 양이다. 참고로, 본원에 기술된 실시예에서 신생아 마우스에 사용된 항체의 용량은 40mg/kg이었다.
본원에 나타낸 바와 같은 "약제학적으로 허용되는 비히클"은 임의의 공지의 화합물 또는 당해 분야 숙련가들에게 약제학적 조성물을 제형화하는데 유용한 것으로 알려져 있는 공지의 화합물들의 조합이다.
본원에 사용되는 "대상체"는 척추동물, 포유동물 또는 가축 동물일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드, 제제, 백신, 항체 및 의약은 임의의 포유동물, 예를 들면, 가축(예를 들면, 말), 애완동물을 치료하는데 사용될 수 있거나, 기타 수의학적 적용에 사용될 수 있다. 가장 바람직하게는 대상체는 사람이다.
한 실시형태에서, 약제학적으로 허용되는 비히클은 고체일 수 있고, 상기 조성물은 분말 또는 정제의 형태로 이루어질 수 있다. 고체의 약제학적으로 허용되는 비히클은 향미제, 윤활제, 가용화제, 현탁제, 염료, 충전제, 활택제, 압축 보조제, 비활성 결합제, 감미제, 보존제, 염료, 코팅제 또는 정제-붕해제로서 작용할 수도 있는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다. 비히클은 또한 캡슐화 재료일 수 있다. 분말에서, 비히클은 본 발명에 따른 미세하게 분할된 활성 제제와의 혼합물로 존재하는 미세 분할된 고체이다. 정제에서, 활성 제제는 필요로 하는 압축 특성을 갖는 비히클과 적합한 비율로 혼합하여 원하는 형태 및 크기로 압축될 수 있다. 분말 및 정제는 바람직하게는 활성 제제를 99%까지 함유한다. 적합한 고체 비히클로는 예를 들면, 인산 칼슘, 스테아르산 마그네슘, 탈크, 당, 락토스, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 셀룰로스, 폴리비닐피롤리딘, 저용융 왁스 및 이온 교환 수지가 포함된다. 다른 실시형태에서, 약제학적 비히클은 겔일 수 있고, 상기 조성물은 크림 등의 형태로 이루어질 수 있다.
그러나, 약제학적 비히클은 액체일 수 있고, 약제학적 조성물은 용액의 형태로 존재한다. 액체 비히클은 용액, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 엘릭시르 및 가압된 조성물의 제조에 사용된다. 본 발명에 따른 활성 제제는 물, 유기 용매, 상기 둘 다의 혼합물 또는 약제학적으로 허용되는 오일 또는 지방과 같은 약제학적으로 허용되는 액체 비히클에 용해되거나 현탁될 수 있다. 액체 비히클은 다른 적합한 약제학적 첨가제, 예를 들면, 가용화제, 유화제, 완충제, 보존제, 감미제, 향미제, 현탁제, 증점제, 착색제, 점도 조절제, 안정화제, 또는 삼투압 조절제를 함유할 수 있다. 경구 및 비경구 투여를 위한 액체 비히클의 적합한 예로는 물(부분적으로 상기와 같은 첨가제, 예를 들면, 셀룰로스 유도체, 바람직하게는 소듐 카르복시메틸 셀룰로스 용액을 함유함), 알콜(모노하이드릭 알콜 및 폴리하이드릭 알콜, 예를 들면, 글리콜) 및 이들의 유도체, 및 오일(예를 들면, 분획화된 코코넛 오일 및 땅콩 오일)이 포함된다. 비경구 투여의 경우, 비히클은 또한 오일성 에스테르, 예를 들면, 에틸 올레에이트 및 이소프로필 미리스테이트일 수 있다. 멸균 액체 비히클은 비경구 투여를 위한 멸균 액체 형태 조성물에 유용하다. 가압된 조성물을 위한 액체 비히클은 할로겐화된 탄화수소 또는 기타 약제학적으로 허용되는 추진제일 수 있다.
멸균 용액 또는 현탁액인 액체 약제학적 조성물은 예를 들면 근육내, 척수강내, 경막외, 복강내, 정맥내 및 특히 피하 주사에 의해 활용될 수 있다. 상기 제제는 멸균수, 식염수 또는 다른 적절한 멸균 주사 가능한 매체를 사용하여 투여시 용해되거나 현탁될 수 있는 멸균 고체 조성물로서 조제될 수 있다.
본 발명의 제제 및 조성물은 다른 용질 또는 현탁제(예를 들면, 용액을 등장 성으로 만들기에 충분한 염수 또는 글루코스), 담즙산염, 아카시아, 젤라틴, 소르비탄 모노올레에이트, 및 폴리소르베이트 80(소르비톨의 올레에이트 에스테르 및 에틸렌 옥사이드와 공중합된 이의 무수물) 등을 함유하는 멸균 용액 또는 현탁액의 형태로 경구 투여될 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 제제는 또한 액체 또는 고체 조성물 형태로 경구 투여될 수 있다. 경구 투여에 적합한 조성물은 환제, 캡슐제, 과립, 정제 및 분말과 같은 고체 형태 및 용액, 시럽, 엘릭시르 및 현탁액과 같은 액체 형태를 포함한다. 비경구 투여에 유용한 형태는 멸균 용액, 에멀젼 및 현탁액을 포함한다.
본 발명은 이의 기능성 변이체 또는 기능성 단편을 포함하는, 본원에 언급 된 임의의 서열의 아미노산 또는 핵산 서열을 실질적으로 포함하는 임의의 핵산 또는 펩타이드 또는 이의 변이체, 유도체 또는 유사체로 확장된다. 용어 "실질적으로 아미노산/뉴클레오타이드/펩타이드 서열", "기능성 변이체" 및 "기능성 단편"은, 본원에 언급된 서열들 중 임의의 하나의 아미노산/뉴클레오타이드/펩타이드 서열과 적어도 40%의 서열 동일성, 예를 들면, 서열번호 9 내지 서열번호 69로서 확인되는 서열과 40%의 동일성을 갖는 서열일 수 있다.
본원에 언급된 임의의 서열에 대해 50% 초과, 보다 바람직하게는 65%, 70%, 75% 초과, 그리고 보다 더 바람직하게는 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산/뉴클레오타이드/펩타이드 서열도 고찰된다. 바람직하게는, 아미노산/뉴클레오타이드/펩타이드 서열은 언급된 서열 중 임의의 서열과 적어도 85%의 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 92%, 95%, 97%, 98% 그리고 가장 바람직하게는 본원에 언급된 서열 중 임의의 서열과 적어도 99%의 동일성을 갖는다.
숙련된 기술자는 2개의 아미노산/뉴클레오타이드/펩타이드 서열 사이의 동일성 백분율을 계산하는 방법을 이해할 것이다. 2개의 아미노산/뉴클레오타이드/펩타이드 서열 사이의 동일성 백분율을 계산하기 위해, 우선 2개의 서열 정렬을 준비하고, 이어서, 서열 동일성 값을 계산해야만 한다. 2개의 서열의 동일성 백분율은 (i) 서열을 정렬하는데 사용되는 방법, 예를 들면, ClustalW, BLAST, FASTA, 스미스-워터맨(Smith-Waterman)(상이한 프로그램에서 구현됨) 또는 3D 비교로부터의 구조적 정렬; 및 (ii) 정렬 방법에 의해 사용되는 파라미터, 예를 들면, 지역 대 세계 정렬, 사용된 페어-스코어 매트릭스(pair-score matrix)(예를 들면, BLOSUM62, PAM250, Gonnet 등) 및 갭-페널티, 예를 들면, 기능성 형태 및 상수에 따라 상이한 값을 가질 수 있다.
정렬을 이루면서, 2개의 서열 사이의 동일성 백분율을 계산하는 다수의 상이한 방법들이 존재한다. 예를 들면, 한 방법은 (i) 가장 짧은 서열의 길이; (ii) 정렬의 길이; (iii) 서열의 평균 길이; (iv) 갭이 없는(non-gap) 위치의 수; 또는 (iv) 오버행을 제외한 등가(equivalenced) 위치의 수로 동일성의 수를 나눌 수 있다. 또한, 동일성 백분율은 또한 매우 길이-의존적임이 이해될 것이다. 그러므로, 한 쌍의 서열이 짧을수록 우연히 발생하는 것으로 기대될 수 있는 서열 동일성이 높아진다.
따라서, 아미노산 또는 핵산 서열의 정확한 정렬은 복잡한 프로세스임이 이해될 것이다. 대중적인 다중 정렬 프로그램 ClustalW[48,49]는 본 발명에 따라 단백질 또는 DNA의 다중 정렬을 생성하기 위한 바람직한 방법이다. ClustalW에 적합한 파라미터는 하기와 같을 수 있다: DNA 정렬의 경우: 갭 개방 페널티 = 15.0, 갭 연장 페널티 = 6.66 및 매트릭스 = 동일성. 단백질 정렬의 경우: 갭 개방 페널티 = 10.0, 갭 연장 페널티 = 0.2, 매트릭스 = Gonnet. DNA 및 단백질 정렬의 경우: ENDGAP = -1 및 GAPDIST = 4. 당해 분야 숙련가는 최적 서열 정렬을 위해 이들 및 다른 파라미터를 변화시킬 필요가 있음을 인지할 것이다.
바람직하게는, 2개의 아미노산/뉴클레오타이드/펩타이드 서열 사이의 동일성 백분율의 계산은 (N/T)*100으로서 이러한 정렬로부터 계산될 수 있고, 여기서, N은 서열이 동일한 잔기를 공유하는 위치의 수이고, T는 갭을 포함하지만 오버행을 제외하는 비교된 총 위치 수이다. 따라서, 2개의 서열 사이의 동일성 백분율을 계산하기 위한 가장 바람직한 방법은 (i) 예를 들면, 상기 제시된 바와 같은 적합한 파라미터들의 세트를 이용하여 ClustalW 프로그램을 사용하여 서열 정렬을 준비하는 단계; 및 (ii) N 및 T의 값을 하기 식에 삽입하는 단계를 포함한다: 서열 동일성 = (N/T)*100.
유사한 서열을 동정하기 위한 대안의 방법은 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들면, 실질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열은 엄격한(stringent) 조건 하에 제1 양상에 따른 펩타이드, 또는 이의 기능성 단편 또는 기능성 변이체 또는 이들의 상보체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하는 서열일 것이다. 엄격한 조건은 뉴클레오타이드가 약 45℃에서 3x 염화 나트륨/시트르산 나트륨(SSC)의 필터-결합된 DNA 또는 RNA에 하이브리드화한 후, 약 20 내지 65℃에서 0.2x SSC/0.1% SDS로 적어도 1회 세척함을 의미한다. 대안으로, 실질적으로 유사한 펩타이드는 서열번호 9 내지 서열번호 69에 나타낸 서열과 적어도 1개, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 미만의 아미노산이 상이할 수 있다.
유전자 암호의 축퇴성으로 인하여, 본원에 기술된 임의의 핵산 서열은 이에 의해 암호화된 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 서열에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 변하거나 변화되어 이의 기능성 변이체를 제공할 수 있음이 명백하다. 적합한 뉴클레오타이드 변이체는 서열 내에서 동일한 아미노산을 암호화하는 상이한 코돈의 치환에 의해 변경된 서열을 갖고, 따라서, 침묵성(silent) 변화를 생성시키는 변이체이다. 다른 적합한 변이체는 상동성 뉴클레오타이드 서열을 갖지만 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 변이체이고, 이는 아미노산을 치환하는 아미노산에 유사한 생물물리학적(biophysical) 특성의 측쇄를 갖는 아미노산을 암호화하는 상이한 코돈의 치환에 의해 변경되어 보존적 변화를 생성시킨다. 예를 들면, 소형 비-극성, 소수성 아미노산으로는 글리신, 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린 및 메티오닌이 포함된다. 대형 비-극성, 소수성 아미노산으로는 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신이 포함된다. 극성 중성 아미노산으로는 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴 및 글루타민이 포함된다. 양으로 하전된 (염기성) 아미노산으로는 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이 포함된다. 음으로 하전된 (산성) 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함된다. 따라서, 어떤 아미노산이 유사한 생물물리학적 특성을 갖는 아미노산으로 대체될 수 있는지 이해될 것이고, 그리고 숙련된 기술자는 이들 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 인지할 것이다.
본원에 기술된 모든 특징(첨부된 청구범위, 요약 및 도면 포함) 및/또는 개시된 임의의 방법 또는 프로세스의 모든 단계는 이러한 특징 및/또는 단계 중 적어도 일부가 상호 배타적인 조합을 제외하고는 임의의 조합으로 상기 양상들 중 임의의 양상과 조합될 수 있다.
실시예
실시예에 기술된 연구에서 사용된 재료 및 방법은 달리 나타내지 않는 한 하기와 같았다:
마우스
6 내지 8주령 수컷 및 암컷 BALB/c, C57BL/6, 및 TLR2-결핍 C57BL/B6.129-Tlr2tm1Kir/J(TLR2-/-) 마우스, 및 노령의 C57Bl/6 마우스(16개월 이상)는 Jackson Laboratory로부터 구입하였다. 뉴질랜드 흰 토끼 및 8주령 비-비만 당뇨병(NOD) 마우스를 Charles River Laboratories로부터 구입하였다. 동물들은 실험 시간 동안 Institute Abel Salazar의 동물 시설에 보관되었다. 모든 절차는 실험적 및 기타 과학적 목적(ETS 123) 및 86/609/EEC 지침 및 포르투갈어 규칙(Directive and Portuguese rules)(DL 129/92)에 사용된 척추 동물 보호를 위한 유럽 협약(the European Convention)에 따라 수행되었다. 모든 동물 실험은 동물의 고통을 최소화하도록 계획되었다.
세균
본 연구에 사용된 세균은 하기 표 4에 열거된다. 모든 스트레인은 감염된 신생아로부터 수득된 임상학적 단리물이었다. 이. 콜라이, 에스. 아우레우스, 피. 아에루기노사, GBS 및 에스. 뉴모니애는 프랑스 파리의 Pasteur Institute의 Patrick Trieu Cuot 교수에 의해 친히 제공되었고; 케이. 뉴모니애 및 엔. 메닝기티디스는 포르투칼 포르토의 Hospital Geral de Santo Antonio의 미생물학 부서에 의해 제공되었다. GBS 및 에스. 뉴모니애는 0.001mg/mL의 콜리스틴 설페이트 및 0.5㎍/mL의 옥살산(스트렙토코커스 선택성 보충제, Oxoid)을 함유하는 토드-휴이트(Todd-Hewitt) 브로쓰(broth) 또는 한천(Difco Laboratories)에서 성장되었다. 이. 콜라이, 피. 아에루기노사, MenB 및 에스. 아우레우스는 토드-휴이트 브로쓰 또는 한천 배지에서 배양하였다. 세균은 37℃에서 성장되었다.
Figure pat00017
항체 치료
GBS 감염 12h 전의 신생 BALB/c 마우스(48h령까지)에서, 그리고 GBS 감염 24h 전의 노령의 C57Bl/6 마우스(16개월 이상) 및 NOD 마우스에서 항체 치료를 수행하였다. 수동 면역화의 경우, 새끼에게 100㎍의 항-rGAPDH IgG 항체를 복강내 주사하였다. 대조군 동물은 동일량의 대조군 IgG 항체를 투여받았다. IL-10 신호전달 차단의 경우, 100㎍의 항-IL10R 항체(1B1.3a, Schering-Plough Corporation)를 복강내 투여하였고, 대조군 동물은 동일량의 매칭된 이소타입 대조군 항체를 투여받았다. 항-GAPDH 항체의 치료학적 사용에 관련하여, 감염 6h 후 100㎍의 항-GAPDH IgG(또는 각각의 대조군 IgG)로 마우스 새끼를 치료하였다.
세균성 감염의 신생 마우스 모델
신생(48h령), BALB/c, C57BL/6 야생형 또는 TLR2-/- 마우스를 40㎕의 최대 체적으로의 명시된 세균 접종물로 피하 감염시켰다. 신생아는 전체 실험 기간 동안 이들의 모체와 함께 수용되었다. 생존 곡선은 12-일 실험 기간에 걸쳐 측정되었다.
rGAPDH
rGAPDH는 이전에 기술된 바와 같이 생산하고 정제하였다[41].
항-GAPDH IgG의 정제
성체 마우스 또는 토끼를 PBS/명반 현탁액 중의 25㎍의 rGAPDH를 이용하여 투약간 3주 간격으로 2회 면역화하였다. 제2 면역화 10일 후에 혈청을 수집하였다. 풀링된 혈청 샘플을 단백질 G HP 친화성 컬럼(HiTrap, GE Healthcare Bio-Sciences AB)에 가하였고, 이어서, 정제된 IgG 항체를 고정화된 rGAPDH를 갖는 친화성 컬럼(HiTrap, NHS-활성화된 HP, GE Healthcare Bio-Sciences AB)을 통해 통과시켰다. PBS/명반 현탁액을 이용하여 샴 면역화된 마우스 또는 토끼의 혈청으로부터 대조군 IgG를 수득하였고 단백질 G HP 친화성 컬럼 상에서 정제하였다. 정제된 IgG 항체 분획을 PBS 중에서 추가로 평형화시켰고 동결된 분취물로 -80℃에서 보관하였다.
비장 총 세포 배양물
신생 마우스(최대 48h령)의 비장 유래의 세포는, 페니실린(100IU/㎖), 스트렙토마이신(50㎍/ml), 2-ME(0.05M), 및 10% 태아 소 혈청(FBS)(Sigma-Aldrich) - 완전 RPMI(cRPMI)가 보충된 RPMI 1640에서 상기 장기를 약하게 티징(teasing)함으로써 수득하였다. 이어서, 세포를 96-웰 플레이트(1x106 세포/웰)에 분배하였고, 5% 이산화탄소를 함유하는 습윤화된 대기의 37℃에서 12h 동안 배지 단독, 2.5㎍/ml LPS를 함유하는 배지, 25㎍/ml의 rGAPDH를 함유하는 배지, 1㎍/mL의 TLR2 효능제(agonist)인 PAM3CSK4(Invivogen)를 함유하는 배지와 함께 배양하였다. TLR 억제제를 이용한 실험의 경우, OxPAC(TLR2 억제제) 및 CLI095(TLR4 억제제)(둘 다 Invivogn)를 10㎍/mL의 농도로 사용하였다.
B 세포 정제
제조업자의 지침에 따라서 마우스 B 세포 정제 키트(Miltenyi Biotech)를 이용한 자성 세포 분류(magnetic cell sorting)에 의해 (상기 언급된 바와 같이 제조된) 신생 마우스의 비장으로부터 B 세포를 정제하였다.
CD5+ B 세포 정제
제조업자의 지침에 따라서 마우스 B1 세포 정제 키트(Miltenyi Biotech)를 이용한 자성 세포 분류에 의해 (상기 언급된 바와 같이 제조된) 신생 마우스의 비장으로부터 B1 세포를 정제하였다.
신생아 간-유도된 대식세포
1일령 마우스의 간으로부터 대식 세포를 수득하였다. 무균 조건 하에 간을 제거하였고, 행크스(Hank's) 평형화 염 용액(HBSS)에서 균질화시켰다. 얻어진 세포 현탁액을 500xg로 원심분리하고, 10% L929 세포 조건화된 배지가 보충된 cRPMI에 재현탁시켰다. 섬유아세포 또는 분화된 대식세포를 제거하기 위해, 세포를 세포 배양 접시 상에서 5% 이산화탄소 대기의 37℃에서 밤새 배양하였다. 이어서, 비-부착성 세포를 온난한 cRPMI로 수집하였고, 500xg로 원심분리하였고, 1 x 105 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 분배하였고, 5% 이산화탄소 대기의 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 식종 4일 후, L929 세포 조건화된 배지 10%를 첨가하였고, 배지를 7일째에 보충(renew)하였다. 배양 10일 후, 세포는 대식세포로 완전히 분화되었다. 이 방법은 이들 식균 세포의 형태학적, 생리학적 및 표면 마커 특성을 유지하는 대식세포의 균일한 1차 배양물의 분화를 가능하게 한다[50].
신생아 간-유도된 수지상 세포
1일령 마우스의 간으로부터 수지상 세포를 수득하였다. 무균 조건 하에 간을 제거하였고, HBSS에서 균질화시켰다. 얻어진 세포 현탁액을 500xg로 원심분리하고, 30ng/ml의 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF)(Immunotools)(1차 DC 배지)가 보충된 cRPMI에 재현탁시켰다. 섬유아세포 또는 분화된 대식세포를 제거하기 위해, 세포를 세포 배양 접시 상에서 5% 이산화탄소 대기의 37℃에서 밤새 배양하였다. 3일째, 배지의 75%를 (비-부착성 세포와 함께) 제거하였고, 1차 DC 배지를 첨가하였다. 6일째, 플레이트 바닥에 대해 배지를 상하로 약하게 피펫팅(pipetting)하여 약하게 비-부착성 세포를 격퇴시킴으로써 플레이트로부터 세포를 제거하였다. 이의 수분 후, 세포 혼합물을 50mL 폴리스티렌 튜브에 이동시켰다. 이어서, 세포를 온난한 500xg로 5 내지 7분 동안 원심분리하였고, 1차 DC 배지 중에 재현탁시켰다. 세포를 계수하였고 5 x 105 세포/웰의 농도로 플레이팅하였다. 공동-배양 실험의 경우, 웰당 5 x 104 수지상 세포를 플레이팅하였다. 공동-배양 실험에서, 그리고 명시된 경우, I형 인터페론 수용체(항-IFNAR)(Biolegend)에 대해 특이적인 20㎍/mL의 모노클로날 항체를 사용하였다.
혈액 호중구의 정제
호중구 단리를 위해, 신생아 마우스(48h령까지)의 후안와(retro-orbital) 출혈로부터 혈액을 수집하고, BSA(0.1% w/v) 및 글루코스(1% w/v)를 함유하는 HBSS에서 1:2로 희석시켰다. 세포를 펠렛화하였고, 저장성 용해(hypotonic lysis)에 의해 적혈구를 제거하였다. 혈액 조제를 둘베코 PBS(GIBCO)에 현탁시켰고, 3층 Percoll(GE-Healthcare) 농도구배(둘베코 PBS 중의 80, 65, 및 55%)로 층상화(layered)하였고, 10℃에서 30분 동안 1200xg로 원심분리하였다. 성숙한 호중구는 65 및 80% 분획의 계면에서 회수되었고 항-Ly6G 항체(Biolegend)를 사용하여, FACS 분석에 의해 측정시 순도는 85%였다. 단리된 호중구를 96-웰 플레이트에 플레이팅하였고, 명시된 바와 같이 12h 동안 자극하였다.
IL-10 정량화
제조업자의 지침에 따라, 신생아 또는 성체 세포 배양물 유래의 IL-10을 ELISA(R&D Systems)에 의해 정량하였다.
사람 혈액 샘플
사람 혈액 샘플은 정보공개 승인 후 Hospital Geral de Santo Antonio에서 수득하였다. 단핵 세포의 단리를 위해, RPMI 1640에서 1:2로 희석한 총 혈액의 5ml 분취량을 Histopaque(Sigma-Aldrich) 2.5ml에 층상화하였고 실온에서 20분 동안 1000g로 원심분리하였다. 이어서, 세포를 배지-Histopaque 계면으로부터 약하게 제거하였고, 멸균 컨테이너에 이동시켰고, 10ml의 cRPMI로 세척하였다. 단리된 단핵구 세포를 cRPMI에 재현탁시켰고, 5 x 106 세포/웰의 농도로 플레이팅하였고, 25㎍/mL의 rGAPDH로, 10㎍/mL의 OxPAC로, 또는 배지 단독(RPMI)로 5% 이산화탄소의 37℃에서 12h 동안 자극하였다.
신생아 백신
펩타이드 1 내지 펩타이드 4(서열번호 9 내지 12)를 담체 단백질로서 KLH 또는 OVA와 접합시켰다. 면역화 프로토콜을 위해, 담체 단백질과 접합된 각각의 펩타이드의 20㎍을 암컷 BALB/c 마우스에 복강내 주사하였다. 명반은 1:20 PBS 현탁액 중의 항원 보강제로서 사용되었다. 성체 암컷 BALB/c 마우스를 투약간 3주 간격으로 3회 면역화시켰다. 마지막 면역화 10일 후에, 혈액을 수집하였고, 4℃에서 24시간 동안 응혈 후 "신생아 백신" 항-혈청을 얻었다.
동일한 면역화 프로토콜을 엔. 메닝기티디스 연구를 위해 래트에 사용하였다(실시예 8).
실시예 1 - 신생아 B 세포의 서브-집단은 세균성 GAPDH 자극시 IL-10 생산에 관여한다
이전의 공개된 정보는 신생아 면역계가 GAB 감염을 방지하는 것을 불가능하게 하는 GAPDH의 역할을 밝혔다[24]. IL-10에 대한 역할은 GAPDH-유도된 면역억제의 메커니즘에서 이미 밝혀져 있지만, 세포 메커니즘은 미지로 남아있다. 어떠한 세포 집단(들)이 신생아 GBS 감염에서 관찰된 조기 IL-10 생산에 기여하고 있었는지를 밝히기 위해서, 신생아 마우스로부터 상이한 백혈구 집단을 정제하였고, GBS로부터의 rGAPDH로 시험관내 치료하였다.
재료 및 방법
구체적으로, 그리고 상기 기술된 바와 같이, 수지상 세포 및 대식세포는 신생아 간 전구체로부터 수득되었고, B 세포 및 단핵구 세포는 신생아 비장으로부터 수득되었고, 호중구 신생아 말초혈로부터 정제되었다. CD5의 표면 발현에 기초한 신생아 비장으로부터 수득된 B 세포의 보다 정제된 분리는 B1 (CD5+) 세포의 분리를 가능하게 하였다.
상이한 백혈구 집단은 5% 이산화탄소의 37℃에서 12h 동안 0.5㎍/mL의 LPS(양성 대조군으로서; LPS는 폴리클로날 B 세포 활성화를 유도하는 것으로 공지되어 있는 구조적 미생물 항원이다), 25㎍/mL의 rGAPDH 또는 RPMI 배지 단독(음성 대조군으로서)으로 시험관내 자극하였다. 2.5 × 105 세포/웰을 사용한 분리된 B 세포 연구를 제외한 모든 조건에서, 5 × 105 세포/웰을 사용하였다.
세포의 인큐베이션 후, IL-10 농도는 상기 기술된 바와 같은 상청에서 측정하였다.
각각의 경우에 적어도 2회의 독립적 실험을 수행하였다.
결과
도 4a에서 관찰되는 바와 같이, GAPDH 자극시 IL-10을 생산하는 단핵구 세포, 호중구, 대식세포, 수지상 세포 및 총 B 세포의 능력을 비교하는 경우, 단지 B 세포만이 유의한 양의 IL-10을 생산하는 능력을 보유하였다.
신생아 B 세포의 분리 후, 본 발명자들은 B1 세포가 IL-10을 생산하는 능력을 보유하였고, 한편, B2 세포는 이러한 사이토카인의 단지 미량만을 생산하였음을 관찰하였다(도 4b).
논의
이러한 연구는 신생아 B1 세포가 세균성 PAPDH 자극시 IL-10의 주요 공급원임을 나타낸다.
실시예 2 - TLR2는 세균성 GAPDH에 대한 표면 수용체이다
세균성 GAPDH 인식 및 IL-10 발현의 유도에 관여하는 세포 수용체를 확립하기 위해서, 본 발명자들은 상이한 패턴의 인식 수용체들의 특이적 억제제의 존재시 정제된 B1 세포의 배양물에서 IL-10 생산을 유도하는 GAPDH의 능력을 비교하였다.
재료 및 방법
B1 세포는 상기 기술된 바와 같이 신생 마우스의 비장으로부터 정제되었다.
5% 이산화탄소의 37℃에서 12h 동안 10㎍/mL의 TLR2 또는 TLR4의 존재시 2.5 ×105 B1 세포/웰을 25㎍/mL의 rGAPDH로 시험관내 자극하였다. 사용된 TLR2 및 TLR4 억제제는 각각 OxPAC 및 CLI095이었다.
세포의 인큐베이션 후, 상기 기술된 바와 같이 상청액에서 IL-10을 정량화하였다.
적어도 2회의 독립적 실험을 수행하였다.
결과
본 발명자들은 GAPDH-유도된 IL-10 생산이 TLR2 억제제의 존재시 완전히 폐지되었음을 발견하였다(도 5).
논의
이러한 결과는 세균성 GAPDH가 TLR2를 통해 B1 세포에 대해 작용하여 IL-10 생산을 유도함을 나타낸다.
실시예 3 - TLR2 결핍은 신생아 생존을 향상시키고 세균성 패혈증에 대한 보호를 부여한다
이러한 연구는 GAPDH에 대한 수용체로서의 TLR2의 중요성 및 패혈증에 대한 신생아 감수성에 대한 원인을 확인하는 것을 목표로 하였다.
재료 및 방법
출생 48시간 후, 신생아 야생형 및 TLR2-/- 마우스를 5 ×105 CFU의 에스. 아우레우스 스트레인 NEWMAN으로 또는 500 CFU의 이. 콜라이 스트레인 IHE3034로 피하 감염시켰다. 감염 후 마우스의 생존은 1일 기준으로 모니터링하였다.
적어도 2회의 독립적 실험을 수행하였다.
결과
야생형 마우스는 감염-후 48시간 초과시 명시된 세균으로의 감염에 대해 생존할 수 없었다(도 7). 대조적으로, 대다수의 TLR2-/- 마우스는 감염 12일 후에도 여전히 살아있었다.
논의
결과는 TLR2-결핍 신생아 마우스가 야생형 마우스에 비하여 이. 콜라이 및 에스. 아우레우스로의 챌린징 감염에 대한 생존을 증가시켰음을 보여준다. 따라서, TLR2는 패혈증에 대한 신생아 감수성에 있어서 중요한 역할을 하고; 즉, TLR2 결핍은 신생아 생존을 향상시키고 세균성 패혈증에 대한 보호를 부여한다. 따라서, 실시예 2에서 얻어진 결과에 추가하여, 이들 데이터는 패혈증-유도성 세균의 상이한 패혈증에 걸쳐 GAPDH에 대한 수용체로서의 TLR2의 중요성을 확인시켜준다.
실시예 4 - 세균에 의해 유도된 수지상 세포에 의한 I형 인터페론 생산은 GAPDH와 상승작용하여 B1 세포에 대한 IL-10 생산을 증가시킨다
이러한 연구는 B1 세포가 다른 백혈구 집단에 의한 GAPDH 인식시 IL-10 생산을 보조하는지 여부 및 어떠한 자격인지를 확인하는 것을 목표로 하였다.
재료 및 방법
총 비장 세포는 신생 마우스로부터 수득되었고, B1 세포는 상기 기술된 바와 같이 총 비장 세포 집단으로부터 정제되었다.
상이한 비장 세포 집단은 5% 이산화탄소의 37℃에서 12h 동안 25㎍/mL의 rGAPDH, 107 세포의 이소프로판올에 고정된 GBS(GBSf)로 또는 RPMI 배지 단독으로 시험관내 자극하였다. 2.5 × 105 세포/웰을 사용한 정제된 B1 세포 연구를 제외한 모든 조건에서, 5 × 105 세포/웰을 사용하였다.
수지상 세포는 상기 기술된 바와 같이 태아 간으로부터 유도되었다. 수지상 세포는 2.5 × 105의 신생아 비장으로부터 정제된 B1 세포와 함께 1:10의 비로 공동-배양하였고, 5% 이산화탄소의 37℃에서 12h 동안 25㎍/mL의 rGAPDH, 107 세포의 GBSf, 20㎍/mL의 항-IFNAR로 또는 RPMI 배지 단독으로 자극하였다.
상이한 세포 유형의 인큐베이션 후, IL-10 농도는 상기 기술된 바와 같은 상청에서 정량화하였다.
각각의 경우에 적어도 2회의 독립적 실험을 수행하였다.
결과 & 논의
총 비장 세포에서의 IL-10 생산을 유도하는 GAPDH의 능력은 고정된 세균의 존재시에 강하게 증가되었다(도 6a). 그럼에도 불구하고, 이러한 효과는 정제된 B1 세포에서는 상실되었고, 여기서, 고정된 세균을 첨가하는 것은 GAPDH에 의해 유도되는 IL-10 생산을 증가시키지 않았다(도 6b).
이러한 결과는 B1 세포 이외의 다른 백혈구 집단(들)이 세균성 항원에 의해 자극되고 B1 세포가 GAPDH 인식시 IL-10을 생산하는 것을 보조한다는 것을 나타낸다.
공동-배양 연구는 IL-10을 생산하는 B1 세포의 영향에서 백혈구의 다른 서브-집단의 역할에 대한 이해를 가능하게 했다. 본 발명자들은 수지상 세포의 존재 하에 B1 세포가 GAPDH + GBSf와 동시에 자극될 때 상승된 양의 IL-10을 생산하였음을 관찰하였다(도 6c). 흥미롭게도,이 효과는 I형 인터페론 신호전달이 차단되었을 때 폐지되었다(도 6c).
이러한 결과는, 세균 인식시 수지상 세포가 GAPDH와 자극된 B1 세포에서 IL-10 생산을 증가시키는 I형 인터페론을 생산한다는 것을 나타낸다.
실시예 5 - 조기 IL-10 생산은 신생아 숙주를 콜로니화하기 위해 패혈증-유도성 세균에 의해 사용되는 일반적인 메커니즘이다
많은 양의 IL-10을 생산하는 능력은, GBS 감염에 대한 신생아의 감수성의 주요 원인인 것으로 입증되었다[24]. 본 연구는 GBS 이외의 세균, 특히 이. 콜라이 또는 에스. 아우레우스에 의해 야기되는 신생아 감염에서 동일하게 발생하는지를 조사하는 것으로 목표로 하였다. GBS, 이. 콜라이 및 스태필로코커스 종과 함께, 사람 신생아에서의 패혈증 사례의 최대 87%에 관여한다.
본 연구는 또한 다른 세균도 신생아 숙주를 콜로니화하기 위해 패혈증-유도성 세균에 의해 사용되는 일반적인 IL-10-의존적 메커니즘의 지표로서 세포외 GAPDH를 갖는지를 조사하는 것을 목표로 하였다.
재료 및 방법
이하와 같이 이. 콜라이 또는 에스. 아우레우스로의 챌린지 전에 신생아 마우스를 마우스 IL-10 수용체에 대해 특이적인 차단 항체(항-IL10R)로 치료하였다.
상기 기술된 바와 같이 신생아 마우스에게 100㎍의 항-IL10R 모노클로날 항체 또는 100㎍의 이소타입 대조군 IgG를 복강내 주사하였다. 12h 후, 마우스에게 500CFU의 이. 콜라이 스트레인 IHE3034로 또는 5 X 105 CFU의 에스. 아우레우스 스트레인으로 피하 챌린지하였다. 감염 후 마우스의 생존은 1일 기준으로 모니터링하였다.
3회의 독립적인 실험을 수행하였다.
다른 패혈증-유도성 병원체도 세포외 GAPDH를 갖는지 조사하기 위해, 하기와 같이 목적하는 병원체의 배양 상청액으로부터의 세포외 단백질을 수득하였고, SDS-PAGE에 의해 분리하였고, 항-rGAPDH 항체를 이용한 웨스턴-블롯에 의해 분석하였다.
GBS 스트레인 NEM316, P. 아에루기노사, 에스. 뉴모니애, 에스. 아우레우스 및 이. 콜라이의 배양물을 상기 기술된 바와 같이 조제하였고, 표준 절차에 따라 상기 배양 상청액으로부터 세포외 단백질을 정제하였다. 상기 기술된 바와 같은 rGAPDH-면역화된 토끼로부터 얻어진 항-rGAPDH 항체(IgG)를 이용하여 표준 절차에 따라 SDS-PAGE 및 웨스턴-블롯 분석을 수행하였다. rGAPDH를 양성 대조군으로서 사용하였다.
5회의 독립적 실험을 수행하였다.
이들 병원체가 또한 병독성 메커니즘으로서 GAPDH 분비를 사용하는지 여부를 평가하기 위해 이들 세균에 의해 분비된 GAPDH를 중화시키는 효과를 다음과 같이 조사하였다.
마우스 새끼에게 상기 기술된 바와 같이 80㎍의 항-rGAPDH 항체(IgG) 또는 80㎍의 대조군 IgG를 복강내 주사하였다. 12h 후, 5 x 106 CFU의 에스. 뉴모니애 스트레인 Tigr4, 500 CFU의 이. 콜라이 스트레인 IHE3034 또는 5 x 105 CFU의 에스. 아우레우스 스트레인 NEWMAN을 피하로 챌린지하였다. 감염 후 마우스의 생존을 1일 기준으로 모니터링하였다.
2회의 독립적 실험을 수행하였다.
결과
흥미롭게도, IL-10 신호전달의 차단은, 이소타입-매칭된 대조군 항체를 투여받은 새끼와 비교하는 경우, 이. 콜라이 및 에스. 아우레우스에 의해 야기된 감염에 대한 신생아의 생존율을 유의하게 개선시켰다(도 8).
다른 패혈증-유도성 세균도 세포외 GAPDH를 보유하는 것으로 밝혀졌다(도 9). 항-rGAPDH 항체를 이용한 이러한 분비된 GAPDH의 중화는 에스. 뉴모니애, 이. 콜라이 및 에스. 아우레우스에 의한 감염으로부터 신생 마우스를 보호하는 것으로 밝혀졌다(각각 도 10a 내지 도 10c).
논의
결과는 GBS-유도된 패혈증에 대한 신생아의 감수성에 대해 관찰된 메커니즘이 다른 패혈증-유도성 세균에 대해 횡단성(transversal)임을 나타낸다. 이. 콜라이 및 에스. 아우레우스에 의해 야기된 신생아 감염에 대한 IL-10 데이터가 본원에 제공되지만, 다른 세균도 GAPDH를 분비한다는 사실은 신생아가 세균성 GAPDH에 반응하여 다량의 IL-10을 생산하는 경향은 패혈증의 발병을 유도하는 상이한 세균성 병원체에 의해 사용되는 전면적 메커니즘이다. 이 결과는 GBS에 대한 GAPDH-기반 백신이 다른 패혈증-유도성 세균에 대해서도 실행가능할 것이라는 사실을 입증한다.
실시예 6 - GAPDH-유도된 IL-10 생산은 사람 세포에 보존된 메커니즘이다
본 연구는 사람 세포가 또한 GAPDH에 반응하여 IL-10을 생산하는지를 조사하는 것을 목표로 하였다.
재료 및 방법
단핵구 세포는 상기 기술된 바와 같이 사람 제대혈 또는 성인 말초혈로부터 분리되었다.
상기 세포는 5% 이산화탄소의 37℃에서 12h 동안 25㎍/mL의 rGAPDH, 10㎍/mL의 OxPAC(TLR2 억제제) 또는 RPMI 배지 단독으로 시험관내 자극하였다.
세포의 접종 후, IL-10은 상기 기술된 상청액에서 정량화되었다.
적어도 2회의 독립적인 실험을 수행하였다.
결과
신생 마우스에서 관찰된 것과 일치하여, rGAPDH로의 사람 제대혈 또는 성인 말초혈로부터 정제된 단핵구 세포의 자극은 다량의 IL-10의 생산을 유도하였다(각각 도 11a 및 도 11b).
흥미롭게도, 사람 백혈구에서의 GAPDH-유도된 IL-10 생산은 TLR2 억제제의 존재 하에 완전히 폐지되었다.
논의
이러한 결과는 마우스 세포에서의 GAPDH에 의해 유도된 IL-10 생산을 위한 메커니즘이 사람에 대해서도 적용됨을 나타낸다.
또한, 마우스에서 연구된 동일한 병독성 메커니즘이 사람에게 쉽게 적용될 수 있다는 사실은 사람에서의 세균성 패혈증을 연구하기 위한 우수한 모델로서의 마우스의 사용을 강력하게 지지한다.
실시예 7 - 신생아 백신의 생산
세균성 GAPDH에 반응하여 다량의 IL-10을 생산하는 신생아의 경향이 상이한 세균성 병원체에 의해 사용되는 전면적 메커니즘이라는 이들의 발견에 기초하여, 본 발명자들은 항원으로서 GAPDH-유도된 펩타이드를 이용하여 이러한 병원체에 대한 백신을 생산하는 것을 제시한다.
재료 및 방법
신생아 백신은 상기 기술된 바와 같이 조제하였다.
결과
본 발명의 백신은 사람 GAPDH에 존재하지 않는 아미노산 서열을 갖는 상이한 패혈증-유도성 세균으로부터의 GAPDH의 표면 펩타이드로 구성된다. 이와 같이, 본 발명자들은 사람 GAPDH에 의해 공유되지 않는 미생물 GAPDH의 보존된 서열에 속하는 펩타이드로 구성된 백신을 개발하였다.
도 2는 상기 방법 및 각각의 아미노산 서열을 갖는 각각의 세균을 사용하여 본 연구에서 발견된 4개의 예시적인 펩타이드의 아미노산 서열을 확인하는 표를 포함한다. 하기 표는 상이한 세균성 GAPDH에서 동일한 4개의 펩타이드의 표면 국소화를 보여주는 이미지이다.
도 3은 펩타이드 중 2개(도 2 및 도 3의 펩타이드 1 및 펩타이드 2로서 확인됨)가 사람에서가 아니라 소정 세균 종에서 보존되는 아미노산 서열을 갖는 방법을 도시한다.
도 12 및 도 13은 이. 콜라이 및 피. 아에루기노사(도 2의 각각 펩타이드 3과 펩타이드 4로 식별됨)가 사람에게서 발견되지 않는 (세균 보존된) 아미노산 서열을 갖는 방법을 도시한다.
펩타이드 1 내지 펩타이드 4는 본원에서 신생아 백신으로 지칭되는 본 발명의 바람직한 백신의 제조에 병용하여 사용되었다. 따라서, 신생아 백신은 도 2의 표에 열거된 모든 세균에 대해 사용하기에 적합하다.
그러나, 펩타이드 1 내지 펩타이드 4는 단지 예이고; 즉, 본 발명의 백신에 사용하기에 적합한 다른 펩타이드는 상기 제시된 바와 동일한 방법으로 서열 정렬에 의해 동정될 수 있다. 언급된 병원체의 GAPDH로부터의 임의의 다른 아미노산 서열을 사용할 수 있다. 그러나, 본원에 설명된 바와 같이, 자가면역 병리학을 회피하기 위해 사람에서도 발견되는 임의의 서열을 회피하는 것이 바람직하다.
본원에 기술된 바와 같이, 임의의 수의 펩타이드가 신생아 백신의 펩타이드 1 내지 펩타이드 4 대신에 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 백신을 구성하는 펩타이드의 수 및 동일성은 다양할 수 있다.
논의
본원에서 설명된 바와 같이, 세균성 GAPDH는 신생아 및 면역약화된 숙주에서 면역 억제를 야기하고 세균성 패혈증을 촉진시키는 역할을 한다. 따라서, 본 실시예에 기술된 특정 신생아 백신을 포함하는 본원에 기술된 백신은 GBS, 이. 콜라이, 스태필로코커스 종, 에스. 뉴모니애, 케이. 뉴모니애, 및 슈도모나스 종에 의해 야기되는 감염으로부터 감수성이 있는 숙주(신생아, 노인 및 다른 면역약화된 개체를 포함함)를 보호하도록 지시된다. 본 발명자들이 고려한 접근법은 사람 GAPDH에 존재하지 않는 이의 GAPDH의 표면-노출된 펩타이드를 선택함으로써 임의의 패혈증-유도성 세균에 대해 본 발명의 백신을 "테일러(tailor)"할 가능성을 허용한다.
실시예 8 - 신생아 백신으로 유발된 항체는 세균성 GAPDH와 반응한다
본 연구는 실시예 7에서 생산된 백신이 세균성 GAPDH를 인식하는 항체를 생산하는데 사용될 수 있음을 보여주는 것을 목표로 하였다.
재료 및 방법
마우스 및 래트를 상기 기술된 바와 같이 신생아 백신으로 면역화하였다.
GBS 스트레인 NEM316, 피. 아에루기노사, 에스. 뉴모니애, 에스. 아우레우스, 이. 콜라이, 케이. 뉴모니애 및 MenB의 배양물을 상기 기술된 바와 같이 조제하였고, 세포외 단백질은 표준 절차에 따라 배양 상청액으로부터 정제되었다. SDS-PAGE 및 웨스턴-블롯 분석은 상기 기술된 바와 같이 rGAPDH-면역화된 마우스 및 래트로부터 수득된 항-GAPDH 항체(IgG)를 이용하여 표준 절차에 따라 수행하였다. rGAPDH는 양성 대조군으로서 사용되었다.
2회의 독립적인 실험을 수행하였다.
결과
도 14 내지 도 16에 나타낸 바와 같이, 신생아 백신으로 면역화된 마우스 및 래트로부터 정제된 항체는 상이한 세균으로부터의 세포외 GAPDH와 반응한다.
도 15(케이. 뉴모니애로부터의 결과를 보여줌)는 신생아 백신으로 유발된 항-GAPDH 항체에 의해 인식되는 2개의 밴드를 나타낸다. 흥미롭게도, 약 45KDa의 밴드는 GBS GAPDH와 정확히 동일한 분자량에 해당한다. 다른 밴드(약 35KDa)는 케이. 뉴모니애 GAPDH의 예측된 분자량(http://www.uniprot.org/uniprot/C4X7S6)에 해당한다.
도 16(MenB로부터의 결과를 보여줌)은 약 37kDa의 밴드를 나타내고, 이는 MenB GAPDH의 예측된 분자량에 해당한다[51].
논의
본 연구는 신생아 백신으로 유발된 항체가 GBS 스트레인 NEM316, 피. 아에루기노사, 에스. 뉴모니애, 에스. 아우레우스, 이. 콜라이, 케이. 뉴모니애 및 MenB로부터의 GAPDH를 인식함을 보여준다. 따라서, 이들 데이터는 세균성 펩타이드 서열이 공통적으로 세균성 GAPDH를 인식하는 백신에 사용될 수 있다는 개념 증명(proof-of-concept)을 제공한다.
엔. 메닝기티디스의 혈청형 B만이 본원에서 시험되었지만, 이 세균의 다른 모든 혈청형에 대해서도 유사한 결과가 예상될 수 있다. 이와 관련하여, 엔. 메닝기티디스의 상이한 혈청형으로부터의 GAPDH는 상동성(97.668%)을 공유하고(http://www.uniprot.org/align/A20150610146R80D4XR), 따라서, 신생아 백신으로 유발된 항체는 이들 모두로부터의 GAPDH를 인식할 것으로 기대될 수 있다. 결과적으로, 본원에 기술된 백신은 엔. 메닝기티디스의 모든 혈청형에 유리한 것으로 여겨진다.
도 15에 예시된 결과는 흥미롭게도 케이. 뉴모니애가 GAPDH의 2개의 이소형을 가질 수 있음을 보여준다.
실시예 9 - 신생아 백신은 신생아를 GBS 감염으로부터 보호한다
본 연구는 실시예 8에서 생산된 항체가 신생 마우스를 GBS 감염으로부터 보호하는데 사용될 수 있음을 보여주는 것을 목표로 하였다.
재료 및 방법
마우스 새끼에게 상기 기술된 바와 같이 80㎍의 신생아 백신-유도된 IgG 또는 80㎍의 대조군 IgG를 복강내 주사하였다. 12h 후, 마우스에게 5 X 106 CFU의 GBS NEM316을 피하 챌린지하였다. 감염 후 마우스의 생존을 1일 기준으로 모니터링하였다.
2회의 독립적인 실험을 수행하였다.
결과
rGAPDH(전체 단백질)로의 모체 백신접종은 GBS에 의해 야기된 신생아 감염을 예방하는 효율적인 전략임이 이미 입증되었다[24]. 그러나, 신생아 백신으로 유발된 항체가 GBS 감염 전 새끼의 수동 면역화에 사용된 경우, 보호는 보다 더 효과적이었다. 실제로, 신생아 백신으로 부여된 보호는 100%였다(도 17).
논의
이 결과는 신생아 백신(즉, 전체 단백질 대신에 본원에 기술된 바와 같이 선택된 펩타이드 서열을 사용함)을 포함하는 본 발명의 백신을 개발하는데 사용된 새로운 접근법은 이전에 기술된 것과 비교하여 신생아의 면역계를 보다 강력하게 하고 GBS에 의해 예시되는 패혈증-유도성 제제에 대해 특이적인 반응을 지시한다.
이 결과는 또한 신생아 백신에 의해 제공되는 면역력이 재현가능함을 보여 주고(100% 유효), 이는 명백히 유리하다.
이 연구는 GBS 감염만을 관찰하였지만, 다른 패혈증-유도성 세균에 의한 감염시에도 동일한 결과가 관찰될 수 있음이 이해된다(특히 실시예 8은 신생아 백신으로 유발된 항체가 GBS 스트레인 NEM316, 피. 아에루기노사, 에스. 뉴모니애, 에스. 아우레우스, 이. 콜라이, 케이. 뉴모니애 및 엔. 메닝기티디스(MenB에 의해 예시됨)로부터의 GAPDH를 인식함을 보여주기 때문에).
또한, 도 17에 제시된 결과는 신생아 백신으로의 모체 백신접종(또는 따라서 본 발명의 항-GAPDH 항체로의 모체 치료)이 질내 GBS 감염에 의해 야기된 사산 및 조산을 유의하게 감소시킬 것이라는 증거를 제공한다. 실제로, 본 발명의 제12 양상과 관련하여 상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 펩타이드, 단편, 변이체 또는 백신에 대해 생성된 항체는 모체의 태반을 통해 출생전 유아에게 전달될 수 있다. 또한, 도 17에 나타낸 바와 같이 신생아 백신-유도된 항체로 면역화한 후 새끼에게부여된 GBS에 대한 보호는 100%였다.
GBS의 GAPDH와 본원에 기술된 다른 패혈증-유도성 세균 사이의 높은 서열 유사성 및 기능성 상동성으로 인하여, 제시된 데이터는 또한 신생아 백신이 다른 패혈증-유도성 세균에 의해 야기된 사산 및 조산을 효과적으로 예방할 것임을 나타낸다. 세균 감염은 전 세계적으로 연간 대략 650,000명의 사산에 관여하므로 중요한 발견이다[52,53]. 또한, 임신 32주 미만의 조산의 약 50%는 세균 감염에 의해 야기된다[9,14,53-56]. 대다수는 질 경로로부터 양수로 상행하는 모체 공생균에 의해 야기된다. GBS, 이. 콜라이 및 케이. 뉴모니애는 세균 감염의 상승에 의해 야기된 사산 유아의 부검에서 발견되는 가장 일반적인 병원체이다.
실시예 10 - 세균성 GAPDH의 중화는 세균성 패혈증으로부터 신생아를 보호하기 위한 전면적 접근법이다
본 연구는 세균성 GAPDH의 항체-매개된 중화가 다른 관련 패혈증-유도성 세균에 의해 야기된 신생아 감염을 예방할 수 있는지를 조사함으로써 실시예 9에 기술된 연구를 확장시키는 것을 목표로 하였다.
재료 및 방법
마우스 새끼에게 상기 기술된 바와 같이 80㎍의 신생아 백신-유도된 IgG 또는 80㎍의 대조군 IgG를 복강내 주사하였다. 12h 후, 마우스를 107 CFU의 에스. 뉴모니애 스트레인 Tigr4, 500 CFU의 이. 콜라이 스트레인 IHE3034 또는 5 x 105 CFU의 에스. 아우레우스 스트레인 NEWMAN으로 피하 챌린지하였다. 감염 후 마우스의 생존을 1일 기준으로 모니터링하였다.
결과
도 18에 나타낸 바와 같이, 신생아의 수동 면역화에서 신생아 백신으로 유발된 항체의 사용은 세균 챌린지시 생존율을 유의하게 향상시킨다. 에스. 뉴모니애, 이. 콜라이 및 에스. 아우레우스에 대한 결과가 본원에 나타내어진다(각각 도 18a 내지 도 18c를 참조한다).
논의
본원에 논의되는 바와 같이, 현재 가장 관련 있는 패혈증-유도성 세균 중 어느 하나에 대해 지시된 이용가능한 백신이 존재하지 않는다. 여기에는 세균성 GAPDH의 항체-매개된 중화가 가장 관련 있는 패혈증-유도성 세균에 의해 야기된 신생아 감염을 예방한다는 것을 입증하는 데이터가 제시되어 있다.
실시예 11 - 신생아 백신 IgG 항체의 치료학적 투여는 신생 마우스를 GBS 감염으로부터 보호한다
본 연구는 신생아 백신으로 유발된 항체가 패혈증-유도성 세균에 의해 야기된 기존 신생아 감염을 치료할 수 있는지를 조사하는 것을 목표로 하였다.
재료 및 방법
5 X 106 GBS NEM316 CFU로의 피하 감염 6시간 후, 신생아 백신 IgG, 대조군 IgG(80㎍) 또는 염수 용액(0.9% NaCl)을 마우스 새끼(48h령까지)에게 복강내 주사하였다. 치료 시점에서, 모든 마우스는 감염 부위에서의 심한 발진으로 평가된 감염의 명확한 징후를 나타냈다. 감염 후 마우스의 생존은 12시간 기준으로 모니터링되었다.
결과
도 19에 나타낸 바와 같이, 신생아 백신-유도된 IgG 항체를 투여받은 마우스만이 GBS 감염에서 생존할 수 있었다. 실제로, GBS 감염 후 항-GAPDH IgG 항체로 마우스 새끼를 치료하는 것은 동물의 완전한 생존을 초래하였다. 대조적으로, 감염에서 생존한 대조군은 없었다.
논의
본원에 논의되는 바와 같이, 신생아 패혈증에 이용가능한 현재 치료는 항생제 투여에만 기초한 것이다. 신생아 백신에 의해 유도된 항체가 가장 관련 있는 패혈증-유도성 세균 중 하나인 GBS에 의해 야기된 기존의 신생아 감염을 치료하는데 사용될 수 있음을 입증하는 데이터이다.
이 연구는 GBS 감염만을 관찰하였지만, 다른 패혈증-유도성 세균에 의한 감염시에도 동일한 결과가 관찰될 수 있음이 이해된다(특히 실시예 8은 신생아 백신으로 유발된 항체가 GBS 스트레인 NEM316, 피. 아에루기노사, 에스. 뉴모니애, 에스. 아우레우스, 이. 콜라이, 케이. 뉴모니애 및 엔. 메닝기티디스(MenB에 의해 예시됨)로부터의 GAPDH를 인식함을 보여주기 때문에).
따라서, 본 발명의 제1 양상의 펩타이드, 단편 및 변이체는 명시된 환자 집단에 대해 다양하고 유용하고 많이 필요로 하는 항체-기반 치료제를 생성하는데 유의한 유용성을 갖는다.
실시예 12 - 신생아 백신은 노령 마우스를 GBS 감염으로부터 보호한다
본 연구는 실시예 8에서 생산된 항체가 노령 마우스를 GBS 감염으로부터 보호하는데 사용될 수 있음을 보여주는 것을 목표로 하였다.
재료 및 방법
노령의 C57Bl/6 마우스(16개월령 초과)에게 1mg/kg의 신생아 백신-유도된 IgG 또는 대조군으로서의 동량의 이소타입 매칭된 IgG을 3일 동안 매일 복강내 주사하였다. 마지막 용량 24h 후, 마우스에게 2 X 107 CFU의 GBS NEM316을 피하 챌린지하였다. 감염 후 마우스의 생존은 12일 동안 1일 기준으로 모니터링하였다.
2회의 독립적인 실험을 수행하였다.
결과
신생아 백신으로의 백신접종은 노령의 마우스를 치사 GBS 감염에 대해 보호하는 것으로 밝혀졌다. 실제로, 신생아 백신을 주사해서 9마리 마우스 중 8마리(약 90%)는 10개(10%) 대조군 중 단지 하나와 비교하여 세균 챌린지에 생존하였다.
논의
이러한 결과는 신생아 백신을 포함하는 본 발명의 백신이 신생아에서 입증 된 것과 유사한 방식으로 GBS에 의해 예시된 바와 같이 패혈증-유도성 제제에 대한 강력한 특정 반응으로 노령 마우스의 면역계를 유도할 수 있음을 보여준다(실시예 9).
따라서, 본 발명자들은 노인에서 패혈증-유도성 세균에 의한 감염에 대한 감수성이 본 발명자들이 신생아에서 발견한 것과 동일한 메커니즘(즉, GBS 세균에 의해 분비된 GAPDH는 IL-10 생산을 유도하기 위해 TLR2를 통해 B1 세포에 작용한다)에 의해 보강된다. 실제로, 본원에 제공된 데이터는 신생아 백신이 GBS에 의해 생산되는 세균성 GAPDH를 인식하는 항체를 생산하는데 사용할 수 있고, 신생아에서 관찰된 것처럼 노령 마우스에서 분명히 보호 효과를 갖는 것임을 보여준다. 따라서, 본 발명자들은 또한 이러한 면역약화된 다른 숙주에 대해서도 동일한 것이 적용될 것임을 단호하게 믿는다.
본 연구는 GBS 감염만을 관찰하였지만, 다른 패혈증-유도성 세균에 의한 감염시에도 동일한 결과가 관찰될 수 있음이 이해된다(특히 실시예 8은 신생아 백신으로 유발된 항체가 GBS 스트레인 NEM316, 피. 아에루기노사, 에스. 뉴모니애, 에스. 아우레우스, 이. 콜라이, 케이. 뉴모니애 및 엔. 메닝기티디스(MenB에 의해 예시됨)로부터의 GAPDH를 인식함을 보여주기 때문에). 따라서 다른 박테리아 스트레인(실시예 10을 참조한다)으로 챌린지된 신생아 마우스에서 신생아 백신에서 관찰된 결과는 또한 노령 마우스와 같은 다른 면역약화된 숙주에서도 예상될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 현재 가장 관련 있는 패혈증-유도성 세균 중 어느 하나에 의해 야기된 감염에 대해 노인을 효과적으로 보호하는 이용가능한 백신이 존재하지 않는다. 이러한 그룹에서 패혈증을 방지하기 위한 치료학적 전략은 또한 전혀 효과적이지 않다. 세균성 GAPDH의 항체-매개된 중화가, 노인에서 가장 관련 있는 패혈증-유도성 세균에 의해 야기된 감염을 예방함을 입증하는 데이터가 본원에 제시된다. 본원에 입증된 바와 같이, 백신접종은 감염성 질환에 대한 가장 비용-효율적인 치료이고, 심지어 동일한 백신이 상이한 연령 그룹에서 상이한 사람 병원체에 의해 야기된 감염을 예방할 수 있는 경우에 더욱 효과적이다.
노령 마우스에서 얻은 데이터는, 신생아에서 얻은 다른 결과가 노인 및 다른 이러한 면역약화된 숙주에게서도 얻어질 것이라는 개념 증명이다. 따라서, 패혈증-유도성 세균에 의해 야기된 기존의 감염을 앓고 있는 노령의 마우스에의 신생아 백신 IgG 항체의 투여는 신생아에서 관찰된 것처럼 치료를 기대할 수 있다(실시예 11을 참조한다). 패혈증에 대해 이용가능한 현재 치료는 단지 항생제 투여에만 기초하므로, 신생아 백신에 의해 유도된 항체가 노인에서, 그리고 신생아에서, 및 본원에 명시된 다른 환자 집단에서 가장 관련 있는 패혈증-유도성 세균에 의해 야기된 기존 감염을 치료하는데 사용될 수 있다는 사실은 명백히 유리한 것이다.
실시예 13 - 신생아 백신은 GBS 감염에 대해 NOD 마우스를 보호한다
이러한 연구는 실시예 8에서 생산된 항체가 GBS 감염으로부터 당뇨병의 유전자전이 마우스 모델(NOD 마우스)를 보호하는데 사용될 수 있음을 보여주는 것을 목표로 하였다.
재료 및 방법
NOD 마우스(8주령)에게 1mg/kg의 신생아 백신-유도된 IgG 또는 대조군으로서의 동량의 이소타입 매칭된 IgG를 3일 동안 매일 복강내 주사하였다. 마지막 용량 24h 후 마우스에게 5 X 107 CFU의 GBS NEM316을 피하 챌린지하였다. 감염 후 마우스의 생존은 12일 동안 1일 기준으로 모니터링하였다.
2회의 독립적인 실험을 수행하였다.
결과
신생아 백신-유도된 IgG를 이용한 수동 면역화는 치사 GBS 감염에 대해 NOD 마우스를 보호하는 것으로 밝혀졌다. 실제로, 신생아 백신-유도된 IgG로 주사된 8마리 마우스 중 7마리(약 90%)는 8개(25%) 샴-면역화된 대조군 중 단지 2개와 비교하여 세균 챌린지에서 생존하였다(도 21).
논의
이러한 결과는 신생아 백신을 포함하는 본 발명의 백신이 신생아에서(실시예 9 참조) 및 노인(실시예 12 참조)에서 입증된 것과 유사한 방식으로 GBS에 의해 예시된 바와 같이 패혈증-유도성 제제에 대한 강력한 특정 반응으로 당뇨병의 유전자전이 마우스 모델의 면역계를 지시할 수 있음을 보여준다.
따라서, 본 발명자들은 노인에 따라 당뇨병 환자에서 패혈증-유도성 세균에 의한 감염에 대한 감수성이 본 발명자들이 신생아에서 발견한 것과 동일한 메커니즘(즉, GBS 세균에 의해 분비된 GAPDH는 IL-10 생산을 유도하기 위해 TLR2를 통해 B1 세포에 작용한다)에 의해 보강된다. 실제로, 본원에 제공된 데이터는 신생아 백신이 GBS에 의해 생산되는 세균성 GAPDH를 인식하는 항체를 생산하는데 사용할 수 있고, 신생아(및 노인)에서 관찰된 것처럼 당뇨병 마우스에서 분명히 보호 효과를 갖는 것임을 보여준다. 따라서, 본 발명자들은 또한 이러한 면역약화된 다른 숙주에 대해서도 동일한 것이 적용될 것임을 단호하게 믿는다.
또한, 이러한 연구는 GBS 감염만을 관찰하였지만, 다른 패혈증-유도성 세균에 의한 감염시에도 동일한 결과가 관찰될 수 있음이 이해된다(특히 실시예 8은 신생아 백신으로 유발된 항체가 GBS 스트레인 NEM316, 피. 아에루기노사, 에스. 뉴모니애, 에스. 아우레우스, 이. 콜라이, 케이. 뉴모니애 및 엔. 메닝기티디스(MenB에 의해 예시됨)로부터의 GAPDH를 인식함을 보여주기 때문에). 따라서, 다른 박테리아 스트레인(실시예 10을 참조한다)으로 챌린지된 신생아 마우스에서 신생아 백신에서 관찰된 결과는 또한 당뇨병 환자와 같은 다른 면역약화된 숙주에서도 예상될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 당뇨병 환자는 패혈증-유도성 세균에 의한 감염에 대해 증가된 감수성을 갖는다. 세균성 GAPDH의 항체-매개된 중화가, 이러한 환자 그룹에서 가장 관련 있는 패혈증-유도성 세균에 의해 야기된 감염을 예방함을 입증하는 데이터가 본원에 제시된다. 설명된 바와 같이, 본원에 입증된 바와 같이, 백신접종은 감염성 질환에 대한 가장 비용-효율적인 치료이고, 심지어 동일한 백신이 상이한 연령 그룹에서 그리고 상이한 질환, 병태 및 장애에 걸쳐 상이한 사람 병원체에 의해 야기된 감염을 예방할 수 있는 경우에 더욱 효과적이다.
또한, 당뇨병 마우스에서 얻은 데이터는, 신생아에서 얻은 다른 결과가 당뇨병 및 다른 이러한 면역약화된 숙주에게서도 얻어질 것이라는 개념 증명이다. 따라서, 패혈증-유도성 세균에 의해 야기된 기존의 감염을 앓고 있는 당뇨병 마우스에의 신생아 백신 IgG 항체의 투여는 신생아에서 관찰된 것처럼 치료를 기대할 수 있다(실시예 11을 참조한다).
패혈증에 대해 이용가능한 현재 치료는 단지 항생제 투여에만 기초하므로, 신생아 백신에 의해 유도된 항체가 노인에서, 그리고 신생아에서, 및 본원에 명시된 다른 환자 집단에서 가장 관련 있는 패혈증-유도성 세균에 의해 야기된 기존 감염을 치료하는데 사용될 수 있다는 사실은 명백히 유리한 것이다.
결론
실시예에 제시된 데이터는 신생아, 유아, 가임 연령의 여성, 임신한 여성, 태아 및 노인과 같은 면역약화된 숙주를 특히 세균성 패혈증으로부터 보호하기 위한 신생아 백신을 포함하는 본 발명의 백신 및 치료법의 관련성을 보여준다.
또한, 신생아 백신의 이론적 근거와 여기에 기술된 다른 백신 및 치료법은 이전에 공개된 결과[24,25]에 관한 유의한 새로운 진보적인 단계를 나타낸다, 즉:
a) 세균성 GAPDH가 신생아 숙주에서 IL-10을 유도하는 메커니즘;
b) GAPDH-유도된 IL-10 생산이 상이한 병원체에 의해 야기된 세균성 패혈증에 대한 감수성과 관련되어 있다;
c) GAPDH-유도된 IL-10 생산은 사람 제대혈 세포에 보존된 메커니즘이다;
d) GAPDH-유도된 IL-10 생산은 성인 사람의 말초혈로부터 단리된 백혈구에 보존된 메커니즘이다;
e) GBS에 의해 야기된 사산의 예방시 항-GAPDH 항체의 효능
f) 신생아 백신(및 본원에 기술된 기타 백신)에 의해 유발된 항체는 GBS, 피. 아에루기노사, 이. 콜라이, 에스. 뉴모니애, 케이. 뉴모니애, 에스 아우레우스, 및 엔. 메닝기티디스로부터의 세포외 GAPDH를 인식한다.
g) 신생아 백신(및 본원에 기술된 기타 백신)으로 유발된 항체를 이용한 수동 면역화의 수단에 의한 세균성 GAPDH의 중화는 GBS, 이. 콜라이, 에스. 뉴모니애, 및 에스. 아우레우스에 의해 야기도니 패혈증으로부터 신생아를 보호한다;
h) 신생아 패혈증 및 본원에 명시된 바와 같은 다른 환자 그룹에서의 패혈증에 대한 예방학적 전략으로서 또는 치료로서의 패혈증-유도성 세균의 GAPDH로부터 유도된 펩타이드의 용도 및 항-GAPDH IgG 항체의 용도.
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Escherichia coli <400> 21 Ala Gly Glu Met Lys Thr Ile Val Tyr Asn Val Asn Asp Asp Thr Leu 1 5 10 15 <210> 22 <211> 14 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 22 Gly Lys Lys Val Thr Ala Glu Glu Val Asn Asn Ala Leu Lys 1 5 10 <210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 23 Thr Asn Asn Asn Glu Ser Phe Gly Tyr Thr Asp Glu Glu Ile 1 5 10 <210> 24 <211> 18 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 24 Thr Gln Thr Glu Ile Thr Ala Val Gly Asp Leu Gln Leu Val Lys Thr 1 5 10 15 Val Ala <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 25 Tyr Gly Phe Val Thr Gln Leu Ile Arg Thr Leu Glu Lys Phe Ala Lys 1 5 10 15 Leu <210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 26 Leu Thr Asp Asp Asp Met Leu Ala His Leu Leu Lys Tyr Asp Thr Met 1 5 10 15 <210> 27 <211> 16 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 27 Glu Val Val Asp Gly Gly Phe Arg Val Asn Gly Lys Glu Val Lys Ser 1 5 10 15 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 28 Ala Thr Gly Asp Leu Lys Thr Ile 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<213> Klebsiella pneumoniae <400> 50 Tyr Gly Phe Val Thr Gln Leu Ile Arg Val Leu Glu Lys Phe Ala Arg 1 5 10 15 <210> 51 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas spp <400> 51 Leu Arg Ala Leu Tyr Thr Gly His Tyr Arg Glu Gln Leu Gln Val 1 5 10 15 <210> 52 <211> 13 <212> PRT <213> Pseudomonas spp <400> 52 Asp Leu Gly Asp Ala Ala Val Asn Ala His Leu Phe Gln 1 5 10 <210> 53 <211> 22 <212> PRT <213> Pseudomonas spp <400> 53 Gly Glu Val Glu His Asp Ala Glu Ser Leu Arg Val Met Gly Asp Arg 1 5 10 15 Ile Ala Val Ser Ala Ile 20 <210> 54 <211> 18 <212> PRT <213> Pseudomonas spp <400> 54 Ser Ala Ile Arg Asn Pro Ala Glu Leu Pro Trp Lys Ser Leu Gly Val 1 5 10 15 Asp Ile <210> 55 <211> 13 <212> PRT <213> Pseudomonas spp <400> 55 Val Ala Gln Val Leu His Arg Glu Leu Gly Ile Glu His 1 5 10 <210> 56 <211> 18 <212> PRT <213> Pseudomonas spp <400> 56 Thr Ile His Ala Tyr Thr Asn Asp Gln Asn Leu Ser Asp Val Tyr His 1 5 10 15 Pro Asp <210> 57 <211> 20 <212> PRT <213> Pseudomonas spp <400> 57 Val Tyr His Pro Asp Leu 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meningitidis (group B) <400> 65 Glu Leu Lys Asp Asp Ala Ile Val Val Asn Gly Lys Glu 1 5 10 <210> 66 <211> 14 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 66 His Arg Lys Gly Asp Leu Arg Arg Ala Arg Ala Ala Ala Leu 1 5 10 <210> 67 <211> 13 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 67 Asn Ala Ala Met Lys Ala Ala Ala Ser Glu Ser Tyr Gly 1 5 10 <210> 68 <211> 13 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 68 Thr Gln Thr Arg Val Met Thr Val Gly Gly Lys Gln Leu 1 5 10 <210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 69 Thr Cys Gln Leu Val Arg Thr Leu Glu Tyr Phe Ala Gly Lys Ile 1 5 10 15

Claims (38)

  1. 하나 이상의 패혈증-유도성 세균의 GAPDH 내에서 발견된 펩타이드와 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 갖고, 사람 GAPDH 내에서 발견된 펩타이드와 10% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 단리된 펩타이드, 또는 이의 기능성 단편 또는 기능성 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드가 GBS, 이. 콜라이(E. coli), 스태필로코커스 종(Staphylococcus spp.), 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae), 케이. 뉴모니애(K. pneumoniae), 엔. 메닝기티디스(N. meningitidis) 및/또는 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.)의 GAPDH 내에서 발견된 펩타이드와 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 단리된 펩타이드, 또는 이의 단편 또는 변이체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 펩타이드가 패혈증-유도성 세균의 GAPDH 내에서 발견된 상기 펩타이드와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 단리된 펩타이드, 또는 이의 단편 또는 변이체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가 실질적으로 서열번호 9 내지 서열번호 69 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 단리된 펩타이드, 또는 이의 단편 또는 변이체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가:
    a) 150개 이하의 아미노산을 포함하거나, 100개 미만의 아미노산, 50개 미만의 아미노산, 30개 미만의 아미노산 또는 20개 미만의 아미노산을 포함하고/하거나;
    b) 적어도 3개의 아미노산, 적어도 5개의 아미노산, 적어도 8개의 아미노산, 또는 적어도 10개의 아미노산을 포함하고/하거나;
    c) 5 내지 100개의 아미노산 길이, 5 내지 50개의 아미노산 길이 또는 10 내지 20개의 아미노산 길이인,
    단리된 펩타이드, 이의 단편 또는 변이체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 펩타이드, 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 단리된 핵산, 또는 이의 기능성 단편 또는 기능성 변이체.
  7. 제6항에 기재된 핵산, 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 유전적 작제물.
  8. 제7항에 기재된 유전적 작제물을 포함하는 재조합 벡터.
  9. 제7항에 기재된 유전적 작제물 또는 제8항에 기재된 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  10. 제9항에 기재된 적어도 하나의 숙주 세포를 포함하는 유전자전이 숙주 유기체.
  11. 패혈증-유도성 세균으로의 감염을 예방하기 위한 백신 개발시의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 펩타이드, 이의 단편 또는 변이체의 용도.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 펩타이드, 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 백신.
  13. 제12항에 있어서, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 2개 이상의 펩타이드, 이의 단편 또는 변이체를 포함하고, 여기서, 상기 펩타이드, 이의 단편 및/또는 변이체 중 적어도 2개가 함께 링크되어 있는, 백신.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 실질적으로 서열번호 9 내지 서열번호 69에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 백신.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 9 내지 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드들 중 임의의 1개, 2개, 3개 또는 4개 전 부를 포함하는 백신.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 신생아, 유아, 소아, 가임 연령의 여성, 임신한 여성, 태아, 당뇨병 및/또는 노인 대상체로부터 바람직하게 선택된 면역약화된 숙주에의 투여용으로 제형화된 백신.
  17. 면역 반응을 자극하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 펩타이드, 이의 단편 또는 변이체 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기재된 백신의 용도.
  18. 제17항에 있어서, 상기 면역 반응이 1종 이상의 패혈증-유도성 세균의 GAPDH에 특이적인 항체의 생산을 포함하는, 용도.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 용도가:
    a) 시험관내, 생체내 또는 생체외 용도이고/이거나;
    b) 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 생산을 자극하기 위한 시험관내 또는 생체외 용도인, 용도.
  20. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 치료요법에 사용하기 위한 펩타이드, 이의 단편 또는 변이체.
  21. 패혈증-유도성 세균에 의한 감염을 예방하는데 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 펩타이드, 이의 단편 또는 변이체 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기재된 백신.
  22. 패혈증, 폐렴, 수막염, 심내막염, 소장결장염, 요로 감염, 연조직 감염, 위장 감염, 혈류 감염, 뇌염, 조산 및 사산 중 어느 하나 이상을 예방하는데 사용하기 위한 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 펩타이드, 이의 단편 또는 변이체 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기재된 백신.
  23. 패혈증-유도성 세균에 의한 감염의 예방 방법으로서, 상기 방법은, 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 펩타이드, 이의 단편 또는 변이체 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기재된 백신을 투여함을 포함하는, 패혈증-유도성 세균에 의한 감염의 예방 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 방법이 패혈증, 폐렴, 수막염, 심내막염, 소장결장염, 요로 감염, 연조직 감염, 위장 감염, 혈류 감염, 뇌염, 조산 및 사산 중 어느 하나 이상의 예방 방법인, 방법.
  25. 1종 이상의 패혈증-유도성 세균의 GAPDH에 대해 특이적인 항체로서, 상기 항체는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 펩타이드, 이의 단편 또는 변이체 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기재된 백신에 대해 생성되는, 1종 이상의 패혈증-유도성 세균의 GAPDH에 대해 특이적인 항체.
  26. 1종 이상의 패혈증-유도성 세균의 GAPDH에서 발견되는 에피토프에 대해 특이적인 항체로서, 상기 에피토프는 실질적으로 서열번호 9 내지 서열번호 69 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 1종 이상의 패혈증-유도성 세균의 GAPDH에서 발견되는 에피토프에 대해 특이적인 항체.
  27. 제26항에 있어서, 상기 항체가 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 펩타이드, 이의 단편 또는 변이체 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기재된 백신에 대해 생성되는, 항체.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 치료요법에 사용하기 위한 항체.
  29. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 패혈증-유도성 세균에 의한 감염을 예방하거나 치료하거나 개선하는데 사용하기 위한 항체.
  30. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 패혈증, 폐렴, 수막염, 심내막염, 소장결장염, 요로 감염, 연조직 감염, 위장 감염, 혈류 감염 및 뇌염 중 어느 하나 이상을 예방하거나 치료하거나 개선하는데 사용하기 위한 그리고/또는 조산 및/또는 사산을 예방하는데 사용하기 위한 항체.
  31. 1종 이상의 패혈증-유도성 세균의 GAPDH에 대해 특이적인 항체의 생산 방법으로서, 상기 방법은 항체-생산 세포를 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 펩타이드, 이들의 단편 또는 변이체 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기재된 백신과 접촉시키는 단계를 포함하는, 1종 이상의 패혈증-유도성 세균의 GAPDH에 대해 특이적인 항체의 생산 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 방법이:
    a) 시험관내, 생체내 또는 생체외 방법이고/이거나;
    b) 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 시험관내 또는 생체외 생산 방법이고/이거나;
    c) 생체내 백신접종 방법인, 방법.
  33. 패혈증-유도성 세균에 의한 감염을 치료하거나 개선하거나 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 투여함을 포함하는, 패혈증-유도성 세균에 의한 감염을 치료하거나 개선하거나 또는 예방하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 방법이 패혈증, 폐렴, 수막염, 심내막염, 소장결장염, 요로 감염, 연조직 감염, 위장 감염, 혈류 감염 및 뇌염 중 어느 하나 이상을 치료하거나 개선하거나 예방하는 방법이고/이거나 조산 및/또는 사산을 예방하는 방법인, 방법.
  35. 제23항 또는 제33항에 있어서, 상기 치료를 필요로 하는 대상체가 신생아, 유아, 소아, 가임 연령의 여성, 임신한 여성, 태아, 당뇨병 및/또는 노인 대상체로부터 바람직하게 선택되는 면역약화된 숙주인, 방법.
  36. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 기재된 항체 및 임의로 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 패혈증-유도성 세균 치료 조성물.
  37. 제36항에 기재된 조성물을 제조하기 위한 프로세스로서, 상기 프로세스는 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 기재된 항체의 치료학적 유효량을 약제학적으로 허용되는 비히클과 배합함을 포함하는, 프로세스.
  38. 제11항 또는 제18항에 기재된 용도, 제21항에 기재된 펩타이드, 이의 단편 또는 변이체, 제23항, 제31항 및 제33항 중 어느 한 항에 기재된 방법, 제25항, 제26항 및 제29항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 또는 제36항에 기재된 조성물로서, 상기 패혈증-유도성 세균은 GBS, 이. 콜라이, 스태필로코커스 종, 에스. 뉴모니애, 케이. 뉴모니애, 슈도모나스 종 및 엔. 메닝기티디스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 용도, 펩타이드, 이의 단편 또는 변이체, 방법, 항체, 또는 조성물.
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