CN106755543A - 一种栝楼scar分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属分子技术领域，具体涉及一种栝楼SCAR分子标记及应用。所述的栝楼SCAR分子标记引物为SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.6所示。利用本发明提供的引物或序列，可对栝楼属的不同品种，以及栝楼属和非栝楼属进行准确鉴定，该引物可应用到栝楼种苗的快速鉴别中，对于瓜蒌的安全用药，规范药材市场管理也有着极大的作用。
Description
技术领域
本发明涉及分子技术领域，具体涉及一种栝楼SCAR分子标记及应用。
背景技术
瓜蒌子为葫芦科植物栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim.或双边栝楼Trichosanthes r osthornii Harms的干燥成熟种子。秋季采摘成熟果实，剖开，取出种子，洗净，晒干。性甘，寒。归肺、胃、大肠经。润肺化痰，滑肠通便。用于燥咳痰黏，肠燥便秘。目前各地栝楼栽培除了少量作为药用外，其余大部分是以籽用为主，瓜蒌子含有丰富的功能性蛋白质等成分，具有良好的降血糖、抗肿瘤等保健药用价值，瓜蒌子在炒制加工后可作为休闲食品使用，称为“吊瓜子，”作为一种特色瓜子资源，受到广大消费者的喜爱，由此催生了大面积的以瓜蒌子生产为目的的栝楼栽培产业，并在全国形成了一批一定规模的吊瓜子专业生产合作社，特别在浙江、山东、江西、湖南等地种植面积较大。
目前国内的主流籽用栝楼其来源种为双边栝楼，在湖南、江西地区广泛栽培，面积超过10万亩，双边栝楼籽粒较大，长椭圆形，类似葵花籽，易于剥开食用，受到广大消费者的青睐，各种植基地也纷纷发展双边栝楼的种植。但是栝楼来源品种广泛，据《中国植物志》记载我国栝楼有34种，全世界范围内有80余种。由于栝楼形态差别较小，不同环境对表型也存在一定的影响，因此，对其分类鉴定具有极大挑战，其分类学研究也一直具有一些争议。而在栝楼栽培中，由于不同种源的栝楼种苗其形态特征差异较小，在引种栽培时很难区分优良种，导致一些种植基地在引种过程中引入一些不适宜籽用的品种，导致经济损失。因此开发栝楼种苗的鉴定技术，用于种苗的选择栽培，具有极大的应用价值。
瓜蒌皮、瓜蒌子、天花粉是大宗常用中药，药典记载的来源品种只有两个，分别是栝楼和双边栝楼，但在市场上，常常出现一些栝楼属其它品种作为药材使用的情况。据乐崇熙等调查研究发现我国瓜蒌皮的主流商品为栝楼或双边栝楼的果皮，主要混淆品为湖北栝楼T.hupehensis的果皮，此外还有10多种同属或其它科属来源的混淆品。可见，对瓜蒌药材来源的稳定可靠的鉴定也很重要，DNA分子，只与植物品种来源有关，不受环境及植物形态的影响，因此很适合作为药材来源种的鉴定，因此，开发基于DNA分子的瓜蒌药材来源鉴定手段，对于安全用药，规范药材市场管理也有着极大的作用。
针对上述问题，申请人通过SRAP分子标记的研究，找出栝楼属品种间差异条带，继而开发针对差异条带的SCAR标记引物，这种标记引物能稳定的鉴别栝楼的不同品种，并成功的将其应用到种苗的快速鉴别中。DNA分子技术应用于栝楼种苗鉴定目前还没有相关报道。
发明内容
发明的目的在于提供了一种栝楼SCAR分子标记引物，所述的引物为：F1:5’-CCCGTA GCT GCA CTC TCA TC-3’，R1:5’-CCC CGT GCT TCG GGA ATT AT-3’；F2:5’-TCC AAACCG GAA ATA GGG GC-3’，R2:5’-TGA CTG CGT ACG AAT TGA CA-3’；和F3:5’-CGG GAG TTGATC GTG GCA T-3’，R3:5’-TCC AAA CCG GAA ACT GTG GT-3’。
本发明的另一个目的在于提供了一种栝楼SCAR分子标记引物在栝楼品种鉴定中的应用，利用本发明提供引物对待测植株进行鉴定，成本低，能有效降低引种风险，保障栝楼种苗的质量或者可以确定瓜蒌药材的来源品种，从而实现瓜蒌药材的真伪鉴别。
本发明的最后一个目的在于提供了栝楼鉴别的SCAR分子片段序列，如下：
栝楼属通用SCAR片段：
TTGAGTCCAAACCGGAGGGACCTGATGGACCTACAGATCATGAGCTCCAATGATACGAGATCAACCGGTCAAACTCTTTGACCTAATTGACCAACATTCATTAACTACGAGTGACTCCACTATAGACCCGTAGCTGCACTCTCATCACTGTAGGACTAGTTCTGTCCATCGATATAACCATTACCCGTAAGTCGACCCTTCACTAGTTGTTCGTACTCACAGCTGGGTCAAATTACCGTTTTACCCCTGTGTGTACATCTTGCTCCTTAAGTACCACTGCTCCTCTAATGAACAACCTGTTTATGATCCGATCAGAAACAAATTCCCTCTCGGGCCAGTGAGAGGGTCGGGCCCCGTTGTTCAAGTCCCGGAGACAGCCCTTAAGGAAACAACTACAATATAATTCCCGAAGCACGGGGTGTGAATTCGTACGCAGTCA；
针对该序列设计的引物为：F1:5’-CCC GTA GCT GCA CTC TCA TC-3’，R1:5’-CCCCGT GCT TCG GGA ATT AT-3’。
栝楼SCAR片段：
TTGAGTCCAAACCGGAAATAGGGGCGAGCTTTTGAAAGATGATGAGAAGTTGTCATTTTGGTATTCTTCGTTCTTCGTAAGTATTCGATCATGCTTTTTATCTTCGCGATCAGTTTCTACAATGGTCGTTGAAGTTTATAATCCTTGTCGATTTAGTCGACAATTTGGATTTTGTCAATTCGTACGCAGTCA；
针对该序列设计的引物为：F2:5’-TCC AAA CCG GAA ATA GGG GC-3’，R2:5’-TGACTG CGT ACG AAT TGA CA-3’。
双边栝楼SCAR片段：
TGACTGCGTACGAATTGACTAAAGTACTCTTAGCCTGGCGGGAGTTGATCGTGGCATCAACAAACATTAGTCCTTTCTCAGCCACTTTCTTCAGTTCTACTCCCCTTTGTATTGCAGACAGGAATTTCAATGCCCCTATTCTAGGGGTGTCGTCACCTTCTTCCTTCTCCACCACAGTTTCCGGTTTGGACTCA；
针对该序列设计的引物为：F3:5’-CGG GAG TTG ATC GTG GCA T-3’和R3:5’-TCCAAA CCG GAA ACT GTG GT-3’。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
申请人通过对栝楼属的不同品种进行SRAP分析，最终获得了不同品种的栝楼核苷酸鉴定片段，包括：栝楼属通用SCAR片段，SEQ ID NO.7所示；栝楼SCAR片段，SEQ ID NO.8所示；双边栝楼SCAR片段，SEQ ID NO.9所示。
针对栝楼属通用SCAR片段，栝楼SCAR片段，和双边栝楼SCAR片段设计的引物也属于本发明的保护范围。
优选的，针对栝楼属通用SCAR片段设计的引物为：F1:5’-CCC GTA GCT GCA C TCTCA TC-3’，R1:5’-CCC CGT GCT TCG GGA ATT AT-3’。
针对栝楼SCAR片段设计的引物为：F2:5’-TCC AAA CCG GAA ATA GGG GC-3’，R2:5’-TGA CTG CGT ACG AAT TGA CA-3’。
针对双边栝楼SCAR片段设计的引物为：F3:5’-CGG GAG TTG ATC GTG GCA T-3’和R3:5’-TCC AAA CCG GAA ACT GTG GT-3’。
一种栝楼SCAR分子标记引物在栝楼品种鉴定中的应用；包括利用引物F1:5’-CCCGTA GCT GCA CTC TCA TC-3’，R1:5’-CCC CGT GCT TCG GGA ATT AT-3’；和/或F2:5’-TCCAAA CCG GAA ATA GGG GC-3’，R2:5’-TGA CTG CGT ACG AAT TGA CA-3’；和/或F3:5’-CGGGAG TTG ATC GTG GCA T-3’，R3:5’-TCC AAA C CG GAA ACT GTG GT-3’制备成栝楼鉴定试剂盒或直接应用于栝楼品种鉴定。
优选的，所述应用包括下述步骤：
利用以下引物对待测样品DNA进行PCR扩增：
F1:5’-CCC GTA GCT GCA CTC TCA TC-3’，R1:5’-CCC CGT GCT TCG GGA AT TAT-3’；F2:5’-TCC AAA CCG GAA ATA GGG GC-3’，R2:5’-TGA CTG CGT AC G AAT TGA CA-3’；和F3:5’-CGG GAG TTG ATC GTG GCA T-3’，R3:5’-TCC A AA CCG GAA ACT GTG GT-3’；
结果存在以下情况：
(1)扩增出分子量为300bp和200bp的条带，则确定所检材料为栝楼；
(2)扩增出分子量为300bp和170bp的条带，则确定所检材料为双边栝楼；
(3)仅扩增出300bp条带，则所检材料为栝楼属的其他品种；
(4)无条带扩出，则所检材料不是栝楼属。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
利用本发明提供的引物或序列，可对栝楼属的不同品种，以及栝楼属和非栝楼属进行准确鉴定，该引物可应用到栝楼种苗的快速鉴别中，对于瓜蒌的安全用药，规范药材市场管理也有着极大的作用。
附图说明
图1为收集的11份籽用栝楼资源示意图。
图2为利用栝楼SCAR引物对表1中样品编号为1-24的栝楼DNA扩增结果示意图。
其中1Y为栝楼属通用引物(F1和R1)扩增结果，2Y为栝楼引物(F2和R2)扩增结果，3Y为双边栝楼引物(F3和R3)扩增结果；泳道号对应样品编号，泳道1-16,20-24为双边栝楼，17-19为栝楼。
图3为利用栝楼SCAR引物对表3中样品编号为1-10的栝楼药材样品DNA扩增结果示意图。
其中1Y为栝楼属通用引物(F1和R1)扩增结果，2Y为栝楼引物(F2和R2)扩增结果，3Y为双边栝楼引物(F3和R3)扩增结果；泳道号对应样品编号，泳道1-3为栝楼，4-8为双边栝楼，9-10为栝楼属的其他品种。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
栝楼SCAR分子标记引物的获得：
1)栝楼样品的采集及DNA提取，样品列表如表1所示，所述的植株品种通过形态学鉴定品种。利用天根生化科技有限公司的植物基因组DNA快速提取试剂盒提取栝楼籽的DNA。
表1样品列表
2)SRAP分析
将合成的10条正向引物(Me1-Me 10)与10条反向性引物(Em 1-Em 10)组合，获得100个引物对，然后使用栝楼样品对100个引物对进行筛选，选择电泳条带明亮、带型丰富的引物对用于SRAP分析。引物见表2。
表2栝楼SRAP分子标记引物
SRAP扩增产物经电泳，观察聚丙烯酰胺凝胶图谱上长度为200～800bp DNA条带的有或无，从中发现在不同品种间有差异的条带，即只能在一个品种中扩增出条带，而在另外的品种中没有扩增条带产生。
4)SCAR标记的开发
从SRAP引物扩增结果中，选择带型大小适中，条带清晰，具有稳定差异的多态条带进行SCAR标记开发，并选择部分共有条带作为参比序列进行SCAR标记开发。将SRAP差异条带切胶回收，然后构建T载体并转化到大肠杆菌(E.coli)，对获得的阳性克隆进行单克隆测序，每一个多态条带平行挑取3个克隆子进行测序。对测序结果进行比对，如3个序列均不同则舍弃，将有两个及两个以上序列一致的作为鉴定的SCAR片段。获得的通用及鉴定栝楼SCAR片段如下：
栝楼属通用SCAR片段：
TTGAGTCCAAACCGGAGGGACCTGATGGACCTACAGATCATGAGCTCCAATGATACGAGATCAACCGGTCAAACTCTTTGACCTAATTGACCAACATTCATTAACTACGAGTGACTCCACTATAGACCCGTAGCTGCACTCTCATCACTGTAGGACTAGTTCTGTCCATCGATATAACCATTACCCGTAAGTCGACCCTTCACTAGTTGTTCGTACTCACAGCTGGGTCAAATTACCGTTTTACCCCTGTGTGTACATCTTGCTCCTTAAGTACCACTGCTCCTCTAATGAACAACCTGTTTATGATCCGATCAGAAACAAATTCCCTCTCGGGCCAGTGAGAGGGTCGGGCCCCGTTGTTCAAGTCCCGGAGACAGCCCTTAAGGAAACAACTACAATATAATTCCCGAAGCACGGGGTGTGAATTCGTACGCAGTCA
栝楼SCAR片段：
TTGAGTCCAAACCGGAAATAGGGGCGAGCTTTTGAAAGATGATGAGAAGTTGTCATTTTGGTATTCTTCGTTCTTCGTAAGTATTCGATCATGCTTTTTATCTTCGCGATCAGTTTCTACAATGGTCGTTGAAGTTTATAATCCTTGTCGATTTAGTCGACAATTTGGATTTTGTCAATTCGTACGCAGTCA
双边栝楼SCAR片段：
TGACTGCGTACGAATTGACTAAAGTACTCTTAGCCTGGCGGGAGTTGATCGTGGCATCAACAAACATTAGTCCTTTCTCAGCCACTTTCTTCAGTTCTACTCCCCTTTGTATTGCAGACAGGAATTTCAATGCCCCTATTCTAGGGGTGTCGTCACCTTCTTCCTTCTCCACCACAGTTTCCGGTTTGGACTCA。
针对SCAR分子片段，设计并合成SCAR分子标记引物。引物合成后进行扩增分析，考察其特异性或通用性，选择只能针对一种栝楼进行有效扩增的引物，作为有效的SCAR标记，然后对引物扩增的条件进行优化。在采用优化的PCR扩增条件下，对栝楼进行广泛的鉴定验证研究，最终确认SCAR标记引物在栝楼鉴定中的稳定性和实用性。获得稳定的栝楼鉴别SCAR标记引物为：
栝楼属通用引物：
F1:5’-CCC GTA GCT GCA CTC TCA TC-3’
R1:5’-CCC CGT GCT TCG GGA ATT AT-3’
栝楼引物：
F2:5’-TCC AAA CCG GAA ATA GGG GC-3’；
R2:5’-TGA CTG CGT ACG AAT TGA CA-3’；
双边栝楼引物：
F3:5’-CGG GAG TTG ATC GTG GCA T-3’；
R3:5’-TCC AAA CCG GAA ACT GTG GT-3’。
利用上述引物对待测样品检测后的判定方式如下：
(1)扩增出分子量为300bp和200bp的条带，则确定所检材料为栝楼；
(2)扩增出分子量为300bp和170bp的条带，则确定所检材料为双边栝楼；
(3)仅扩增出300bp条带，则所检材料为栝楼属的其他品种；
(4)无条带扩出，则所检材料不是栝楼属。
利用上述引物对表1中样品编号为1-24的栝楼样品进行扩增，结果如图2所示(泳道编号对应表1中的样品编号)。结果表明利用本发明提供的引物扩增得到的鉴定结果与形态学鉴定结果一致，表明本发明提供的引物可准确区分栝楼和双边栝楼。
实施例2：
一种栝楼SCAR分子标记引物在栝楼的品种鉴定中的应用，应用过程如下：
1)样品如表3所示(表3中的样品已通过形态学鉴定来源品种)，对照为南瓜。
表3栝楼药材样品列表
2)对上述样品及对照进行DNA提取，然后利用本发明提供的引物进行PCR扩增，扩增体系如下：
10×buffer缓冲液(含20mM Mg2+)2.5μL,dNTP(10mM)0.5μL，正向和反向引物(10μM)各1μL，Tap酶(2.5U·μL-1)0.5μL,待测样品DNA(20ng·μL-1)1.0μL，灭菌蒸馏水补足至25μL。PCR反应液配制完后，轻轻震荡混匀，将PCR管放入PCR仪中进行扩增。反应条件：解链温度95℃，时间5min，退火温度58℃，时间30s，复性温度72℃，时间为30s,35个循环后72℃延伸，时间为7min，4℃保存；
引物如下：
栝楼属通用引物：
F1:5’-CCC GTA GCT GCA CTC TCA TC-3’
R1:5’-CCC CGT GCT TCG GGA ATT AT-3’
栝楼引物：
F2:5’-TCC AAA CCG GAA ATA GGG GC-3’；
R2:5’-TGA CTG CGT ACG AAT TGA CA-3’；
双边栝楼引物：
F3:5’-CGG GAG TTG ATC GTG GCA T-3’；
R3:5’-TCC AAA CCG GAA ACT GTG GT-3’。
3)扩增结果的判定：
(1)扩增出分子量为300bp和200bp的条带，则确定所检材料为栝楼；
(2)扩增出分子量为300bp和170bp的条带，则确定所检材料为双边栝楼；
(3)仅扩增出300bp条带，则所检材料为栝楼属的其他品种；
(4)无条带扩出，则所检材料不是栝楼属。
扩增结果如图3所示，图3中的泳道号对应表3中的样品号，具体如下：
泳道号为1-3的扩增出300bp和200bp的条带，鉴定为栝楼；泳道号为4-8的扩增出300bp和170bp的条带，鉴定为双边栝楼；泳道号为9-10的只能扩增出300bp的通用条带，鉴定为栝楼属的其他品种；CK为对照南瓜，没有扩增出条带。以上利用本发明提供的引物的鉴定结果与表3的形态学鉴定结果一致，说明本发明提供的引物可对栝楼属的不同品种进行准确鉴定，特别是能准确对栝楼和双边栝楼进行区分，能对栝楼属和非栝楼属进行区分。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南省农业生物资源利用研究所
<120> 一种栝楼SCAR分子标记及应用
<130> 一种栝楼SCAR分子标记及应用
<160> 9
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cccgtagctg cactctcatc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccccgtgctt cgggaattat 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tccaaaccgg aaataggggc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgactgcgta cgaattgaca 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgggagttga tcgtggcat 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tccaaaccgg aaactgtggt 20
<210> 7
<211> 439
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ttgagtccaa accggaggga cctgatggac ctacagatca tgagctccaa tgatacgaga 60
tcaaccggtc aaactctttg acctaattga ccaacattca ttaactacga gtgactccac 120
tatagacccg tagctgcact ctcatcactg taggactagt tctgtccatc gatataacca 180
ttacccgtaa gtcgaccctt cactagttgt tcgtactcac agctgggtca aattaccgtt 240
ttacccctgt gtgtacatct tgctccttaa gtaccactgc tcctctaatg aacaacctgt 300
ttatgatccg atcagaaaca aattccctct cgggccagtg agagggtcgg gccccgttgt 360
tcaagtcccg gagacagccc ttaaggaaac aactacaata taattcccga agcacggggt 420
gtgaattcgt acgcagtca 439
<210> 8
<211> 192
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ttgagtccaa accggaaata ggggcgagct tttgaaagat gatgagaagt tgtcattttg 60
gtattcttcg ttcttcgtaa gtattcgatc atgcttttta tcttcgcgat cagtttctac 120
aatggtcgtt gaagtttata atccttgtcg atttagtcga caatttggat tttgtcaatt 180
cgtacgcagt ca 192
<210> 9
<211> 194
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgactgcgta cgaattgact aaagtactct tagcctggcg ggagttgatc gtggcatcaa 60
caaacattag tcctttctca gccactttct tcagttctac tcccctttgt attgcagaca 120
ggaatttcaa tgcccctatt ctaggggtgt cgtcaccttc ttccttctcc accacagttt 180
ccggtttgga ctca 194
Claims (7)
1.一种用于双边栝楼鉴定的核苷酸序列，所述的核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示。
2.基于权利要求1所述核苷酸序列设计的引物。
3.根据权利要求2所述的引物，所述的引物为：F3: 5’- CGG GAG TTG ATC GTG GCA T-3’和R3: 5’- TCC AAA CCG GAA ACT GTG GT -3’。
4.一种鉴定栝楼的SCAR分子标记引物，所述的引物为：F1: 5’- CCC GTA GCT GCA CTCTCA TC -3’，R1: 5’- CCC CGT GCT TCG GGA ATT AT -3’，F2: 5’- TCC AAA CCG GAA ATAGGG GC -3’，R2: 5’- TGA CTG CGT ACG AAT TGA CA -3’，F3: 5’- CGG GAG TTG ATC GTGGCA T -3’和R3: 5’- TCC AAA CCG GAA ACT GTG GT -3’。
5.权利要求1所述的核苷酸序列或权利要求2所述的引物在双边栝楼鉴定中的应用。
6.权利要求4所述的SCAR分子标记引物在栝楼鉴定中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，所述的应用的过程包括：
利用引物F1: 5’- CCC GTA GCT GCA CTC TCA TC -3’，R1: 5’- CCC CGT GCT TCGGGA ATT AT -3’，F2: 5’- TCC AAA CCG GAA ATA GGG GC -3’，R2: 5’- TGA CTG CGT ACGAAT TGA CA -3’，和F3: 5’- CGG GAG TTG ATC GTG GCA T -3’，R3: 5’- TCC AAA CCGGAA ACT GTG GT -3’对待测样品进行PCR扩增；
结果存在三种情况：
（1）扩增出分子量为300bp和200 bp的条带，则确定所检种苗为栝楼；
（2）扩增出分子量为300bp和170bp的条带，则确定所检材料为双边栝楼；
（3）仅扩增出300bp条带，则为栝楼属的植株；
（4）无条带扩出，则所检材料不是栝楼属的植株。
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101113469A (zh) * | 2007-06-15 | 2008-01-30 | 易克 | 与黄瓜雌性性状相关的分子标记及其应用 |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101113469A (zh) * | 2007-06-15 | 2008-01-30 | 易克 | 与黄瓜雌性性状相关的分子标记及其应用 |
| CN104004828A (zh) * | 2014-04-17 | 2014-08-27 | 山东省农业科学院蔬菜花卉研究所 | 洋葱细胞质雄性不育scar标记及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 宁志怨 等: "栝楼性别的分化与鉴定研究进展", 《江苏农业科学》 * |
| 曲益涛: "栝楼性别转化的RAPD-SCAR标记研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 * |
| 曹亮 等: "籽用栝楼遗传多样性研究", 《中草药》 * |
| 魏宝阳 等: "吴茱萸遗传多样性的SRAP分析", 《中草药》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112280887A (zh) * | 2020-11-05 | 2021-01-29 | 江苏省农业科学院 | 用于栝楼苗期雌雄株基因表达研究的内参基因及其应用 |
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