CN106755283A - 一种桑黄工厂化液体发酵过程中酶活规律的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明特别涉及一种桑黄工厂化液体发酵过程中酶活规律的测定方法。包括：配制培养基；装罐；灭菌；关闭搅拌，改为直接进蒸汽升温至119℃‑124℃，压力0.1±0.05Mpa，保温灭菌；接种；培养；取样对培养基中的多种酶进行测定。本发明原料选取方便，成本低，利用研究所得配方可以获得桑黄菌丝体及胞外活性物质的高产。菌丝体产量达到4.6217g/100mL。淀粉酶、羧甲基纤维素酶、半纤维素酶在第7天达到酶活高峰；果胶酶在第6天达到酶活高峰；漆酶、愈创木酚酶在第2天达到酶活高峰；邻苯二酚氧化酶在第10天和15天分别产生一个酶活高峰。这些规律，对于工厂化液体培养时适时补充合适的营养成分具有较高的指导意义。
Description
（一）技术领域
本发明涉及桑黄，特别涉及一种桑黄工厂化液体发酵过程中酶活规律的测定方法。
（二）背景技术
药用真菌桑黄具有抗癌、抗氧化、增强免疫调节、抗炎、降血脂和抗病毒等作用 ，在传统中药中，其被用于治疗伤口、腹痛和淋病。最近的研究强调了其抗癌和肝脏保护功能。其含有三萜、黄酮、多糖等活性成分。
当前，桑黄产品大部分依赖于桑黄子实体，桑黄子实体生长对环境的依赖性很高，生长周期长，产量不稳定。利用液体培养可以较容易地对各种生长影响因素进行控制和优化，获得稳定高产。
本研究旨在利用成本较低的农产品下脚料和矿物质成分，对它们进行适宜的配比，利用合适的方法进行煮制，来获得桑黄液体培养产物（菌丝体及活性物质产量）的高产。在进行液体培养的过程中进行酶活的跟踪测定，了解多种酶活的产生规律，有研究报道的桑黄酶活产生规律，是基于少量实验室液体培养基培养的前提下获得的，该规律是在工厂发酵罐中进行小试时获得的，更具有生产实用性。该规律的把握可以有效指导控制培养基成分的灵活添加，对于桑黄的扩大生产及工业化生产具有一定的指导意义。
（三）发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，为了获得稳定的液体发酵高产，同时降低成本，本专利进行了桑黄液体发酵过程中酶活规律的研究。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种桑黄培养过程中酶的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）配制培养基：
培养基由以下重量的原料制成：麦麸6-8%，玉米粉2-4%，蛋白胨1-3%，MgSO4·7H2O0.05-0.15%，KH2PO4 0.10-0.15%，K2HPO4·3H2O 0.02-0.04%，其余为水，
配制方法：麦麸放入足量的水中，煮沸45-55min，四层纱布过滤，向滤液中依次加入玉米粉、蛋白胨、MgSO4·7H2O、KH2PO4和K2HPO4·3H2O ，调pH值为6，配制6L培养基；
（2）装罐：将培养基装入10L的发酵罐；
（3）灭菌：在搅拌状态下，夹层蒸汽加热到105-115℃；关闭搅拌，改为直接进蒸汽升温至119℃—124℃，压力0.1±0.05Mpa，保温灭菌；
（4）接种：火焰圈保护接种，向灭菌后的培养基中接入处于迅速生长期的培养8d的桑黄液体菌种；
（5）培养：T为28±0.5℃；罐压为0.05±0.005Mpa；空气流量：0-92h，0.20m³/h,93-358h,0.30m³/h，359-422h，0.20m³/h阶段性调节；搅拌：0-62h，20Hz，63-160h，30Hz，161-332h，20Hz，333-422h，10Hz，
取样对培养基中的多种酶活进行测定。
取样分别对培养液的淀粉酶、羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、漆酶、邻苯二酚氧化酶、愈创木酚酶活性进行测定，测定方法如下：
淀粉酶活性测定：可溶性淀粉溶液中加入粗酶液，32-45℃水浴准确保温，取出后加入配制的DNS试剂，沸水浴加热，取出冷却后加入蒸馏水，混匀，通过紫外可见分光光度计测520nm处的OD值；
羧甲基纤维素酶活性测定：羧甲基纤维素钠溶液中加入粗酶液，42-55℃水浴保温，取出后加入配制的DNS试剂，沸水浴加热，取出冷却后加入蒸馏水，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值；
半纤维素酶活性测定：小麦半纤维素溶液中加入粗酶液，42-55℃水浴保温，取出后加入配制的DNS试剂,沸水浴加热，取出冷却后加入蒸馏水，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值；
果胶酶活性测定：在果胶溶液中加入粗酶液，42-55℃水浴保温，取出后加入配制的DNS试剂,沸水浴加热，取出冷却后加入蒸馏水，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值；
漆酶活性测定：邻联甲苯胺溶液、醋酸盐缓冲液和粗酶液混合得反应液，20-35℃保温后，用紫外分光光度计于600nm处测光密度值；
邻苯二酚氧化酶活性测定：邻苯二酚溶液、磷酸盐缓冲液、粗酶液混合得反应液，反应液20-35℃保温后，用紫外分光光度计于400nm处测光密度值；
愈创木酚酶活性测定：愈创木酚溶液、醋酸盐缓冲液和粗酶液混合得反应液，反应液20-35℃保温后，用紫外分光光度计于490nm处测光密度值。
取样对分别对培养液的淀粉酶、羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、漆酶、邻苯二酚氧化酶、愈创木酚酶活性进行测定，优选测定方法如下：
淀粉酶活性测定：试管中加入0.4-0.6%的可溶性淀粉溶液1-2mL，可溶性淀粉溶液用0.05-0.15mol/L乙酸盐缓冲液配置，加稀释8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL混匀，32-45℃水浴准确保温20-50min，取出后立即加入配制的DNS试剂1-2mL，沸水浴2-8min，取出冷却后加入蒸馏水18-25mL，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10-20min灭活的酶液作对照，酶活性以样品与底物反应20-40min后光密度的改变值表示；
羧甲基纤维素酶活性测定：试管中加入0.4-0.6%的羧甲基纤维素钠溶液1-2mL，羧甲基纤维素钠溶液用0.05-0.15mol/L柠檬酸盐缓冲液配制，加稀释8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL，42-55℃水浴准确保温20-40min，取出后立即加入配制的DNS试剂1-2mL，沸水浴2-8min，取出冷却后加入蒸馏水18-25mL，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10-20min灭活的酶液作对照，酶活性以样品与底物反应20-40min后光密度的改变值表示；
半纤维素酶活性测定：试管中加入0.4-0.6%的小麦半纤维素溶液1-2mL，小麦半纤维素溶液用0.05-0.15mol/L乙酸盐缓冲液配制，加稀释8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL，42-55℃水浴准确保温20-40min，取出后立即加入配制的DNS试剂1-2mL,沸水浴2-8min，取出冷却后加入蒸馏水18-25mL，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10-20min灭活的酶液作对照，酶活性以样品与底物反应20-40min后光密度的改变值表示；
果胶酶活性测定：试管中加入0.5-1.5%的果胶溶液1-2mL,用0.05-0.15mol/L乙酸盐缓冲液配制，加稀释8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL，42-55℃水浴准确保温20-40min，取出后立即加入配制的DNS试剂1-2mL,沸水浴2-8min，取出冷却后加入蒸馏水18-25mL，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10-20min灭活的酶液作对照酶活性以样品与底物反应20-40min后光密度的改变值表示；
漆酶活性测定：试管中加入邻联甲苯胺溶液0.3-0.7mL，0.05-0.15mol/L醋酸盐缓冲液3-4mL和稀释8-12倍的粗酶液0.05-0.2mL，反应液20-35℃保温20-40min后，立即用紫外分光光度计于600nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
邻苯二酚氧化酶活性测定：试管中加入0.05-0.15mol/L邻苯二酚溶液1-3mL， 0.02-0.08mol/L磷酸盐缓冲液1-3mL和稀释8-12倍的粗酶液0.05-0.2mL，反应液20-35℃保温20-40min后，立即用紫外分光光度计于400nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
愈创木酚酶活性测定：试管中加入80mmol/L的愈创木酚溶液0.3-0.7mL，0.05-0.15mol/L醋酸盐缓冲液2-4mL和稀释8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL，反应液20-35℃保温20-40min后，立即用紫外分光光度计于490nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示。
取样对分别对培养液的淀粉酶、羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、漆酶、邻苯二酚氧化酶、愈创木酚酶活性进行测定，更优选测定方法如下：
淀粉酶活性测定：试管中加入0.4-0.6%的可溶性淀粉溶液1-2mL，可溶性淀粉溶液用0.05-0.15mol/L、pH5-6.5的乙酸盐缓冲液配置，加稀释8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL混匀，32-45℃水浴准确保温20-50min，取出后立即加入配制的DNS试剂1-2mL，沸水浴2-8min，取出冷却后加入蒸馏水18-25mL，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10-20min灭活的酶液作对照，酶活性以样品与底物反应20-40min后光密度的改变值表示；
羧甲基纤维素酶活性测定：试管中加入0.4-0.6%的羧甲基纤维素钠溶液1-2mL，羧甲基纤维素钠溶液用0.05-0.15mol/L 、pH4-5.5的柠檬酸盐缓冲液配制，加稀释8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL，42-55℃水浴准确保温20-40min，取出后立即加入配制的DNS试剂1-2mL，沸水浴2-8min，取出冷却后加入蒸馏水18-25mL，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10-20min灭活的酶液作对照，酶活性以样品与底物反应20-40min后光密度的改变值表示；
半纤维素酶活性测定：试管中加入0.4-0.6%的小麦半纤维素溶液1-2mL，小麦半纤维素溶液用0.05-0.15mol/L、pH4-5.5乙酸盐缓冲液配制，加稀释8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL，42-55℃水浴准确保温20-40min，取出后立即加入配制的DNS试剂1-2mL,沸水浴2-8min，取出冷却后加入蒸馏水18-25mL，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10-20min灭活的酶液作对照，酶活性以样品与底物反应20-40min后光密度的改变值表示；
果胶酶活性测定：试管中加入0.5-1.5%的果胶溶液1-2mL,用0.05-0.15mol/L、pH4-5.5的乙酸盐缓冲液配制，加稀释8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL，42-55℃水浴准确保温20-40min，取出后立即加入配制的DNS试剂1-2mL,沸水浴2-8min，取出冷却后加入蒸馏水18-25mL，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10-20min灭活的酶液作对照酶活性以样品与底物反应20-40min后光密度的改变值表示；
漆酶活性测定：试管中加入邻联甲苯胺溶液0.3-0.7mL，0.05-0.15mol/L、pH4-5.5的醋酸盐缓冲液3-4mL和稀释8-12倍的粗酶液0.05-0.2mL，反应液20-35℃保温20-40min后，立即用紫外分光光度计于600nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
邻苯二酚氧化酶活性测定：试管中加入0.05-0.15mol/L邻苯二酚溶液1-3mL， 0.02-0.08mol/L、pH5-7的磷酸盐缓冲液1-3mL和稀释8-12倍的粗酶液0.05-0.2mL，反应液20-35℃保温20-40min后，立即用紫外分光光度计于400nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
愈创木酚酶活性测定：试管中加入80mmol/L的愈创木酚溶液0.3-0.7mL，0.05-0.15mol/L、pH4-5.5的醋酸盐缓冲液2-4mL和稀释8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL，反应液20-35℃保温20-40min后，立即用紫外分光光度计于490nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示。
取样对分别对培养液的淀粉酶、羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、漆酶、邻苯二酚氧化酶、愈创木酚酶活性进行测定，优选测定方法如下：
淀粉酶活性测定：试管中加入0.4-0.6%的可溶性淀粉溶液1-2ml，可溶性淀粉溶液用pH5.2-6.3，0.05-0.15mol/L的乙酸盐缓冲液配置，加稀释9-11倍的粗酶液0.3-0.7mL混匀，32-42℃水浴准确保温20-40min，取出后立即加入配制的DNS试剂1-2mL，沸水浴2-8min，取出冷却后加入蒸馏水19-23mL，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10-20min灭活的酶液作对照，酶活性以样品与底物反应20-40min后光密度的改变值表示；
羧甲基纤维素酶活性测定：试管中加入0.4-0.6%的羧甲基纤维素钠溶液1-2ml，羧甲基纤维素钠溶液用pH4-5.2、0.05-0.15mol/L柠檬酸盐缓冲液配制，加稀释9-11倍的粗酶液0.3-0.7mL，47-53℃水浴准确保温20-40min，取出后立即加入配制的DNS试剂1-2mL，沸水浴2-8min，取出冷却后加入蒸馏水19-23mL，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10-20min灭活的酶液作对照，酶活性以样品与底物反应20-40min后光密度的改变值表示；
半纤维素酶活性测定：试管中加入0.4-0.6%的小麦半纤维素溶液1-2ml，小麦半纤维素溶液用pH4-5.2、0.05-0.15mol/L乙酸盐缓冲液配制，加稀释9-11倍的粗酶液0.3-0.7mL，47-53℃水浴准确保温20-40min，取出后立即加入配制的DNS试剂1-2mL,沸水浴2-8min，取出冷却后加入蒸馏水19-23mL，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10-20min灭活的酶液作对照，酶活性以样品与底物反应20-40min后光密度的改变值表示；
果胶酶活性测定：试管中加入0.5-1.5%的果胶溶液1-2ml，果胶溶液用pH4-5、0.05-0.15mol/L乙酸盐缓冲液配制, 加稀释9-11倍的粗酶液0.3-0.7mL，47-53℃水浴准确保温20-40min，取出后立即加入配制的DNS试剂1-2mL,沸水浴2-8min，取出冷却后加入蒸馏水19-23mL，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10-20min灭活的酶液作对照，酶活性以样品与底物反应20-40min后光密度的改变值表示；
漆酶活性测定：试管中加入邻联甲苯胺溶液0.3-0.7mL、0.05-0.15mol/L、pH4.2-5.2醋酸盐缓冲液2.8-3.8mL和稀释9-11倍的粗酶液0.05-0.15mL，反应液24-32℃保温20-40min后，立即用紫外分光光度计于600nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
邻苯二酚氧化酶活性测定：试管中加入0.05-0.15mol/L的邻苯二酚溶液1-3mL、 0.03-0.06mol/L、pH5.5-6.5磷酸盐缓冲液1-3mL和稀释9-11倍的粗酶液0.05-0.15mL，反应液24-32℃保温20-40min后，立即用紫外分光光度计于400nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
愈创木酚酶活性测定：试管中加入80mmol/L的愈创木酚溶液0.3-0.7mL，0.05-0.15mol/L、pH4.2-5.2醋酸盐缓冲液2-4mL和稀释9-11倍的粗酶液0.3-0.7mL，反应液24-32℃保温20-40min后，立即用紫外分光光度计于490nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示。
取样对分别对培养液的淀粉酶、羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、漆酶、邻苯二酚氧化酶、愈创木酚酶活性进行测定，最优选测定方法如下：
淀粉酶活性测定：试管中加入0.5%的可溶性淀粉溶液1.5mL，可溶性淀粉溶液用pH5.8，0.1mol/L乙酸盐缓冲液配置，加稀释10倍的粗酶液0.5mL混匀，38℃水浴准确保温30min，取出后立即加入配制的DNS试剂1.5mL，沸水浴5min，取出冷却后加入蒸馏水21.5mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸15min灭活的酶液作对照，重复测试，酶活性以样品与底物反应30min后光密度的改变值表示；
羧甲基纤维素酶活性测定：试管中加入0.5%的羧甲基纤维素钠溶液1.5mL，羧甲基纤维素钠溶液用pH4.6,0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液配制，加稀释10倍的粗酶液0.5mL，50℃水浴准确保温30min，取出后立即加入配制的DNS试剂1.5mL，沸水浴5min，取出冷却后加入蒸馏水21.5mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸15min灭活的酶液作对照，重复测试，酶活性以样品与底物反应30min后光密度的改变值表示；
半纤维素酶活性测定：试管中加入0.5%的小麦半纤维素溶液1.5mL，小麦半纤维素溶液用pH4.6,0.1mol/L乙酸盐缓冲液配制，加稀释10倍的粗酶液0.5mL，50℃水浴准确保温30min，取出后立即加入配制的DNS试剂1.5mL,沸水浴5min，取出冷却后加入蒸馏水21.5mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸15min灭活的酶液作对照，重复测试，酶活性以样品与底物反应30min后光密度的改变值表示；
果胶酶活性测定：试管中加入1%的果胶溶液1.5mL，果胶溶液用pH4.5,0.1mol/L乙酸盐缓冲液配制，加稀释10倍的粗酶液0.5mL，50℃水浴准确保温30min，取出后立即加入配制的DNS试剂1.5mL,沸水浴5min，取出冷却后加入蒸馏水21.5mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸15min灭活的酶液作对照，重复测试，酶活性以样品与底物反应30min后光密度的改变值表示；
漆酶活性测定：试管中加入邻联甲苯胺溶液0.5mL，0.1mol/L、pH4.6醋酸盐缓冲液3.4mL和稀释10倍的粗酶液0.1mL，反应液28℃保温30min后，立即用7230G型紫外分光光度计于600nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
邻苯二酚氧化酶活性测定：试管中加入0.1M的邻苯二酚溶液2.0mL ，0.05mol/L、pH6.0磷酸盐缓冲液2.0mL和稀释10倍的粗酶液0.1mL，反应液28℃保温30min后，立即用7230G型紫外分光光度计于400nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
愈创木酚酶活性测定：试管中加入80mmol/L的愈创木酚溶液0.5mL，0.1mol/L、pH4.6醋酸盐缓冲液3.0mL和稀释10倍的粗酶液0.5mL，反应液28℃保温30min后，立即用7230G型紫外分光光度计于490nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示。
本发明的有益效果是：本发明原料选取方便，成本低，利用研究所得配方可以获得桑黄菌丝体及胞外活性物质的高产。菌丝体产量达到4.6217g/100mL（46.217mg/mL）。远远高于Kim DH等的菌丝体产量1.42 g / 100mL和李翠翠等的菌丝体产量0.356 g / 100mL。胞外黄酮产量达到16.198mg/mL。胞外三萜类化合物产量达到5.736mg/mL。
淀粉酶、羧甲基纤维素酶、半纤维素酶都在培养的第7天达到酶活高峰，OD值为0.27；果胶酶在培养的第6天达到酶活高峰，OD值为0.136；漆酶、愈创木酚酶在培养的第2天达到酶活高峰，OD值分别为0.066和0.114；愈创木酚酶在第8天又出现第二个小高峰，OD值为0.102；邻苯二酚氧化酶在培养的第10天和15天分别产生一个酶活高峰，OD值分别为0.351和0.415。
在发酵过程中，通过测试可知，淀粉酶、羧甲基纤维素酶、半纤维素酶都在培养的第7天达到酶活高峰；果胶酶在培养的第6天达到酶活高峰；漆酶、愈创木酚酶在培养的第2天达到酶活高峰，愈创木酚酶在第8天又出现第二个小高峰；邻苯二酚氧化酶在培养的第10天和15天分别产生一个酶活高峰，第15天的更高一些。
酶活性反应菌丝生长过程中对培养基中营养物质的吸收利用情况。淀粉酶酶活说明桑黄具有降解多糖类物质的能力，羧甲基纤维素酶酶活说明桑黄具有降解纤维素的能力，半纤维素酶酶活说明桑黄具有降解半纤维素的能力，果胶酶酶活说明桑黄具有降解果胶的能力，漆酶、愈创木酚酶、邻苯二酚氧化酶酶活说明桑黄具有降解木质素的能力。7种酶酶活高峰先后出现，漆酶、愈创木酚酶最早达到高峰，之后是果胶酶，然后是淀粉酶、羧甲基纤维素酶、半纤维素酶，最后是邻苯二酚氧化酶，说明桑黄对木质素有优先利用的特点，再利用果胶，之后利用淀粉、羧甲基纤维素、半纤维素，邻苯二酚氧化酶的活性高峰说明桑黄在液体培养的中后期更多利用木质素。这些规律的把握，对于工厂化液体培养时适时补充合适的营养成分具有较高的指导意义。
（四）附图说明
图1为淀粉酶酶活变化规律图；
图2为羧甲基纤维素酶酶活变化规律图；
图3为半纤维素酶酶活变化规律图；
图4为果胶酶酶活变化规律图；
图5为漆酶酶活变化规律图；
图6为邻苯二酚氧化酶酶活变化规律图；
图7为愈创木酚氧化酶酶活变化规律图。
（五）具体实施方式
实施例1
1.配制培养基：
按照配方组成（麦麸7%，玉米粉3%，蛋白胨2%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO4 0.12%，K2HPO4·3H2O 0.03% ）
配制方法（麦麸放入足量的水中，煮沸50min，四层纱布过滤，向滤液中依次加入玉米粉、蛋白胨、MgSO4·7H2O、KH2PO4和K2HPO4·3H2O ，调pH值为6）配制6L培养基。
2.装罐：将培养基装入10L的发酵罐（生产厂家：扬州新亚；容积：10L；电机配置：200w，50Hz，1300rpm；搅拌：两层圆盘直叶搅拌，一层搅拌桨；空气喷管：多孔圆环下喷式喷管）。
3.灭菌：在搅拌状态下，夹层蒸汽加热到110℃；关闭搅拌，改为直接进蒸汽升温至119℃—124℃，压力0.1±0.05Mpa，保温20min灭菌。
4.接种：火焰圈保护接种。向灭菌后的培养基中以10%的比例接入处于迅速生长期的培养8d的桑黄液体菌种。
5.培养：提供条件，开始培养（T：28±0.5℃；罐压：0.05±0.005Mpa；空气流量：0-92h，0.20m³/h,93-358h,0.30m³/h，359-422h，0.20m³/h阶段性调节；搅拌：0-62h，20Hz，63-160h，30Hz，161-332h，20Hz，333-422h，10Hz）。
每天定时取样对培养液的多种酶活进行测定，测定方法如下：
淀粉酶活性测定：试管中加入0.5%的可溶性淀粉溶液1.5mL，可溶性淀粉溶液用pH5.8，0.1mol/L乙酸盐缓冲液配置，加稀释10倍的粗酶液0.5mL混匀，38℃水浴准确保温30min，取出后立即加入配制的DNS试剂1.5mL，沸水浴5min，取出冷却后加入蒸馏水21.5mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸15min灭活的酶液作对照，每组3个重复，酶活性以样品与底物反应30min后光密度的改变值表示；
羧甲基纤维素酶活性测定：试管中加入0.5%的羧甲基纤维素钠溶液1.5mL，羧甲基纤维素钠溶液用pH4.6,0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液配制，加稀释10倍的粗酶液0.5mL，50℃水浴准确保温30min，取出后立即加入配制的DNS试剂1.5mL，沸水浴5min，取出冷却后加入蒸馏水21.5mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸15min灭活的酶液作对照，每组3个重复，酶活性以样品与底物反应30min后光密度的改变值表示；
半纤维素酶活性测定：试管中加入0.5%的小麦半纤维素溶液1.5mL，小麦半纤维素溶液用pH4.6,0.1mol/L乙酸盐缓冲液配制，加稀释10倍的粗酶液0.5mL，50℃水浴准确保温30min，取出后立即加入配制的DNS试剂1.5mL,沸水浴5min，取出冷却后加入蒸馏水21.5mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸15min灭活的酶液作对照，每组3个重复，酶活性以样品与底物反应30min后光密度的改变值表示；
果胶酶活性测定：试管中加入1%的果胶溶液1.5mL，果胶溶液用pH4.5,0.1M乙酸盐缓冲液配制，加稀释10倍的粗酶液0.5mL，50℃水浴准确保温30min，取出后立即加入配制的DNS试剂1.5mL,沸水浴5min，取出冷却后加入蒸馏水21.5mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸15min灭活的酶液作对照，每组3个重复，酶活性以样品与底物反应30min后光密度的改变值表示；
漆酶活性测定：试管中加入邻联甲苯胺溶液0.5mL，0.1mol/L、pH4.6醋酸盐缓冲液3.4mL和稀释10倍的粗酶液0.1mL，反应液28℃保温30min后，立即用7230G型紫外分光光度计于600nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
邻苯二酚氧化酶活性测定：试管中加入0.1mol/L的邻苯二酚溶液2.0mL ，0.05mol/L、pH6.0磷酸盐缓冲液2.0mL和稀释10倍的粗酶液0.1mL，反应液28℃保温30min后，立即用7230G型紫外分光光度计于400nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
愈创木酚酶活性测定：试管中加入80mmol/L的愈创木酚溶液0.5mL，0.1mol/L、pH4.6醋酸盐缓冲液3.0mL和稀释10倍的粗酶液0.5mL，反应液28℃保温30min后，立即用7230G型紫外分光光度计于490nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示。
通过测试图1-7可知，淀粉酶、羧甲基纤维素酶、半纤维素酶都在培养的第7天达到酶活高峰，OD值为0.27；果胶酶在培养的第6天达到酶活高峰，OD值为0.136；漆酶、愈创木酚酶在培养的第2天达到酶活高峰，OD值分别为0.066和0.114；愈创木酚酶在第8天又出现第二个小高峰，OD值为0.102；邻苯二酚氧化酶在培养的第10天和15天分别产生一个酶活高峰，OD值分别为0.351和0.415。
实施例2
1.配制培养基：
按照配方组成（麦麸6%，玉米粉4%，蛋白胨3%，MgSO4·7H2O 0.05%，KH2PO4 0.10%，K2HPO4·3H2O 0.04% ）
配制方法（麦麸放入足量的水中，煮沸55min，四层纱布过滤，向滤液中依次加入玉米粉、蛋白胨、MgSO4·7H2O、KH2PO4和K2HPO4·3H2O ，调pH值为6）配制6L培养基。
2.装罐：将培养基装入10L的发酵罐（生产厂家：扬州新亚；容积：10L；电机配置：200w，50Hz，1300rpm；搅拌：两层圆盘直叶搅拌，一层搅拌桨；空气喷管：多孔圆环下喷式喷管）。
3.灭菌：在搅拌状态下，夹层蒸汽加热到110℃；关闭搅拌，改为直接进蒸汽升温至119℃—124℃，压力0.1±0.05Mpa，保温20min灭菌。
4.接种：火焰圈保护接种。向灭菌后的培养基中以10%的比例接入处于迅速生长期的培养8d的桑黄液体菌种。
5.培养：提供条件，开始培养（T：28±0.5℃；罐压：0.05±0.005Mpa；空气流量：0-92h，0.20m³/h,93-358h,0.30m³/h，359-422h，0.20m³/h阶段性调节；搅拌：0-62h，20Hz，63-160h，30Hz，161-332h，20Hz，333-422h，10Hz）。
每天定时取样对培养液的多种酶活进行测定，测定方法如下：
淀粉酶活性测定：试管中加入0.4%的可溶性淀粉溶液2ml，可溶性淀粉溶液用pH6.3，0.05mol/L的乙酸盐缓冲液配置，加稀释9倍的粗酶液0.3mL混匀，32℃水浴准确保温40min，取出后立即加入配制的DNS试剂1mL，沸水浴2min，取出冷却后加入蒸馏水23mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10min灭活的酶液作对照，每组3个重复，酶活性以样品与底物反应40min后光密度的改变值表示；
羧甲基纤维素酶活性测定：试管中加入0.4%的羧甲基纤维素钠溶液2ml，羧甲基纤维素钠溶液用pH4、0.15mol/L柠檬酸盐缓冲液配制，加稀释11倍的粗酶液0.7mL，47℃水浴准确保温40min，取出后立即加入配制的DNS试剂2mL，沸水浴8min，取出冷却后加入蒸馏水19mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸20min灭活的酶液作对照，酶活性以样品与底物反应20min后光密度的改变值表示；
半纤维素酶活性测定：试管中加入0.4%的小麦半纤维素溶液2ml，小麦半纤维素溶液用pH4、0.05mol/L乙酸盐缓冲液配制，加稀释9倍的粗酶液0.3mL，53℃水浴准确保温20min，取出后立即加入配制的DNS试剂1mL,沸水浴2min，取出冷却后加入蒸馏水23mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10min灭活的酶液作对照，每组3个重复，酶活性以样品与底物反应40min后光密度的改变值表示；
果胶酶活性测定：试管中加入1.5%的果胶溶液1ml，果胶溶液用pH4、0.05mol/L乙酸盐缓冲液配制, 加稀释11倍的粗酶液0.7mL， 53℃水浴准确保温20min，取出后立即加入配制的DNS试剂2mL,沸水浴8min，取出冷却后加入蒸馏水19mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸20min灭活的酶液作对照，每组3个重复，酶活性以样品与底物反应20min后光密度的改变值表示；
漆酶活性测定：试管中加入邻联甲苯胺溶液0.3mL、0.15mol/L、pH5.2醋酸盐缓冲液2.8mL和稀释11倍的粗酶液0.15mL，反应液24℃保温40min后，立即用7230G型紫外分光光度计于600nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
邻苯二酚氧化酶活性测定：试管中加入0.15mol/L的邻苯二酚溶液1mL、 0.06mol/L、pH5.5磷酸盐缓冲液1mL和稀释9倍的粗酶液0.05mL，反应液32℃保温20min后，立即用7230G型紫外分光光度计于400nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
愈创木酚酶活性测定：试管中加入80mmol/L的愈创木酚溶液0.3mL，0.05mol/L、pH4.2醋酸盐缓冲液4mL和稀释11倍的粗酶液0.7mL，反应液24℃保温40min后，立即用7230G型紫外分光光度计于490nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示。
实施例3
1.配制培养基：
按照配方组成（麦麸8%，玉米粉2%，蛋白胨1%，MgSO4·7H2O 0.15%，KH2PO4 0.15%，K2HPO4·3H2O 0.02% ）
配制方法（麦麸放入足量的水中，煮沸45min，四层纱布过滤，向滤液中依次加入玉米粉、蛋白胨、MgSO4·7H2O、KH2PO4和K2HPO4·3H2O ，调pH值为6）配制6L培养基。
2.装罐：将培养基装入10L的发酵罐（生产厂家：扬州新亚；容积：10L；电机配置：200w，50Hz，1300rpm；搅拌：两层圆盘直叶搅拌，一层搅拌桨；空气喷管：多孔圆环下喷式喷管）。
3.灭菌：在搅拌状态下，夹层蒸汽加热到110℃；关闭搅拌，改为直接进蒸汽升温至119℃—124℃，压力0.1±0.05Mpa，保温20min灭菌。
4.接种：火焰圈保护接种。向灭菌后的培养基中以10%的比例接入处于迅速生长期的培养8d的桑黄液体菌种。
5.培养：提供条件，开始培养（T：28±0.5℃；罐压：0.05±0.005Mpa；空气流量：0-92h，0.20m³/h,93-358h,0.30m³/h，359-422h，0.20m³/h阶段性调节；搅拌：0-62h，20Hz，63-160h，30Hz，161-332h，20Hz，333-422h，10Hz）。
每天定时取样对培养液的多种酶活进行测定，测定方法如下：
淀粉酶活性测定：试管中加入0.6%的可溶性淀粉溶液1ml，可溶性淀粉溶液用pH5.2，0.05mol/L的乙酸盐缓冲液配置，加稀释11倍的粗酶液0.7mL混匀，42℃水浴准确保温20min，取出后立即加入配制的DNS试剂2mL，沸水浴8min，取出冷却后加入蒸馏水19mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸20min灭活的酶液作对照，每组3个重复，酶活性以样品与底物反应20min后光密度的改变值表示；
羧甲基纤维素酶活性测定：试管中加入0.6%的羧甲基纤维素钠溶液1ml，羧甲基纤维素钠溶液用pH5.2、0.05mol/L柠檬酸盐缓冲液配制，加稀释9倍的粗酶液0.3mL，53℃水浴准确保温20min，取出后立即加入配制的DNS试剂1mL，沸水浴2min，取出冷却后加入蒸馏水23mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10min灭活的酶液作对照，每组3个重复，酶活性以样品与底物反应40min后光密度的改变值表示；
半纤维素酶活性测定：试管中加入0.6%的小麦半纤维素溶液1ml，小麦半纤维素溶液用pH5.2、0.15mol/L乙酸盐缓冲液配制，加稀释11倍的粗酶液0.7mL，47℃水浴准确保温40min，取出后立即加入配制的DNS试剂2mL,沸水浴8min，取出冷却后加入蒸馏水19mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸20min灭活的酶液作对照，每组3个重复，酶活性以样品与底物反应20min后光密度的改变值表示；
果胶酶活性测定：试管中加入0.5%的果胶溶液2ml，果胶溶液用pH5、0.15mol/L乙酸盐缓冲液配制, 加稀释9倍的粗酶液0.3mL，47℃水浴准确保温20min，取出后立即加入配制的DNS试剂1mL,沸水浴2min，取出冷却后加入蒸馏水23mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10min灭活的酶液作对照，每组3个重复，酶活性以样品与底物反应40min后光密度的改变值表示；
漆酶活性测定：试管中加入邻联甲苯胺溶液0.7mL、0.05mol/L、pH4.2醋酸盐缓冲液3.8mL和稀释9倍的粗酶液0.05mL，反应液32℃保温20min后，立即用7230G型紫外分光光度计于600nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
邻苯二酚氧化酶活性测定：试管中加入0.05mol/L的邻苯二酚溶液3mL、 0.03mol/L、pH5.5磷酸盐缓冲液3mL和稀释11倍的粗酶液0.15mL，反应液24℃保温40min后，立即用7230G型紫外分光光度计于400nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
愈创木酚酶活性测定：试管中加入80mmol/L的愈创木酚溶液0.7mL， 0.15mol/L、pH5.2醋酸盐缓冲液2mL和稀释9倍的粗酶液0.3mL，反应液32℃保温20min后，立即用7230G型紫外分光光度计于490nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示。
实施例4
1.配制培养基：
按照配方组成（麦麸7%，玉米粉3%，蛋白胨2%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO4 0.12%，K2HPO4·3H2O 0.03% ）
配制方法（麦麸放入足量的水中，煮沸50min，四层纱布过滤，向滤液中依次加入玉米粉、蛋白胨、MgSO4·7H2O、KH2PO4和K2HPO4·3H2O，调pH值为6）配制6L培养基。
2.装罐：将培养基装入10L的发酵罐（生产厂家：扬州新亚；容积：10L；电机配置：200w，50Hz，1300rpm；搅拌：两层圆盘直叶搅拌，一层搅拌桨；空气喷管：多孔圆环下喷式喷管）。
3.灭菌：在搅拌状态下，夹层蒸汽加热到110℃；关闭搅拌，改为直接进蒸汽升温至119℃—124℃，压力0.1±0.05Mpa，保温20min灭菌。
4.接种：火焰圈保护接种。向灭菌后的培养基中以10%的比例接入处于迅速生长期的培养8d的桑黄液体菌种。
5.培养：提供条件，开始培养（T：28±0.5℃；罐压：0.05±0.005Mpa；空气流量：0-92h，0.20m³/h,93-358h,0.30m³/h，359-422h，0.20m³/h阶段性调节；搅拌：0-62h，20Hz，63-160h，30Hz，161-332h，20Hz，333-422h，10Hz）。
每天定时取样对培养液的多种酶活进行测定，测定方法如下：
淀粉酶活性测定：试管中加入0.5%的可溶性淀粉溶液1.5mL，可溶性淀粉溶液用pH5.8，0.1mol/L乙酸盐缓冲液配置，加稀释8倍的粗酶液0.7mL混匀，32℃水浴准确保温50min，取出后立即加入配制的DNS试剂1.5mL，沸水浴5min，取出冷却后加入蒸馏水21.5mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸15min灭活的酶液作对照，每组3个重复，酶活性以样品与底物反应30min后光密度的改变值表示；
羧甲基纤维素酶活性测定：试管中加入0.5%的羧甲基纤维素钠溶液1.5mL，羧甲基纤维素钠溶液用pH4.6,0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液配制，加稀释8倍的粗酶液0.3mL，42℃水浴准确保温40min，取出后立即加入配制的DNS试剂1.5mL，沸水浴5min，取出冷却后加入蒸馏水21.5mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸15min灭活的酶液作对照，每组3个重复，酶活性以样品与底物反应30min后光密度的改变值表示；
半纤维素酶活性测定：试管中加入0.5%的小麦半纤维素溶液1.5mL，小麦半纤维素溶液用pH4.6,0,1mol/L乙酸盐缓冲液配制，加稀释10倍的粗酶液0.5mL，50℃水浴准确保温30min，取出后立即加入配制的DNS试剂1.5mL,沸水浴5min，取出冷却后加入蒸馏水21.5mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸15min灭活的酶液作对照，每组3个重复，酶活性以样品与底物反应30min后光密度的改变值表示；
果胶酶活性测定：试管中加入1%的果胶溶液1.5mL，果胶溶液用pH4.5,0.1mol/L乙酸盐缓冲液配制，加稀释8倍的粗酶液0.3mL，42℃水浴准确保温40min，取出后立即加入配制的DNS试剂1.5mL,沸水浴5min，取出冷却后加入蒸馏水18mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸15min灭活的酶液作对照，每组3个重复，酶活性以样品与底物反应30min后光密度的改变值表示；
漆酶活性测定：试管中加入邻联甲苯胺溶液0.5mL，0.1mol/L、pH4.6醋酸盐缓冲液3mL和稀释8倍的粗酶液0.05mL，反应液35℃保温30min后，立即用7230G型紫外分光光度计于600nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
邻苯二酚氧化酶活性测定：试管中加入0.1mol/L的邻苯二酚溶液2.0mL ，0.05mol/L、pH6.0磷酸盐缓冲液2.0mL和稀释8倍的粗酶液0.05mL，反应液20℃保温40min后，立即用7230G型紫外分光光度计于400nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
愈创木酚酶活性测定：试管中加入80mmol/L的愈创木酚溶液0.5mL，0.1mol/L、pH4.6醋酸盐缓冲液3.0mL和稀释8倍的粗酶液0.3mL，反应液20℃保温40min后，立即用7230G型紫外分光光度计于490nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示。
实施例5
1.配制培养基：
按照配方组成（麦麸7%，玉米粉3%，蛋白胨2%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO4 0.12%，K2HPO4·3H2O 0.03% ）
配制方法（麦麸放入足量的水中，煮沸50min，四层纱布过滤，向滤液中依次加入玉米粉、蛋白胨、MgSO4·7H2O、KH2PO4和K2HPO4·3H2O ，调pH值为6）配制6L培养基。
2.装罐：将培养基装入10L的发酵罐（生产厂家：扬州新亚；容积：10L；电机配置：200w，50Hz，1300rpm；搅拌：两层圆盘直叶搅拌，一层搅拌桨；空气喷管：多孔圆环下喷式喷管）。
3.灭菌：在搅拌状态下，夹层蒸汽加热到110℃；关闭搅拌，改为直接进蒸汽升温至119℃—124℃，压力0.1±0.05Mpa，保温20min灭菌。
4.接种：火焰圈保护接种。向灭菌后的培养基中以10%的比例接入处于迅速生长期的培养8d的桑黄液体菌种。
5.培养：提供条件，开始培养（T：28±0.5℃；罐压：0.05±0.005Mpa；空气流量：0-92h，0.20m³/h,93-358h,0.30m³/h，359-422h，0.20m³/h阶段性调节；搅拌：0-62h，20Hz，63-160h，30Hz，161-332h，20Hz，333-422h，10Hz）。
每天定时取样对培养液的多种酶活进行测定，测定方法如下：
淀粉酶活性测定：试管中加入0.5%的可溶性淀粉溶液1.5mL，可溶性淀粉溶液用pH5.8，0.1mol/L乙酸盐缓冲液配置，加稀释12倍的粗酶液0.3mL混匀，45℃水浴准确保温20min，取出后立即加入配制的DNS试剂1.5mL，沸水浴5min，取出冷却后加入蒸馏水21.5mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸15min灭活的酶液作对照，每组3个重复，酶活性以样品与底物反应30min后光密度的改变值表示；
羧甲基纤维素酶活性测定：试管中加入0.5%的羧甲基纤维素钠溶液1.5mL，羧甲基纤维素钠溶液用pH4.6,0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液配制，加稀释12倍的粗酶液0.7mL，55℃水浴准确保温20min，取出后立即加入配制的DNS试剂1.5mL，沸水浴5min，取出冷却后加入蒸馏水21.5mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸15min灭活的酶液作对照，每组3个重复，酶活性以样品与底物反应30min后光密度的改变值表示；
半纤维素酶活性测定：试管中加入0.5%的小麦半纤维素溶液1.5mL，小麦半纤维素溶液用pH4.6,0.1mol/L乙酸盐缓冲液配制，加稀释10倍的粗酶液0.5mL，50℃水浴准确保温30min，取出后立即加入配制的DNS试剂1.5mL,沸水浴5min，取出冷却后加入蒸馏水21.5mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸15min灭活的酶液作对照，每组3个重复，酶活性以样品与底物反应30min后光密度的改变值表示；
果胶酶活性测定：试管中加入1%的果胶溶液1.5mL，果胶溶液用pH4.5,0.1mol/L乙酸盐缓冲液配制，加稀释12倍的粗酶液0.7mL，55℃水浴准确保温20min，取出后立即加入配制的DNS试剂1.5mL,沸水浴5min，取出冷却后加入蒸馏水25mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸15min灭活的酶液作对照，每组3个重复，酶活性以样品与底物反应30min后光密度的改变值表示；
漆酶活性测定：试管中加入邻联甲苯胺溶液0.5mL，0.1mol/L、pH4.6醋酸盐缓冲液4mL和稀释12倍的粗酶液0.2mL，反应液20℃保温30min后，立即用7230G型紫外分光光度计于600nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
邻苯二酚氧化酶活性测定：试管中加入0.1mol/L的邻苯二酚溶液2.0mL ，0.05mol/L、pH6.0磷酸盐缓冲液2.0mL和稀释12倍的粗酶液0.2mL，反应液35℃保温20min后，立即用7230G型紫外分光光度计于400nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
愈创木酚酶活性测定：试管中加入80mmol/L的愈创木酚溶液0.5mL，0.1mol/L、pH4.6醋酸盐缓冲液3.0mL和稀释12倍的粗酶液0.7mL，反应液35℃保温20min后，立即用7230G型紫外分光光度计于490nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示。
需要说明的是，虽然本发明已将较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明方法。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明方案范围的情况下，都可以利用上述揭示的技术内容对本发明方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此未脱离本发明方案的内容，依据本发明实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应落在本发明方案保护的范围内。
Claims (6)
1.一种桑黄工厂化液体发酵过程中酶活规律的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）配制培养基：
培养基由以下重量的原料制成：麦麸6-8%，玉米粉2-4%，蛋白胨1-3%，MgSO4·7H2O0.05-0.15%，KH2PO4 0.10-0.15%，K2HPO4·3H2O0.02-0.04%，其余为水，
配制方法：麦麸放入足量的水中，煮沸45-55min，四层纱布过滤，向滤液中依次加入玉米粉、蛋白胨、MgSO4·7H2O、KH2PO4和K2HPO4·3H2O ，调pH值为6，配制6L培养基；
（2）装罐：将培养基装入10L的发酵罐；
（3）灭菌：在搅拌状态下，夹层蒸汽加热到105-115℃；关闭搅拌，改为直接进蒸汽升温至119℃—124℃，压力0.1±0.05Mpa，保温灭菌；
（4）接种：火焰圈保护接种，向灭菌后的培养基中接入处于迅速生长期的培养8d的桑黄液体菌种；
（5）培养：T为28±0.5℃；罐压为0.05±0.005Mpa；空气流量：0-92h，0.20m³/h,93-358h,0.30m³/h，359-422h，0.20m³/h阶段性调节；搅拌：0-62h，20Hz，63-160h，30Hz，161-332h，20Hz，333-422h，10Hz，
取样对培养基中的多种酶进行测定。
2.根据权利要求1所述的桑黄培养过程中酶的测定方法，其特征在于：取样对分别对培养液的淀粉酶、羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、漆酶、邻苯二酚氧化酶、愈创木酚酶活性进行测定，测定方法如下：
淀粉酶活性测定：可溶性淀粉溶液中加入粗酶液，32-45℃水浴准确保温，取出后加入配制的DNS试剂，沸水浴加热，取出冷却后加入蒸馏水，混匀，通过紫外可见分光光度计测520nm处的OD值；
羧甲基纤维素酶活性测定：羧甲基纤维素钠溶液中加入粗酶液，42-55℃水浴保温，取出后加入配制的DNS试剂，沸水浴加热，取出冷却后加入蒸馏水，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值；
半纤维素酶活性测定：小麦半纤维素溶液中加入粗酶液，42-55℃水浴保温，取出后加入配制的DNS试剂,沸水浴加热，取出冷却后加入蒸馏水，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值；
果胶酶活性测定：在果胶溶液中加入粗酶液，42-55℃水浴保温，取出后加入配制的DNS试剂,沸水浴加热，取出冷却后加入蒸馏水，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值；
漆酶活性测定：邻联甲苯胺溶液、醋酸盐缓冲液和粗酶液混合得反应液，20-35℃保温后，用紫外分光光度计于600nm处测光密度值；
邻苯二酚氧化酶活性测定：邻苯二酚溶液、磷酸盐缓冲液、粗酶液混合得反应液，反应液20-35℃保温后，用紫外分光光度计于400nm处测光密度值；
愈创木酚酶活性测定：愈创木酚溶液、醋酸盐缓冲液和粗酶液混合得反应液，反应液20-35℃保温后，用紫外分光光度计于490nm处测光密度值。
3.根据权利要求2所述的桑黄培养过程中酶的测定方法，其特征在于：取样对分别对培养液的淀粉酶、羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、漆酶、邻苯二酚氧化酶、愈创木酚酶活性进行测定，测定方法如下：
淀粉酶活性测定：试管中加入0.4-0.6%的可溶性淀粉溶液1-2mL，可溶性淀粉溶液用0.05-0.15mol/L乙酸盐缓冲液配置，加稀释8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL混匀，32-45℃水浴准确保温20-50min，取出后立即加入配制的DNS试剂1-2mL，沸水浴2-8min，取出冷却后加入蒸馏水18-25mL，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10-20min灭活的酶液作对照，酶活性以样品与底物反应20-40min后光密度的改变值表示；
羧甲基纤维素酶活性测定：试管中加入0.4-0.6%的羧甲基纤维素钠溶液1-2mL，羧甲基纤维素钠溶液用0.05-0.15mol/L柠檬酸盐缓冲液配制，加稀释8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL，42-55℃水浴准确保温20-40min，取出后立即加入配制的DNS试剂1-2mL，沸水浴2-8min，取出冷却后加入蒸馏水18-25mL，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10-20min灭活的酶液作对照，酶活性以样品与底物反应20-40min后光密度的改变值表示；
半纤维素酶活性测定：试管中加入0.4-0.6%的小麦半纤维素溶液1-2mL，小麦半纤维素溶液用0.05-0.15mol/L乙酸盐缓冲液配制，加稀释8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL，42-55℃水浴准确保温20-40min，取出后立即加入配制的DNS试剂1-2mL,沸水浴2-8min，取出冷却后加入蒸馏水18-25mL，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10-20min灭活的酶液作对照，酶活性以样品与底物反应20-40min后光密度的改变值表示；
果胶酶活性测定：试管中加入0.5-1.5%的果胶溶液1-2mL,用0.05-0.15mol/L乙酸盐缓冲液配制，加稀释8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL，42-55℃水浴准确保温20-40min，取出后立即加入配制的DNS试剂1-2mL,沸水浴2-8min，取出冷却后加入蒸馏水18-25mL，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10-20min灭活的酶液作对照酶活性以样品与底物反应20-40min后光密度的改变值表示；
漆酶活性测定：试管中加入邻联甲苯胺溶液0.3-0.7mL，0.05-0.15mol/L醋酸盐缓冲液3-4mL和稀释8-12倍的粗酶液0.05-0.2mL，反应液20-35℃保温20-40min后，立即用紫外分光光度计于600nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
邻苯二酚氧化酶活性测定：试管中加入0.05-0.15mol/L邻苯二酚溶液1-3mL， 0.02-0.08mol/L磷酸盐缓冲液1-3mL和稀释8-12倍的粗酶液0.05-0.2mL，反应液20-35℃保温20-40min后，立即用紫外分光光度计于400nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
愈创木酚酶活性测定：试管中加入80mmol/L的愈创木酚溶液0.3-0.7mL，0.05-0.15mol/L醋酸盐缓冲液2-4mL和稀释8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL，反应液20-35℃保温20-40min后，立即用紫外分光光度计于490nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示。
4.根据权利要求3所述的桑黄培养过程中酶的测定方法，其特征在于：取样对分别对培养液的淀粉酶、羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、漆酶、邻苯二酚氧化酶、愈创木酚酶活性进行测定，测定方法如下：
淀粉酶活性测定：试管中加入0.4-0.6%的可溶性淀粉溶液1-2mL，可溶性淀粉溶液用0.05-0.15mol/L、pH5-6.5的乙酸盐缓冲液配置，加稀释8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL混匀，32-45℃水浴准确保温20-50min，取出后立即加入配制的DNS试剂1-2mL，沸水浴2-8min，取出冷却后加入蒸馏水18-25mL，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10-20min灭活的酶液作对照，酶活性以样品与底物反应20-40min后光密度的改变值表示；
羧甲基纤维素酶活性测定：试管中加入0.4-0.6%的羧甲基纤维素钠溶液1-2mL，羧甲基纤维素钠溶液用0.05-0.15mol/L 、pH4-5.5的柠檬酸盐缓冲液配制，加稀释8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL，42-55℃水浴准确保温20-40min，取出后立即加入配制的DNS试剂1-2mL，沸水浴2-8min，取出冷却后加入蒸馏水18-25mL，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10-20min灭活的酶液作对照，酶活性以样品与底物反应20-40min后光密度的改变值表示；
半纤维素酶活性测定：试管中加入0.4-0.6%的小麦半纤维素溶液1-2mL，小麦半纤维素溶液用0.05-0.15mol/L、pH4-5.5乙酸盐缓冲液配制，加稀释8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL，42-55℃水浴准确保温20-40min，取出后立即加入配制的DNS试剂1-2mL,沸水浴2-8min，取出冷却后加入蒸馏水18-25mL，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10-20min灭活的酶液作对照，酶活性以样品与底物反应20-40min后光密度的改变值表示；
果胶酶活性测定：试管中加入0.5-1.5%的果胶溶液1-2mL,用0.05-0.15mol/L、pH4-5.5的乙酸盐缓冲液配制，加稀释8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL，42-55℃水浴准确保温20-40min，取出后立即加入配制的DNS试剂1-2mL,沸水浴2-8min，取出冷却后加入蒸馏水18-25mL，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10-20min灭活的酶液作对照酶活性以样品与底物反应20-40min后光密度的改变值表示；
漆酶活性测定：试管中加入邻联甲苯胺溶液0.3-0.7mL，0.05-0.15mol/L、pH4-5.5的醋酸盐缓冲液3-4mL和稀释8-12倍的粗酶液0.05-0.2mL，反应液20-35℃保温20-40min后，立即用紫外分光光度计于600nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
邻苯二酚氧化酶活性测定：试管中加入0.05-0.15mol/L邻苯二酚溶液1-3mL， 0.02-0.08mol/L、pH5-7的磷酸盐缓冲液1-3mL和稀释8-12倍的粗酶液0.05-0.2mL，反应液20-35℃保温20-40min后，立即用紫外分光光度计于400nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
愈创木酚酶活性测定：试管中加入80mmol/L的愈创木酚溶液0.3-0.7mL，0.05-0.15mol/L、pH4-5.5的醋酸盐缓冲液2-4mL和稀释8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL，反应液20-35℃保温20-40min后，立即用紫外分光光度计于490nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示。
5.根据权利要求4所述的桑黄培养过程中酶的测定方法，其特征在于：取样对分别对培养液的淀粉酶、羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、漆酶、邻苯二酚氧化酶、愈创木酚酶活性进行测定，测定方法如下：
淀粉酶活性测定：试管中加入0.4-0.6%的可溶性淀粉溶液1-2ml，可溶性淀粉溶液用pH5.2-6.3，0.05-0.15mol/L的乙酸盐缓冲液配置，加稀释9-11倍的粗酶液0.3-0.7mL混匀，32-42℃水浴准确保温20-40min，取出后立即加入配制的DNS试剂1-2mL，沸水浴2-8min，取出冷却后加入蒸馏水19-23mL，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10-20min灭活的酶液作对照，酶活性以样品与底物反应20-40min后光密度的改变值表示；
羧甲基纤维素酶活性测定：试管中加入0.4-0.6%的羧甲基纤维素钠溶液1-2ml，羧甲基纤维素钠溶液用pH4-5.2、0.05-0.15mol/L柠檬酸盐缓冲液配制，加稀释9-11倍的粗酶液0.3-0.7mL，47-53℃水浴准确保温20-40min，取出后立即加入配制的DNS试剂1-2mL，沸水浴2-8min，取出冷却后加入蒸馏水19-23mL，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10-20min灭活的酶液作对照，酶活性以样品与底物反应20-40min后光密度的改变值表示；
半纤维素酶活性测定：试管中加入0.4-0.6%的小麦半纤维素溶液1-2mL，小麦半纤维素溶液用pH4-5.2、0.05-0.15mol/L乙酸盐缓冲液配制，加稀释9-11倍的粗酶液0.3-0.7mL，47-53℃水浴准确保温20-40min，取出后立即加入配制的DNS试剂1-2mL,沸水浴2-8min，取出冷却后加入蒸馏水19-23mL，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10-20min灭活的酶液作对照，酶活性以样品与底物反应20-40min后光密度的改变值表示；
果胶酶活性测定：试管中加入0.5-1.5%的果胶溶液1-2ml，果胶溶液用pH4-5、0.05-0.15mol/L乙酸盐缓冲液配制, 加稀释9-11倍的粗酶液0.3-0.7mL，47-53℃水浴准确保温20-40min，取出后立即加入配制的DNS试剂1-2mL,沸水浴2-8min，取出冷却后加入蒸馏水19-23mL，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸10-20min灭活的酶液作对照，酶活性以样品与底物反应20-40min后光密度的改变值表示；
漆酶活性测定：试管中加入邻联甲苯胺溶液0.3-0.7mL、0.05-0.15mol/L、pH4.2-5.2醋酸盐缓冲液2.8-3.8mL和稀释9-11倍的粗酶液0.05-0.15mL，反应液24-32℃保温20-40min后，立即用紫外分光光度计于600nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
邻苯二酚氧化酶活性测定：试管中加入0.05-0.15mol/L的邻苯二酚溶液1-3mL、 0.03-0.06mol/L、pH5.5-6.5磷酸盐缓冲液1-3mL和稀释9-11倍的粗酶液0.05-0.15mL，反应液24-32℃保温20-40min后，立即用紫外分光光度计于400nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
愈创木酚酶活性测定：试管中加入80mmol/L的愈创木酚溶液0.3-0.7mL，0.05-0.15mol/L、pH4.2-5.2醋酸盐缓冲液2-4mL和稀释9-11倍的粗酶液0.3-0.7mL，反应液24-32℃保温20-40min后，立即用紫外分光光度计于490nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示。
6.根据权利要求5所述的桑黄培养过程中酶的测定方法，其特征在于：取样对分别对培养液的淀粉酶、羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、漆酶、邻苯二酚氧化酶、愈创木酚酶活性进行测定，测定方法如下：
淀粉酶活性测定：试管中加入0.5%的可溶性淀粉溶液1.5mL，可溶性淀粉溶液用pH5.8，0.1mol/L乙酸盐缓冲液配置，加稀释10倍的粗酶液0.5mL混匀，38℃水浴准确保温30min，取出后立即加入配制的DNS试剂1.5mL，沸水浴5min，取出冷却后加入蒸馏水21.5mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸15min灭活的酶液作对照，重复测试，酶活性以样品与底物反应30min后光密度的改变值表示；
羧甲基纤维素酶活性测定：试管中加入0.5%的羧甲基纤维素钠溶液1.5mL，羧甲基纤维素钠溶液用pH4.6,0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液配制，加稀释10倍的粗酶液0.5mL，50℃水浴准确保温30min，取出后立即加入配制的DNS试剂1.5mL，沸水浴5min，取出冷却后加入蒸馏水21.5mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸15min灭活的酶液作对照，重复测试，酶活性以样品与底物反应30min后光密度的改变值表示；
半纤维素酶活性测定：试管中加入0.5%的小麦半纤维素溶液1.5mL，小麦半纤维素溶液用pH4.6,0,1mol/L乙酸盐缓冲液配制，加稀释10倍的粗酶液0.5mL，50℃水浴准确保温30min，取出后立即加入配制的DNS试剂1.5mL,沸水浴5min，取出冷却后加入蒸馏水21.5mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸15min灭活的酶液作对照，重复测试，酶活性以样品与底物反应30min后光密度的改变值表示；
果胶酶活性测定：试管中加入1%的果胶溶液1.5mL，果胶溶液用pH 4.5,0.1mol/L乙酸盐缓冲液配制，加稀释10倍的粗酶液0.5mL，50℃水浴准确保温30min，取出后立即加入配制的DNS试剂1.5mL,沸水浴5min，取出冷却后加入蒸馏水21.5mL，混匀，7230G型紫外可见分光光度计测520nm处的OD值，以煮沸15min灭活的酶液作对照，重复测试，酶活性以样品与底物反应30min后光密度的改变值表示；
漆酶活性测定：试管中加入邻联甲苯胺溶液0.5mL，0.1mol/L、pH4.6醋酸盐缓冲液3.4mL和稀释10倍的粗酶液0.1mL，反应液28℃保温30min后，立即用7230G型紫外分光光度计于600nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
邻苯二酚氧化酶活性测定：试管中加入0.1mol/L的邻苯二酚溶液2.0mL ，0.05mol/L、pH6.0磷酸盐缓冲液2.0mL和稀释10倍的粗酶液0.1mL，反应液28℃保温30min后，立即用7230G型紫外分光光度计于400nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示；
愈创木酚酶活性测定：试管中加入80mmol/L的愈创木酚溶液0.5mL，0.1mol/L、pH4.6醋酸盐缓冲液3.0mL和稀释10倍的粗酶液0.5mL，反应液28℃保温30min后，立即用7230G型紫外分光光度计于490nm处测光密度值，酶活单位以反应前后OD值的变化表示。
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| CN106755283B (zh) | 2018-06-29 |
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