CN106754625A - 一种新型细胞培养液制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型细胞培养液制备方法，分为四步，第一步，进行100mg/mLAmp的配制，第二步，氨苄青霉素阳性液体培养基的配制，第三步，氨苄青霉素阳性固体培养基的配制，第四步，将上几步的结果混合，本发明的有益成果是：本发明的细胞培养液制备方法对细胞培养的划分更加细致，培养参数更加严谨，因此本方法的实用性更强。

Description

一种新型细胞培养液制备方法
技术领域
本发明涉及生物细胞领域，涉及一种新型细胞培养液制备方法。
背景技术
细胞培养技术指的是细胞在体外条件下的生长，在培养的过程中细胞不再形成组织。培养物是单个细胞或细胞群。细胞在培养时都要生活在人工环境中，由于环境的改变，细胞的移动或受一些其他因素的影响，培养时间加长，传代导致细胞出现单一化型。对细胞培养液的研究迫在眉睫。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种解决或部分解决上述问题的一种新型细胞液制备方法。
为达到上述技术方案的效果，本发明的技术方案为：一种新型细胞液制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
1)首先，进行100mg/mL Amp的配制：称量50gAmp置于500mL容量瓶中，其后加入80mL灭菌水，充分混合溶解后，定容至500mL；用0.1μm厚度的滤膜过滤其中的除菌，用10个50ml的小瓶分装后于在-20℃的恒温下培养1至2个小时；
2)氨苄青霉素阳性液体培养基的配制；取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g溶解于1000mL水中，进行分装成20个50ml的小瓶，然后在121℃的高温下灭菌20分钟；待温度降至40℃以下时，按照6μL/mL，加入氨卞青霉素贮存液，使其终浓度达到60μg/mL，即制备完成氨苄青霉素阳性液体培养基；
3)氨苄青霉素阳性固体培养基的配制：先按照上一步的步骤配制氨苄青霉素阳性液体培养基，然后在其中加入浓度为2.5g/100mL的琼脂粉，进行高压灭菌30分钟，然后待温度降至40℃以下时，按照6μL/mL加入氨苄青霉素贮存液，使终浓度达到60μg/mL，即制备完成氨苄青霉素阳性固体培养基；
4)将氨苄青霉素阳性液体培养基与氨苄青霉素阳性固体培养基进行混合，将第1)步制备所得100mg/mL Amp的加入，再溶解于180mL去离子水中，定容于500mL，用0.1μm厚度的滤膜过滤除菌，保存于-20℃待用。
本发明的有益成果是：本发明的细胞培养液制备方法对细胞培养的划分更加细致，培养参数更加严谨，因此本方法的实用性更强。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，能实现同样功能的产品属于等同替换和改进，均包含在本发明的保护范围之内。具体方法如下：
实施例1：细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：
1、潜伏期(Latent Phase)：细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。初代培养细胞贴附慢，可长达10～24小时或更多；连续细胞系和恶性细胞系快，10～30分钟即可贴附。细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴附；底物表面不洁不利贴附，底物表面带有阳性电荷利于贴附。
另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤维连接素(Fibronectin)，又称LETS(Larger External Transformation Substance)，细胞表面蛋白(Cell Surface Protein：CSP)等也参与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分，它们有的存在于细胞膜的表面(如CSP)，有的则来自培养基中的血清(LETS)。近年又从各种不同组织和生物成分中提取出了很多促贴附物质。贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一。
细胞贴附于支持物后，除先经过前述延展过程变成极性细胞，还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时，可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相。细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。初代培养细胞潜伏期长，约24～96小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6～24小时；细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。
2、指数增生期(Logarithmic growth Phase)：这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂(Mitotic Index：MI)表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的分裂指数介于0.1％～0.5％，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3％～5％。pH和培养液血清含量变动对细胞分裂指数有很大影响。
指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3～5天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制(Contact Inhibition)。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一。肿瘤细胞由于无接触抑制能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积(Piledup)。细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制(Density Inhibition)，导致细胞分裂停止。因此细胞接触抑制和密度抑制是两个不同的概念，不应混淆。
3、停滞期(Stagnate Phase)：细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期(Plateau)。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。传代过晚(已有中毒迹象)能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传1～2两代，通过换液淘汰掉死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。结果反而耽误了时间，这是在实验中应特别注意的。
实施例2：第一次细胞培养，是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。有几方面含义：
培养物一经接种到培养器皿(瓶)中就不在分割，任其生长繁殖；
原代培养中的“代”并非细胞的“代”数，因为培养过程中细胞经多次分裂已经产生多代子细胞；
原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液，也不等于不更换培养器皿。正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。目前世界上许多实验室所广泛传用的HeLa细胞系就是1951年从一位名叫Henrietta Lacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成。此细胞系一直延用至今。原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞的生长就会出现停滞，大部分细胞衰老死亡。但是有极少数的细胞能够度过“危机”而继续传下去，这些存活的细胞一般能够传到40～50代，这种传代细胞叫做细胞株。细胞株的遗传物质没有发生改变,在培养过程中其特征始终保持。当细胞株传至50代以后又会出现“危机”，不能再传下去。但是有部分细胞的遗传物质发生了改变，并且带有癌变的特点，有可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称为细胞系。
原代培养是建立各种细胞系(株)必经的阶段，其是否成功与组织污染与否、供体年龄、培养技术和方法、适宜培养基的选择等多种因素有关。由于原代培养的细胞转化性极小，对病毒敏感性好，因此适应制备疫苗等生物制品；但也存在有潜在外源因子、不能事先检查标本、且受供体年龄健康状况的影响而导致批间差异大等缺陷。目前常用的原代细胞培养有鸡胚成纤维细胞及猪肾、猴肾、地鼠肾等原代细胞。
原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种、加培养液、置培养条件下培养等步骤，在所有的操作过程中，都必须保持培养物及生长环境的无菌。多数情况下，分散的细胞若属于贴壁依赖型细胞，就能黏附、铺展于培养器皿和载体表面生长而形成细胞单层，这种培养方式称为单层细胞培养(monolayer culture)，又叫贴壁培养(adherentculture)。少数情况下，培养的细胞没有贴壁依赖性，可通过专门设备使细胞始终处于悬状态而在体外生长，这种形式称为悬浮培养(suspension culture)。如何让接种的细胞尽快贴壁，是决定培养成功的关键步骤：可降低接种后培养液对细胞的浮力，如先少补加少量培养液，待细胞贴壁后再补足营养液继续培养；注意适当的细胞接种密度，一般105个/ml左右。
以上所述仅为本发明之较佳实施例，并非用以限定本发明的权利要求保护范围。同时以上说明，对于相关技术领域的技术人员应可以理解及实施，因此其他基于本发明所揭示内容所完成的等同改变，均应包含在本权利要求书的涵盖范围内。
本发明的有益成果是：本发明的细胞培养液制备方法对细胞培养的划分更加细致，培养参数更加严谨，因此本方法的实用性更强。

Claims (1)

1.一种新型细胞培养液制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
1)首先，进行100mg/mL Amp的配制：称量50gAmp置于500mL容量瓶中，其后加入80mL灭菌水，充分混合溶解后，定容至500mL；用0.1μm厚度的滤膜过滤其中的除菌，用10个50ml的小瓶分装后于在-20℃的恒温下培养1至2个小时；
2)氨苄青霉素阳性液体培养基的配制；取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g溶解于1000mL水中，进行分装成20个50ml的小瓶，然后在121℃的高温下灭菌20分钟；待温度降至40℃以下时，按照6μL/mL，加入氨卞青霉素贮存液，使其终浓度达到60μg/mL，即制备完成所述氨苄青霉素阳性液体培养基；
3)氨苄青霉素阳性固体培养基的配制：先按照上一步的步骤配制所述氨苄青霉素阳性液体培养基，然后在其中加入浓度为2.5g/100mL的琼脂粉，进行高压灭菌30分钟，然后待温度降至40℃以下时，按照6μL/mL加入氨苄青霉素贮存液，使终浓度达到60μg/mL，即制备完成所述氨苄青霉素阳性固体培养基；
4)将所述氨苄青霉素阳性液体培养基与所述氨苄青霉素阳性固体培养基进行混合，将第1)步制备所得100mg/mL Amp的加入，再溶解于180mL去离子水中，定容于500mL，用0.1μm厚度的滤膜过滤除菌，保存于-20℃待用。
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