CN106754569A - 一株枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株枯草芽孢杆菌及其应用，属微生物技术领域。该菌株已于2016年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC),地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.13451,分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。本发明菌株是通过从云南野外紫茎泽兰寄生昆虫泽兰实蝇(Procecidochares utilis Stone)的消化道筛分出来的，其应用是以其为活性成分制成菌剂防控紫茎泽兰。枯草芽孢杆菌能对紫茎泽兰产生生物侵染，造成紫茎泽兰叶片及茎病变而快速致死，效果好成本低。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属微生物技术领域，具体为一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及其应用。
背景技术
紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum)，菊科泽兰属，多年生草本或亚灌木，能快速形成单优群落，并且会以多种方式抑制其它植物生长，是一种世界性的恶性杂草，也是我国现存危害最大的一种外来植物。由于紫茎泽兰含有多种有毒组分及恶臭组分，仅有泽兰等极少数物种对其有采食现象。近年来虽然人们对紫茎泽兰的治理采取了投放专性天敌、除草剂、植物防控等手段，但均收效甚微。
微生物作为一种高效、安全、无残留的现代农药在现代农业生产及科学研究中有着举足轻重的地位。相应地，针对紫茎泽兰的微生物农药研发也成为近年来紫茎泽兰防治领域的一个主要方向，但由于紫茎泽兰本身含有多种抑菌物质，导致研发工作至今也收效甚微。
发明内容
本发明的目的在于提供一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及其应用，以该枯草芽孢杆菌作为活性成分的菌剂用于紫茎泽兰的防控，效果好成本低。
本发明所提供的枯草芽孢杆菌，专利申请人的菌株编号为ZLSY2；该菌株已于2016年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC),地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.13451,分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
本发明枯草芽孢杆菌菌株的生物学特性为：
LB培养基(LB Medium)培养的菌落表面有褶皱，粗糙不透明，白色，污白色或微黄色，圆形，不规则。
菌体呈短杆状，无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。在液体培养基中生长时，常形成皱醭。最适温度37℃。
淀粉水解实验阳性，油脂水解实验阴性，石蕊牛奶阳性，尿素实验阳性；发酵葡萄糖可产酸，但不产气；吲哚实验阳性，柠檬酸盐实验阴性，硫化氢实验阴性，V-P阴性，M-R阳性。
本发明菌株是通过从云南野外紫茎泽兰寄生昆虫泽兰实蝇(Procecidocharesutilis Stone)的消化道筛分出来的。
本发明枯草芽孢杆菌的应用是以其为活性成分制成菌剂防控紫茎泽兰。
本发明枯草芽孢杆菌能对紫茎泽兰产生生物侵染，造成紫茎泽兰叶片及茎病变而快速致死。
以本发明枯草芽孢杆菌为活性成分制成菌剂防控紫茎泽兰可以按以下方法：
一阶段扩繁培养：用标准固态LB培养基，加入体积为该固态培养基体积0.4～0.6％的紫茎泽兰水提取物，调整pH值为6.5～7.5，倒平板培养皿冷却，接种保藏的ZLSY2菌株，然后在37℃±3℃下培养23～25小时，得到一阶段扩繁培养后的固态培养基；
二阶段扩繁培养：用标准液体LB培养基，加入体积为该液体培养基体积0.4～0.6％的紫茎泽兰水提取物，调整pH值为6.5～7.5，接入一阶段扩繁培养后的固态培养基，在37℃±3℃培养23～25小时，接种比例为：1cm2的一阶段扩繁培养后的固态培养基接种于1.9～2.1L的该液体培养基；
将二阶段扩繁培养完成后的培养液，7～9℃下冷藏，取出静置至室温，1份体积的该培养液加5～10份体积的水稀释后，直接喷洒在紫茎泽兰叶片上，可一次或连续多次喷洒使用。
所说紫茎泽兰水提取物有市售商品，也按以下方法制得：取包含叶片在内的紫茎泽兰鲜品，粉碎后在40℃±5℃下，按紫茎泽兰鲜品与水的质量比为1:8～12的比例用水浸提1.8～2.2小时，取上清过滤后即得。
本发明的有益效果：本发明提供的枯草芽孢杆菌用于紫茎泽兰的防控，效果好成本低。
具体实施方式
实例1。
第一步：首选将筛分纯化好的ZLSY2菌株，用标准固体LB培养基灭菌后，在未凝固前添加0.5％体积的紫茎泽兰提取物，并调整pH值至7.0.倒平板，待冷凝后将ZLSY2接种至培养基上，在34℃培养基上培养24小时后，将带菌培养基分割成1cm2的小块备用。
第二步：配置标准液体LB培养基，灭菌后按体积比添加0.5％的紫茎泽兰提取物，调整pH值至7.0，降温至37℃，将上一步骤准备好带菌的1cm2小块培养基按比例接种(添加)至液体培养基中，在34℃下培养24小时后取出降温至8℃冷藏6小时。
第三步：将冷藏好的带菌液体培养基取出，按体积比，培养基：水为1:10稀释后，喷洒至紫茎泽兰叶片表面即可。
实例2：
第一步：首选将筛分纯化好的ZLSY2菌株，用标准固体LB培养基灭菌后，在未凝固前添加0.5％体积的紫茎泽兰提取物，并调整pH值至7.0.倒平板，待冷凝后将ZLSY2接种至培养基上，在40℃培养基上培养24小时后，将带菌培养基分割成1cm2的小块备用。
第二步：配置标准液体LB培养基，灭菌后按体积比添加0.5％的紫茎泽兰提取物，调整pH值至7.0，降温至37℃，将上一步骤准备好带菌的1cm2小块培养基按比例接种(添加)至液体培养基中，在40℃下培养24小时后取出降温至8℃冷藏6小时。
第三步：将冷藏好的带菌液体培养基取出，按体积比、培养基：水为1:10的比例稀释后，喷洒至紫茎泽兰叶片表面即可。
实例3：
第一步：首选将筛分纯化好的ZLSY2菌株，用标准固体LB培养基灭菌后，在未凝固前添加0.5％体积的紫茎泽兰提取物，并调整pH值至7.0.倒平板，待冷凝后将ZLSY2接种至培养基上，在35℃培养基上培养24小时后，将带菌培养基分割成1cm2的小块备用。
第二步：配置标准液体LB培养基，灭菌后按体积比添加0.5％的紫茎泽兰提取物，调整pH值至7.0，降温至37℃，将上一步骤准备好带菌的1cm2小块培养基按比例接种(添加)至液体培养基中，在35℃下培养24小时后取出降温至8℃冷藏6小时。
第三步：将冷藏好的带菌液体培养基取出，按照体积比、培养基：水为1:5的比例稀释后，喷洒至紫茎泽兰叶片表面即可。
实例4：
第一步：首选将筛分纯化好的ZLSY2菌株，用标准固体LB培养基灭菌后，在未凝固前添加0.5％体积的紫茎泽兰提取物，并调整pH值至7.0.倒平板，待冷凝后将ZLSY2接种至培养基上，在40℃培养基上培养24小时后，将带菌培养基分割成1cm2的小块备用。
第二步：配置标准液体LB培养基，灭菌后按体积比添加0.5％的紫茎泽兰提取物，调整pH值至7.0，降温至37℃，将上一步骤准备好带菌的1cm2小块培养基按比例接种(添加)至液体培养基中，在40℃下培养24小时后取出降温至8℃冷藏6小时。第三步：将冷藏好的带菌液体培养基取出，按体积比、培养基：水为1:5的比例稀释后，喷洒至紫茎泽兰叶片表面即可。
实例5。
将实例2所得的菌液按三种用量对紫茎泽兰喷洒一次后，均产生生物侵染，造成紫茎泽兰病变的实测效果见下表：
(表中：时间为喷洒菌液后到观测记录时经过的时间，发病率为每100株紫茎泽兰中的发病株所占百分比。满足以下任一项条件认定为发病株：1、该株紫茎泽兰的茎显著病变枯死；2、该株紫茎泽兰的叶片出现超过2mm2的病变斑，并且这样的病变斑数量不少于5个。用量的含义是每平方米紫茎泽兰喷洒相应体积的菌液。)
效果分析：基本上有这样的规律，即紫茎泽兰喷洒菌液后，随着时间的延长而不断发生越来越严重的病变感染，并且病变感染程度随菌液用量的增加而加剧。

Claims (4)

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZLSY2 CGMCC No.13451。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZLSY2 CGMCC No.13451的应用是以其为活性成分制成菌剂防控紫茎泽兰。
3.如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZLSY2 CGMCC No.13451的应用，其特征在于按以下步骤：
一阶段扩繁培养：用标准固态LB培养基，加入体积为该固态培养基体积0.4～0.6％的紫茎泽兰水提取物，调整pH值为6.5～7.5，倒平板培养皿冷却，接种保藏的ZLSY2菌株，然后在37℃±3℃下培养23～25小时，得到一阶段扩繁培养后的固态培养基；
二阶段扩繁培养：用标准液体LB培养基，加入体积为该液体培养基体积0.4～0.6％的紫茎泽兰水提取物，调整pH值为6.5～7.5，接入一阶段扩繁培养后的固态培养基，在37℃±3℃培养23～25小时，接种比例为：1cm2的一阶段扩繁培养后的固态培养基接种于1.9～2.1L的该液体培养基；
将二阶段扩繁培养完成后的培养液，7～9℃下冷藏，取出静置至室温，1份体积的该培养液加5～10份体积的水稀释后，直接喷洒在紫茎泽兰叶片上，可一次或连续多次喷洒使用。
4.如权利要求3所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZLSY2 CGMCC No.13451的应用，其特征在于所说紫茎泽兰水提取物按以下步骤制得：取包含叶片在内的紫茎泽兰鲜品，粉碎后在40℃±5℃下，按紫茎泽兰鲜品与水的质量比为1:8～12的比例用水浸提1.8～2.2小时，取上清过滤后即得。
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