CN106749405B - 一种咪唑杂环类双膦酸化合物及其制备方法、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物化学领域，具体涉及一种咪唑杂环类双膦酸化合物及其制备方法、应用，所述的咪唑杂环类双膦酸化合物对破骨细胞前体的无毒浓度区间较大，同时可显著抑制破骨细胞的形成，可最大程度地破坏肌动蛋白环，对于破骨细胞具有显著的抑制作用，可以作为破骨细胞抑制剂，解决了现有技术中的双膦酸盐对破骨细胞抑制效果低，毒性大，且副作用大的问题。

Description

一种咪唑杂环类双膦酸化合物及其制备方法、应用
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及一种咪唑杂环类双膦酸化合物及其制备方法与应用。
背景技术
双膦酸盐(Bisphosphonates，BPs)是用于各类骨疾患及钙代谢性疾病的一类新药物，能特异地与骨质中的羟磷灰石结合，抑制破骨细胞活性，从而抑制骨质吸收，临床上广泛用于治疗骨质疏松症、变形性骨炎、高血钙病症及肿瘤相关骨疾病等。
破骨细胞(osteoclast，OC)来源于骨髓中的多能造血干细胞。多能造血干细胞首先在M-CSF等因子的作用下分化为巨噬系克隆形成单位，即为破骨细胞前体，之后进一步在RANKL等因子的刺激下融合形成多核且具有骨吸收功能的破骨细胞。RAW264.7细胞是小鼠源性的破骨细胞前体，来源于Abelson小鼠白血病病毒诱导BALB/c导致小鼠产生肿瘤后收集小鼠腹水单核巨噬细胞得到的细胞株，被认为代表早期分化阶段的破骨细胞前体细胞。
“双膦酸类药物反相液相色谱分离与应用研究”(谢赞，医药卫生科技辑，20061215)公开了唑来膦酸等双膦酸类药物具有强大的抗骨吸收作用及其机制，通过直接改变破骨细胞的形态，抑制肌动蛋白形成，干扰破骨细胞对骨的吸附和重吸收；还抑制骨基质中肽类的释放，打破在肿瘤与骨形成之间被称为“种子和土壤机制”的恶性循环，抑制肿瘤细胞生长。然而，由于唑来膦酸作用机制的复杂性，目前人们关于唑来膦酸对破骨细胞抑制的作用机制仍然不清楚，科研人员对于现有的双膦酸盐的改进有限，使得现有的双膦酸盐在治疗代谢性骨病方面的效果较低，毒性大，且伴随着很大的副作用。如何对现有的唑来膦酸分子进行改进以最大限度地清楚药物作用机制，提高对破骨细胞的抑制作用，并降低副作用，已成为本领域亟待解决的一大技术难题。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于现有技术中的双膦酸盐对破骨细胞抑制效果低，毒性大，且副作用大，从而提供一种对破骨细胞抑制效果优、无毒且副作用小的药物结构。
为此，本发明提供了一种咪唑杂环类双膦酸化合物，具有式(I)所示的结构，
其中，n选自1-50之间的整数。
所述的咪唑杂环类双膦酸化合物，所述n选自1-20之间的整数。
所述的咪唑杂环类双膦酸化合物，所述n选自1-10之间的整数。
所述的咪唑杂环类双膦酸化合物，n为1、2、3、4或5，其中所述n＝1时，化合物为ZL，所述n＝2时，化合物为IPrDP，所述n＝3时，化合物为IBDP，所述n＝4时，化合物为IPeDP，所述n＝5时，化合物为IHDP。
本发明提供了一种上述的咪唑杂环类双膦酸化合物的可药用盐、水合物、溶剂化物、无定型体、单晶及共晶体。
本发明提供了一种制备所述的咪唑杂环类双膦酸化合物的方法，包括如下步骤：
(1)将式A-I所示的咪唑、碱和四丁基溴化铵溶于有机溶剂中，室温搅拌混匀，然后向其中缓慢滴加溴代酸乙酯，随后于30-50℃下回流反应6-10h，随后经过滤、洗涤和干燥，得到式A-II所示的化合物；
(2)将式A-II所示的化合物溶于水中，加入酸性溶液调pH值为1-2后，于80-120℃下回流反应5-10h，将所得的反应液旋干，向其中加入丙酮得白色固体，然后过滤，重结晶，得到式A-III所示的化合物；
(3)向式A-III所示的化合物中加入磷酸和聚乙二醇于80-120℃下反应0.2-1h，然后将所得反应液降温至60-70℃后，向所述反应液中缓慢滴加三氯化磷，随后于80-120℃反应1-5h，然后加入浓盐酸，继续于80-120℃回流3-8h，将所得反应液冷却至室温后倒入温度为0～6℃的乙醇中，有白色固体析出，过滤，真空干燥，即得到式A-IV所示的化合物，即为所述的咪唑杂环类双膦酸化合物；
优选的，所述的咪唑杂环类双膦酸化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将式A-I所示的咪唑、碱和四丁基溴化铵溶于有机溶剂中，室温搅拌混匀，然后向其中缓慢滴加溴代酸乙酯，随后于35-45℃下回流反应7-9h，随后经过滤、洗涤和干燥，得到式A-II所示的化合物；
(2)将式A-II所示的化合物溶于水中，加入酸性溶液调pH值为1-2后，于90-110℃下回流反应6-8h，将所得的反应液旋干，向其中加入丙酮得白色固体，然后过滤，重结晶，得到式A-III所示的化合物；
(3)向式A-III所示的化合物中加入磷酸和聚乙二醇于90-110℃下反应0.4-0.6h，然后将所得反应液降温至63-67℃后，向所述反应液中缓慢滴加三氯化磷，随后于90-110℃反应2-4h，然后加入浓盐酸，继续于90-110℃回流4-6h，将所得反应液冷却至室温后倒入温度为0～4℃的乙醇中，有白色固体析出，过滤，真空干燥，即得到式A-IV所示的化合物，即为所述的咪唑杂环类双膦酸化合物。
优选的，所述碱为选自KOH、NaOH、、K2CO3、Na2CO3、叔丁醇钠、乙醇钠中的至少一种。
优选的，所述碱为KOH和K2CO3。
所述有机溶剂为极性非质子性溶剂。
优选的，所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿和/或四氢呋喃。
优选的，在所述步骤(1)中，以所述式A-I所示的咪唑的摩尔量为基准，所述KOH或NaOH的用量为1.3-1.7摩尔倍量，所述K2CO3或Na2CO3的用量为0.8-1.2摩尔倍量，所述四丁基溴化铵的用量为0.03-0.07摩尔倍量，所述溴代酸乙酯的用量为0.8-1.2摩尔倍量。
优选的，在所述步骤(1)中，以所述式A-I所示的咪唑的摩尔量为基准，所述叔丁醇钠和乙醇钠各自的用量为1.1-1.5摩尔倍量，所述四丁基溴化铵的用量为0.03-0.07摩尔倍量，所述溴代酸乙酯的用量为0.8-1.2摩尔倍量。
优选的，在所述步骤(1)中，以所述式A-I所示的咪唑的摩尔量为基准，所述KOH的用量为1.5摩尔倍量，所述K2CO3的用量为1摩尔倍量，所述四丁基溴化铵的用量为0.05摩尔倍量，所述溴代酸乙酯的用量为1摩尔倍量。
优选的，在所述步骤(3)中，以所述式A-III所示的化合物的摩尔量为基准，所述磷酸的用量为0.8-1.2摩尔倍量，所述聚乙二醇的用量为1.3-1.7摩尔倍量，所述三氯化磷的用量为0.8-1.2摩尔倍量。
优选的，在所述步骤(3)中，以所述式A-III所示的化合物的摩尔量为基准，所述磷酸的用量为1摩尔倍量，所述聚乙二醇的用量为1.5摩尔倍量，所述三氯化磷的用量为1摩尔倍量。
本发明提供了一种所上述的咪唑杂环类双膦酸化合物在制备破骨细胞抑制剂中的用途。
本发明提供了一种破骨细胞抑制剂，以上述的咪唑杂环类双膦酸化合物为有效成分。
所述的破骨细胞抑制剂，以上述的咪唑杂环类双膦酸化合物为有效成分，按照常规工艺，选择性加入常规辅料制成的临床可接受的制剂。
本发明技术方案，具有如下优点：
(1)本发明所述的咪唑杂环类双膦酸化合物对破骨细胞前体的无毒浓度区间较大，且呈浓度依赖性，在较低的浓度下即可显著抑制破骨细胞的形成，甚至引起破骨细胞的死亡，因此，可以作为破骨细胞抑制剂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1a是对照组RAW264.7细胞；
图1b是RANKL诱导RAW264.7细胞24h时的状态；
图1c是RANKL诱导RAW264.7细胞48h时的状态；
图1d是RANKL诱导RAW264.7细胞72h时的状态；
图1e是RANKL诱导RAW264.7细胞96h时的状态；
图2a-(1)是对照组RAW264.7细胞；
图2a-(2)是经RANKL诱导后形成大量多核巨型TRAP阳性细胞；
图2b-(1)是对照组RAW264.7细胞；
图2b-(2)是经RANKL诱导后形成大量多核巨型细胞的肌动蛋白环荧光染色图；
图3是BPs对RAW264.7细胞的增殖抑制作用(72h)；
图4a是ZL对RAW264.7的无毒浓度；
图4b是IPrDP对RAW264.7的无毒浓度；
图4c是IBDP对RAW264.7的无毒浓度；
图4d是IPeDP对RAW264.7的无毒浓度；
图4e是IHDP对RAW264.7的无毒浓度。
图5a是IBDP在无毒浓度区间对RANKL诱导的破骨细胞形成的影响；
图5b是IPeDP在无毒浓度区间对RANKL诱导的破骨细胞形成的影响；
图5c是IHDP在无毒浓度区间对RANKL诱导的破骨细胞形成的影响；
图5d是ZL在无毒浓度区间对RANKL诱导的破骨细胞形成的影响；
图5e是IPrDP在无毒浓度区间对RANKL诱导的破骨细胞形成的影响；
图6a是无毒浓度IPeDP对RANKL诱导的破骨细胞TRAP活性的影响；
图6b是无毒浓度IHDP对RANKL诱导的破骨细胞TRAP活性的影响；
图6c是无毒浓度IPrDP对RANKL诱导的破骨细胞TRAP活性的影响；
图7是在50ng/mlRANKL和不同浓度IPeDP作用后，对RAW264.7的TRAP染色图；
图8是IPeDP对破骨细胞形成相关蛋白c-Fos、NFATc1表达的影响；
图9是IPeDP对破骨细胞形成相关信号通路的影响。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
下述实施例中涉及到的试剂如下：咪唑、溴代酸乙酯、磷酸、三氯化磷、氢氧化钾、碳酸钾、浓盐酸、无水硫酸钠、聚乙二醇、二氯甲烷、乙醇、丙酮。所有试剂均为分析纯，使用前未经纯化，购置于阿拉丁试剂公司。
唑来膦酸的生产厂家为阿拉丁。
下述实施例中涉及到的仪器如下：核磁共振仪(Bruker DRX-500)、电喷雾质谱仪(Waters ZMD4000)、元素分析仪(Elementar Vario EL III)
实施例1
本实施例所述的具有式(I)所示结构的咪唑杂环类双膦酸化合物的合成，其中n＝1，具有式(Ⅱ)结构：
化合物Ⅱ的合成路线为：
(1)化合物Ⅱ中间体1制备
分别取咪唑6.8g(0.1mol)、KOH 8.4g(0.15mol)、K2CO3 13.8g(0.1mol)和四丁基溴化铵0.7g(7mmol)溶于75mL二氯甲烷中，室温搅拌0.5h后，缓慢滴加溴乙酸乙酯0.1mol(11.2mL)，滴加完毕，于39℃下回流8h，过滤，采用饱和食盐水洗涤滤液三次，无水硫酸钠干燥，25℃减压蒸馏有机相至液滴不再滴出，得油状物，即化合物Ⅱ中间体1；
(2)化合物Ⅱ中间体2制备
取上述化合物Ⅱ中间体1为7.7g(0.05mol)溶于100mL水中，浓盐酸调节溶液pH值1.5，于100℃下回流7h，反应结束后，将所得反应液在25℃直接减压蒸馏至液滴不再滴出，加入丙酮300mL，得白色固体，过滤，异丙醇重结晶，得白色晶体，即化合物Ⅱ中间体2；
(3)化合物Ⅱ制备
取上述化合物Ⅱ中间体2为3.15g(0.025mol)、H3PO4 2.45g(0.025mol)和聚乙二醇400为15g(0.037mol)在100℃下反应0.5h，降温至65℃后，缓慢滴加三氯化磷0.025mol(2.2mL)，滴加完毕，继续100℃反应3h，然后加入30mL浓盐酸，回流5h，反应结束，冷至室温，将反应液倒入3℃的乙醇中，有白色固体析出，过滤，真空干燥，得所述化合物Ⅱ。
1H-NMR(500MHz,D2O):δ8.97(s,1H,CH-ring),7.43(d,1H,CH-ring),6.82(d,1H,CH-ring),4.56(t,2H,N-CH2),3.55(q,2H,OH-C-CH2)；ESI-MS,m/z(％):271(100)＝M-H,Anal.calcd for C5H10N2O7P2(％):C,22.07；H,3.70；N,10.30；Found(％):C,22.27；H,3.78；N,10.24.
实施例2
本实施例所述的具有式(I)所示结构的咪唑杂环类双膦酸化合物的合成，其中n＝2，具有式(Ⅲ)结构：
化合物Ⅲ的合成路线为：
(1)化合物Ⅲ中间体1制备
取咪唑6.8g(0.1mol)、KOH 8.4g(0.15mol)、K2CO3 11.1g(0.0.08mol)和四丁基溴化铵0.97g(3mmol)溶于75mL二氯甲烷中，室温搅拌0.5h后，缓慢滴加溴丙酸乙酯0.08mol(10.4mL)，滴加完毕，50℃下回流6h。过滤，饱和食盐水洗涤滤液三次，无水硫酸钠干燥，25℃减压蒸馏有机相至液滴不再滴出，得油状物，即化合物Ⅲ中间体1；
(2)化合物Ⅲ中间体2制备
将化合物Ⅲ中间体1为8.4g(0.05mol)溶于100mL水中，浓盐酸调节溶液pH值2.0，120℃下回流5h，反应结束后，将所得反应液25℃直接减压蒸馏至液滴不再滴出，加入丙酮300mL，得白色固体，过滤，异丙醇重结晶，得白色晶体，即化合物Ⅲ中间体2；
(3)化合物Ⅲ制备
将化合物Ⅲ中间体2为3.5g(0.025mol)、H3PO4 2.0g(0.02mol)和聚乙二醇400为13g(0.0325mol)120℃下反应0.2h，降温至70℃后，向内缓慢滴加三氯化磷0.025mol(1.7mL)，滴加完毕后，继续120℃反应1h，然后加入30mL浓盐酸，回流3h，反应结束，冷至室温，将所得反应液倒入6℃的乙醇中，有白色固体析出，过滤，真空干燥，即得所述化合物Ⅲ。
1H-NMR(500MHz,D2O):δ8.97(s,1H,CH-ring),7.77(d,1H,CH-ring),7.65(d,1H,CH-ring),4.80(t,2H,N-CH2),2.76(q,2H,OH-C-CH2)；ESI-MS,m/z(％):285＝M-H,Anal.calcd for C6H12N2O7P2(％):C,25.19；H,4.23；N,9.79；Found(％):C,25.27；H,4.38；N,9.84.
实施例3
本实施例所述的具有式(I)所示结构的咪唑杂环类双膦酸化合物的合成，其中n＝3，具有式(Ⅳ)结构：
化合物Ⅳ的合成路线为：
(1)化合物Ⅳ中间体1制备
取咪唑6.8g(0.1mol)、KOH 9.5g(0.17mol)、K2CO3 16.6g(0.12mol)和四丁基溴化铵2.3g(7mmol)溶于75mL二氯甲烷中，室温搅拌0.5h后，缓慢滴加溴丁酸乙酯0.12mol(17.1mL)，滴加完毕，30℃下回流10h，过滤，饱和食盐水洗涤滤液三次，无水硫酸钠干燥，25℃减压蒸馏有机相至液滴不再滴出，得油状物，即化合物Ⅳ中间体1；
(2)化合物Ⅳ中间体2制备
将上述化合物Ⅳ中间体1为9.1g(0.05mol)溶于100mL水中，浓盐酸调节溶液pH值1.0，80℃下回流10h。反应结束后，反应液25℃直接减压蒸馏至液滴不再滴出，加入丙酮300mL，得白色固体。过滤，异丙醇重结晶，得白色晶体，即得化合物Ⅳ中间体2；
(3)化合物Ⅳ制备
将上述化合物Ⅳ中间体2为3.85g(0.025mol)、H3PO4 2.9g(0.025mol)和聚乙二醇400为17g(0.037mol)80℃下反应1h，降温至60℃后，缓慢滴加三氯化磷0.03mol(2.6mL)，滴加完毕后，继续80℃反应5h，然后加入30mL浓盐酸，回流8h，反应结束，冷至室温，将所得反应液倒入0℃的乙醇中，有白色固体析出，过滤，真空干燥，即得所述化合物Ⅳ。
1H-NMR(500MHz,D2O):d7.46(s,1H,CH-ring),6.96(d,1H,CH-ring),6.74(d,1H,CH-ring),3.74(t,2H,N–CH2),1.82(t,2H,CH2COH)，1.60(q,2H,CH2CH2COOH).ESI-MS,m/z(％):299＝M-H,Anal.Calculated:C7H14N2O7P2(％):C,28.01；H,4.70；N,9.33；found(％):C,29.12；H,4.82；N,9.51.
实施例4
本实施例所述的具有式(I)所示结构的咪唑杂环类双膦酸化合物的合成，其中n＝4，具有式(Ⅴ)结构：
化合物Ⅴ的合成路线为：
(1)化合物Ⅴ中间体1制备
取咪唑6.8g(0.1mol)、NaOH 6.0g(0.15mol)、Na2CO3 10.6g(0.1mol)和四丁基溴化铵1.6g(5mmol)溶于75mL二氯甲烷中，室温搅拌0.5h后，缓慢滴加溴戊酸乙酯0.1mol(15.8mL)，滴加完成后，45℃下回流7h。过滤，饱和食盐水洗涤滤液三次，无水硫酸钠干燥，25℃减压蒸馏有机相至液滴不再滴出，得油状物，即化合物Ⅴ中间体1；
(2)化合物Ⅴ中间体2制备
将上述化合物Ⅴ中间体1为9.8g(0.05mol)溶于100mL水中，浓盐酸调节溶液pH值1.3，90℃下回流8h。反应结束后，将所得反应液旋干，反应液25℃直接减压蒸馏至液滴不再滴出，加入丙酮300mL，得白色固体。过滤，异丙醇重结晶，得白色晶体，即化合物Ⅴ中间体2；
(3)化合物Ⅴ制备
将上述化合物Ⅴ中间体2为4.2g(0.025mol)、H3PO4 2.45g(0.025mol)和聚乙二醇400为15g(0.037mol)110℃下反应0.4h，降温至63℃后，缓慢滴加三氯化磷0.025mol(2.2mL)，滴加完毕后，继续110℃反应2h，然后加入30mL浓HCl，回流4h，反应结束，冷至室温，将所得反应液倒入2℃的乙醇中，有白色固体析出，过滤，真空干燥，得所述化合物Ⅴ。
1H-NMR(500MHz,D2O):d 7.46(s,1H,CH-ring),7.44(d,1H,CH-ring),7.37(d,1H,CH-ring),4.19(t,2H,N–CH2),1.91(t,2H,CH2COH),1.85(m,2H,ring-CH2CH2),1.55(m,2H,ring-CH2CH2CH2),ESI-MS,m/z(％):313＝M-H,Anal.calculated:C8H16N2O7P2(％):C,30.58；H,5.13,N,8.92；found(％):C,31.62；H,5.32；N,9.05.
实施例5
本实施例所述的具有式(I)所示结构的咪唑杂环类双膦酸化合物的合成，其中n＝5，具有式(Ⅵ)结构：
化合物Ⅵ的合成路线为：
(1)化合物Ⅵ中间体1制备
取咪唑6.8g(0.1mol)、叔丁醇钠10.5g(0.11mol)、乙醇钠7.4g(0.11mol)和四丁基溴化铵1.6g(5mmol)溶于75mL二氯甲烷中，室温搅拌0.5h后，向内缓慢滴加溴己酸乙酯0.1mol(17.8mL)，滴加完成后，35℃下回流9h，过滤，饱和食盐水洗涤滤液三次，无水硫酸钠干燥，25℃减压蒸馏有机相至液滴不再滴出，得油状物，即化合物Ⅵ中间体1。
(2)化合物Ⅵ中间体2制备
取化合物Ⅵ中间体1为10.5g(0.05mol)溶于100mL水中，浓盐酸调节溶液pH值1.8，110℃下回流6h，反应结束后，将所得反应液25℃直接减压蒸馏至液滴不再滴出，加入丙酮300mL，得白色固体。过滤，异丙醇重结晶，得白色晶体，即化合物Ⅵ中间体2。
(3)化合物Ⅵ制备
取上述化合物Ⅵ中间体2为4.6g(0.025mol)、H3PO4 2.45g(0.025mol)和聚乙二醇400为15g(0.037mol)90℃下反应0.8h，降温至67℃后，缓慢滴加三氯化磷0.025mol(6.5mL)，滴加完毕后，继续90℃反应4h，然后加入30mL浓盐酸，回流6h，反应结束，冷至室温，将反应液倒入4℃的乙醇中，有白色固体析出，过滤，真空干燥，得所述化合物Ⅵ。
1H-NMR(500MHz,D2O)8.66(s,1H,IMZ-H),7.42(s,1H,IMZ-H),7.37(s,1H,IMZ-H),4.18(t,J 6.8,2H,N–CH2),1.81–1.93(m,4H,N–CH2CH2,CH2–C–OH),1.52–1.60(m,2H,CH2),1.22–1.30(m,2H,CH2).ESI-MS,m/z(％):327＝M-H,Anal.Calc.forC9H18N2O7P2:C 32.94,H5.53,N 8.54.Found:C,33.12；H,3.69；N,8.31％.
实验例
一、破骨细胞(osteoclast,OC)的诱导与鉴定
依据下述诱导原理以及鉴定方法获取破骨细胞
诱导原理：破骨细胞来源于骨髓中的多能造血干细胞。多能造血干细胞首先在M-CSF等因子的作用下分化为巨噬系克隆形成单位，即为破骨细胞前体，之后进一步在RANKL等因子的刺激下融合形成多核且具有骨吸收功能的破骨细胞。RAW264.7细胞是小鼠源性的破骨细胞前体，来源于Abelson小鼠白血病病毒诱导BALB/c小鼠产生肿瘤后收集小鼠腹水单核巨噬细胞得到的细胞株，被认为代表早期分化阶段的破骨细胞前体细胞。
破骨细胞的鉴定主要有三个指标：(1)细胞核数目大于或等于3；(2)细胞TRAP酶染色阳性；(3)细胞贴附与骨基质表面或者羟基磷灰石基底上可以形成吸收陷窝，这是判断破骨细胞具有骨吸收功能的“金标准”。一般认为细胞具备前面两个条件便认定为破骨细胞样细胞(Osteoclast-like cells)。
1、核因子NF-kB受体活化因子配体RANKL诱导小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7分化成破骨细胞
材料：RAW264.7细胞，购自中科院上海细胞所。
试剂：核因子NF-kB受体活化因子配体RANKL，购自Santa Cruz,α-MEM及FBS购自Gibco；BSA购自碧云天生物技术有限公司
诱导的具体步骤：
诱导液的配制：将10μg RANKL溶于1ml含质量浓度为0.1％BSA的PBS，α-MEM培养基稀释至终浓度为50ng/ml RANKL。
诱导培养：将RAW 264.7细胞按照104个/孔铺于24孔板，24h后加入诱导液培养。每两天更换一次培养基。第一天为破骨细胞形成阶段，第四天为成熟阶段。
结果如图1a所示，未诱导时RAW264.7细胞呈贴壁生长，形态较为均一，多为圆形、多角形，少数为长梭形，细胞体积较小，未见多核细胞存在；如图1b所示，诱导24h时，视野内圆形及多角形细胞比例增多，长梭形细胞减少，未见多核细胞生成；如图1c所示，诱导48h时，细胞形态开始变得不规则，圆形单个核细胞占大多数，个别胞浆向外伸出伪足；如图1d所示，诱导72h时，视野中部分胞浆向外伸出伪足，可见少量多个核细胞生成(细胞核数3-5个)，其大多形态不规则；如图1e所示，至诱导96h后，视野中可见形态各异的多核细胞生成(细胞核数3-20个)，细胞核呈一簇或多簇聚集于细胞质内，细胞边缘不光滑，呈煎蛋或毛刺状，胞浆含有较多空泡。
2、OC的鉴定
材料：上述步骤中获得的破骨细胞；
鉴别的具体步骤：
(1)TRAP染色
试剂盒：TRACP&ALP double-stain kit TaKaRa，MK300
染色方法：每小瓶酸性磷酸酶(ACP，3号)里面加入10毫升去离子水，然后加入1毫升酒石酸钠，震荡溶解，获得酒石酸钠溶液；弃去培养基，加固定液，固定5分钟；加入无菌水稀释固定液，弃掉，再加入无菌水，弃掉；加入配好的酒石酸钠溶液，37℃孵育15～45分钟；弃掉染液，用去离子水洗三遍；显微镜下观察拍照。
结果如图2a显示，其中图2a-(1)为未经RANKL诱导的，图2a-(2)为经RANKL诱导后形成了大量多核巨型TRAP(破骨细胞特征性标志物)染色阳性破骨细胞样细胞(黑色箭头指示处)，体积增大，酶活性部位呈粉红色或红色(在本黑白图中显示为黑斑)，颗粒状，均匀分布于细胞胞浆，且颜色的深浅反映TRAP的酶活性的高低，伪足清晰，细胞核为阴性，多为3个或3个以上核。
(2)肌动蛋白环染色
鬼笔环肽贮存液配制：1mg FITC-鬼笔环肽(Sigma)溶于1ml无水甲醇，配成1mg/ml贮存液。分装冻存于-20℃，干燥、避光保存。
染色方法：细胞爬片生长24-48小时；预温PBS清洗细胞2次，每次10分钟；4％多聚甲醛室温固定10分钟，PBS清洗细胞3次；0.1％Triton X-100/PBS室温破膜3-5分钟，PBS清洗细胞3次；2.5μl FITC-鬼笔环肽贮存液加入500ul PBS中配成工作液(5μg/ml)并用以染细胞，在密闭的湿盒内室温染色60分钟；PBS清洗细胞3次；1ug/ml DAPI染色5min；吸去多余水分，加荧光封片液(中性或偏碱性缓冲液加等量甘油)封片，荧光显微镜下观察拍照。
结果如图2b所示，其中图2b-(1)为未经RANKL诱导的，图2b-(2)为经RANKL诱导后形成了大量多核巨型细胞，经FITC-鬼笔环肽染色后，可见纤维性肌动蛋白环(成熟破骨细胞被激活后骨吸收活性的标志)，呈环形结构，分布清晰而规则，显示出细胞的正常外形，细胞核被DAPI蓝染、边聚，细胞膜边界不清，可见有伪足和褶皱。由此可以判断破骨细胞的形成。
二、BPs药效学筛选与评价
1、MTT法检测BPs对RAW264.7的增殖抑制作用
(1)不同浓度药物溶液的配制
取实施例1制备的唑来膦酸(ZL)1mmol、实施例2制备的咪唑杂环类双膦酸化合物(IPrDP)1mmol、实施例3制备的咪唑杂环类双膦酸化合物(IBDP)1mmol、实施例4制备的咪唑杂环类双膦酸化合物(IPeDP)1mmol，实施例5制备的咪唑杂环类双膦酸化合物(IHDP)1mmol，分别溶于100mL水中，震荡摇匀。取溶液1mL，加培养基稀释至5mL，即为200μM溶液。取2.5mL的上述200μM溶液，用培养基稀释至5mL，即为100μM溶液，依次类推，等比稀释，得到0.78125、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200μM的药物溶液。
(2)MTT法测定化合物毒性
于96孔板中接种处于对数生长期的细胞，细胞接种浓度为1.5×104mL-1。设置空白对照组，剩余每孔加入100μL细胞悬液。在37℃，含5％CO2的培养箱中培养过夜后，测试组分别加入100μL不同浓度的实施例1-5制备的咪唑杂环类双膦酸化合物溶液，对照组加入100μL培养液，每组设8个平行孔。培养72h后，加入20μL MTT(5mg/mLPBS)溶液，放入培养箱中继续培养4h后，小心吸出上层清夜，加入150μL二甲亚砜，震荡10min至孔底紫色结晶完全溶解，用酶联免疫酶标仪测定每个孔吸光度OD490值。用实验组OD值占对照组OD值的百分比表示细胞活力。
结果如图3所示，实施例1-5制备的咪唑杂环类双膦酸化合物均可抑制RAW264.7的增殖，且呈浓度依赖性，但总体上均未超过经典的双膦酸盐类药物唑来膦酸抑制增殖的效果。
2、所述咪唑杂环类双膦酸化合物对RAW264.7的无毒浓度
为了能够进行下面的实验，特别是针对破骨细胞形成的实验，筛选出实施例1-5制备的咪唑杂环类双膦酸化合物对RAW264.7的无毒浓度是有必要的，这样能排除实施例1-5制备的咪唑杂环类双膦酸化合物抑制其前体细胞生存能力的影响，更好地明确对破骨细胞形成过程中的作用。
根据上述“MTT法检测BPs对RAW264.7的增殖抑制作用”中的结果，以上唑来膦酸以及咪唑杂环类双膦酸化合物的浓度区间：(1)ZL 0-3.125μM，如图4a所示；(2)IPrDP 0-6.25μM，如图4b所示；(3)IBDP 0-12.5μM，如图4c所示；(4)IPeDP 0-50μM，如图4d所示；(5)IHDP0-25μM，如图4e所示，均未对RAW264.7的生存造成明显的影响，故而进行微调后即可进行下面的破骨细胞形成实验。
3、所述咪唑杂环类双膦酸化合物对OC形成的影响
(1)计数法：
破骨细胞的细胞核数目大于或等于3,且破骨细胞呈特异性的抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性(TRAP+)。本方法对处理后的RAW264.7细胞进行TARP染色，然后在显微镜下计数细胞核数目大于或等于3的细胞。
结果如图5所示，以筛选出的无毒浓度区间进行BPs对RANKL诱导的破骨细胞形成影响的实验，发现不同的所述咪唑杂环类双膦酸化合物对破骨细胞形成的影响是不同的，其中IBDP(如图5a所示)、IPeDP(如图5b所示)、IHDP(如图5c所示)可浓度依赖性的抑制OC形成，并在较低的浓度(6.25μM、1.5625μM、3.125μM)下即可显著抑制OC形成；而ZL(如图5d所示)、IPrDP(如图5e所示)尽管具有相对较强的抑制RAW264.7细胞生存的能力，但在低浓度下对OC形成无显著影响。其中，在不影响RAW264.7细胞生存能力的前提下，IPeDP抑制OC形成的能力最强，50μM时抑制率达20％左右，可作为一种有效的破骨细胞抑制剂。
(2)酶标法：
破骨细胞中TRAP呈高表达，本实验是利用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)来检测破骨细胞的TRAP活性。
根据试剂盒的要求配制标准工作液及显色工作液，取恰当细胞或组织裂解液，低速离心取上清，-80℃冻存。于96孔板中设置空白对照、标准品、待测样品，溶液按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。标准品的用量分别为4、8、16、24、32、40μL，待测样品直接加40μL。轻轻混匀，孵育30min，每孔加入终止液终止反应。检测405nm处吸光值。
结果如图6中所示，IPeDP可抑制RAW264.7细胞的TRAP活性，并呈浓度依赖性，如图6a所示；IHDP可抑制TRAP活性但无浓度依赖效应，如图6b所示；IPrDP对TRAP活性无明显影响，如图6c所示。本实验进一步验证了IPeDP具有抑制破骨细胞形成的性能。
三、IPeDP的药物作用机制
1.无毒浓度IPeDP对RANKL诱导的OCs的形成的影响
步骤同上述“一、破骨细胞(osteoclast,OC)的诱导与鉴定”，不同之处在于细胞为IPeDP处理过的细胞。将RAW 264.7细胞按照104个/孔铺于24孔板，在37℃，含5％CO2的培养箱中培养过夜后，分别加入500μL不同浓度的所述IPeDP溶液(0μM、6.25μM、12.5μM、25μM和50μM),培养24h后加入诱导液培养。每两天更换一次培养基。诱导4天后使用TRAP染色试剂盒对细胞进行TRAP染色。
结果如图7所示，在无毒浓度IPeDP的作用下，多核巨型TARP(破骨细胞特征性标志物)染色阳性破骨细胞样细胞明显减少。说明无毒浓度的双膦酸盐类药物IPeDP抑制RANKL诱导的破骨细胞形成。
2.IPeDP对OCs形成相关蛋白表达的影响
采用Westernblot方法(参照文献Bone.2010Mar；46(3):724-31.)检测经不同浓度的IPeDP处理过的细胞中相关蛋白的表达，所述不同浓度的IPeDP处理过的细胞的步骤同上。
结果如图8所示，c-Fos、NFATc1均为破骨细胞形成相关标志物。RANKL和RANK的结合可通过c-Fos激活NFATc1。NFATc1是破骨细胞形成的重要调节因子，可调节TRAP、cathepsin K、MMP-9等多种破骨细胞形成标志物基因的表达。本实验表明，RANKL可引起RAW264.7细胞中c-Fos、NFATc1等破骨细胞形成相关蛋白的表达升高，IPeDP则可降低这些蛋白的表达，说明IPeDP可通过降低RANKL引起的c-Fos和NFATc1表达升高来抑制破骨细胞形成。
3.IPeDP对破骨细胞形成相关信号通路的影响
将RAW 264.7细胞按照4×104个/孔铺于6孔板，在37℃，含5％CO2的培养箱中培养过夜后，加入含50ng/ml RANKL的诱导培养基，实验组加入50μM的所述IPeDP溶液,分别培养0、5、15、30min后，用RIPA(中)裂解液(碧云天生物技术有限公司)裂解细胞，采用Westernblot方法(参照文献Bone.2010Mar；46(3):724-31.)检测细胞中相关信号通路蛋白的表达情况。
结果如图9所示。RANKL可激活多种与破骨细胞形成相关的信号分子，如Akt、p38、JNK、ERK、NF-κB等。本实验表明，RANKL可引起RAW264.7细胞中p-p38、p-JNK、p-ERK、p-Akt的增加和IκB-α下降，IPeDP则可抑制p-JNK、p-Akt的增加，说明IPeDP可通过抑制RANKL引起的p-JNK、p-Akt表达升高来抑制破骨细胞形成。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (5)

1.一种咪唑杂环类双膦酸化合物在制备破骨细胞抑制剂中的应用，其特征在于，所述咪唑杂环类双膦酸化合物具有式(I)所示的结构：
其中：n选自3-5之间的整数。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述n为4。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述咪唑杂环类双膦酸化合物是作为破骨细胞分化抑制剂在制备破骨细胞抑制剂中的应用。
4.一种破骨细胞抑制剂，以权利要求1-3任一项所述的咪唑杂环类双膦酸化合物为有效成分。
5.根据权利要求4所述的破骨细胞抑制剂，其特征在于，以权利要求1-3任一项所述的咪唑杂环类双膦酸化合物为有效成分，按照常规工艺，选择性加入常规辅料制成的临床可接受的制剂。
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