CN106730047B - 一种止血防粘连膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种止血防粘连膜，包括由分子量为0.5万～50万的可降解高分子材料相互交织而成的防粘连纤维层和附着于该防粘连纤维层上且由连接至少一个带电配体的阴离子淀粉制成的止血材料，所述带电配体包括至少一个羧基官能团和至少一个氨基官能团。本申请防粘连膜能够有效防粘连，同时具有优异的止血效果，在流血21.25～23.5s后即可迅速止血，适于大范围的推广应用。

Description

一种止血防粘连膜及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种止血防粘连膜及其制备方法。
背景技术
手术后粘连是国内外外科手术领域至今尚未解决的重要医学难题之一。粘连不仅可以引起严重的并发症，而且不良粘连也是再次手术时并发症明显增高的主要原因之一。理想的防粘连材料应具有低致敏性、适宜的组织粘附性；能完全覆盖创伤表面并且具有足够的体内存留时间；能降解吸收而不需二次手术将其取出；促进创面愈合；同时具有一定的机械强度而便于实施操作等特点。现有的已上市防粘连材料，尤其是膜材料，虽然防粘连效果确切，但都有明确的禁忌症，即感染性伤口及活动性出血性伤口禁用。炎症及出血均会导致一般的防粘连材料失效，尤其是术中无法完全处理的渗血，或者快速止血后残留大量血凝物质的伤口都会对伤口愈合带来极大的负面影响，而伤口愈合本身就是个复杂过程。因此对伤口创面的保护要综合考虑多方面的的因素，如果能将止血和术后伤口保护有效结合起来，才能对更好的减少渗血及粘连造成的危害。
针对上述技术问题，目前市场上出现了一种将止血材料和可降解高分子材料复合制备得到的防粘连纤维膜，其同时可以止血防粘连。在中国专利申请CN102908649A公开的防粘连纤维膜中，其利用静电纺丝技术将两种或三种有机高分子溶液混合后进行多喷头静电纺丝，并通过调控有机高分子材料进行交联处理，制备了一种与血接触后表面形成凝胶的防粘连材料，在起到物理止血作用的同时，实现防粘连效果。但是该防粘连纤维膜不适用于较大出血量的止血，从而限制其应用范围。
中国专利申请CN101623517B公开了一种医用防粘连膜，其包括纳米支架和附着于其上且包覆有一种或几种止血或/和防粘连药物水溶胶组成，该防粘连膜具有良好的生物相容性，同时具有较好的止血和防粘连作用。但是药物类的止血材料容易引起人体的不良反应，不适用于老年人或有病史的人群，其同样无法大规模推广应用。
目前常用的目前市场上常用的止血材料主要有氧化纤维类止血材料、海藻酸盐蛋白胶类止血材料、壳聚糖类止血材料和可降解淀粉类止血材料等。各类止血材料的优缺点如下：
氧化纤维类止血材料利用酸性的氧化纤维素上的羧基与血红蛋白中的三价铁离子结合形成红色胶块，从而达到止血的目的。其明显的缺点是自身结构较为松散，被机体吸收较快，故可能引起再出血，另有研究指出氧化纤维素的酸性可能会引起神经纤维的变性，上述种种缺点限制了氧化纤维类止血材料的应用范围。
海藻酸盐蛋白胶类止血材料具有良好的生物相容性和很强的亲水性，可以大量吸收创面血液和组织渗出液，但由于海藻酸钙的质地柔软，缺乏韧性和弹性，对创面的压迫力不够，而且遇水后迅速形成非黏性凝胶体，材料自身不具备黏附性，往往需要借助辅助材料固定，因而也限制了其应用范围。
壳聚糖类止血材料因壳聚糖本身具有的抗菌、止血、良好的组织相容性等多种优越的性能而受到追捧。但是有研究表明，在肝素化的人血中加入壳聚糖醋酸溶液后仍能出现凝血块，并且由于壳聚糖只能溶于稀酸水溶液中，所以在实际应用中还存在残留酸可能诱发的炎症问题，而在目前的研究中，一般通过对壳聚糖进行改性来增加可溶性来解决上述问题。如在中国专利申请CN102648985A中，发明人利用脱乙酰度为80～99.9％，分子量在10000-1000000之间的壳聚糖制备了具有优秀的组织相容性、吸液性以及能有效抗菌、止血、促进伤口愈合的壳聚糖微球。但同时，由于其具有水溶性，吸收速度较快，故也造成黏附能力不强。
由于廉价的价格、广泛的来源、良好的体内降解性和生物相容性，微孔淀粉在生物材料领域渐渐受到关注。淀粉微球表面具有微空结构，并具有一定的吸水性，能够快速吸干血液中的水分，同时发挥分子筛的作用，使血液中红细胞、凝血酶、血小板和纤维蛋白等有形成分在颗粒表面聚集，形成凝胶状混合物，从而达到迅速止血的效果。但是淀粉类止血材料仍然未能解决现有止血材料止血不够迅速的技术问题。
因此，目前亟需提供一种能够有效防粘连且同时能够快速止血的防粘连膜。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种止血防粘连膜，以解决以上缺陷。
本发明提供了一种止血防粘连膜，包括由分子量为0.5～50万的可降解高分子材料相互交织而成的防粘连纤维层和附着于该防粘连纤维层上且由连接至少一个带电配体的阴离子淀粉制成的止血材料，所述带电配体包括至少一个羧基官能团和至少一个氨基官能团。
优选地，所述带电配体为分子量为2～4×103，取代度为80～90％的羧甲基壳聚糖。
优选地，所述可降解高分子材料选自所述可降解高分子材料选自聚乳酸类高分子材料、聚乙交酯类高分子材料、聚丙交酯类高分子材料、聚己内酯类高分子材料、聚三亚甲基碳酸酯类高分子材料和聚对二氧环己酮类高分子材料中的一种或几种。
优选地，所述可降解高分子材料为聚乳酸。
优选地，所述止血材料由以下步骤制得：
S1、酸解：取淀粉与1～38％的盐酸溶液按1:(1～100)的比例混合，搅拌得淀粉多糖溶液，将上述淀粉多糖溶液置于10～90℃的恒温水浴中反应0.1～10h，反应过程中持续搅拌，搅拌速度为200～3000rpm；
S2、交联：往上述酸解处理后的淀粉多糖溶液加入植物油、氢氧化钠溶液、乳化剂和交联剂，搅拌混合，其中，植物油、氢氧化钠溶液、乳化剂和交联剂的重量比为(1～2):(1～2):(0.1～0.9):(0.1～1)；
S3、阴离子化反应：将乙醇溶液、一氯醋酸、氢氧化钠溶液以及经上述S2步骤处理后的淀粉多糖溶液分别加入反应器中，充分搅拌，升温至30～90℃，反应1～24h后加入冰醋酸，调节pH为6.5～7.0，过滤，用乙醇溶液洗涤，干燥，得阴离子淀粉；
S4、阳离子化反应：将0.1～3g包括至少一个羧基官能团和至少一个氨基官能团的带电配体、0.1～3g羰基二咪唑加入到30～80ml的二甲基甲酰胺溶液中，常温反应1～3h，加入1～10g上述步骤S3所得的阴离子淀粉，搅拌均匀，升温至50～70℃，反应8～24h，静置分层后用乙醇洗涤并干燥，即得。
优选地，所述淀粉选自马铃薯淀粉、玉米淀粉、豌豆淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、绿豆淀粉、荸荠淀粉、葛根淀粉、莲藕淀粉、红薯淀粉、糯米淀粉、甘薯淀粉和菱角淀粉中的一种或几种。
优选地，所述淀粉由马铃薯淀粉和玉米淀粉按(0.01～0.1):(0.01～0.2)的重量比组成。
优选地，所述淀粉由马铃薯淀粉和玉米淀粉按0.06:0.04的重量比组成。
优选地，所述步骤S2中所述植物油为大豆油；所述乳化剂选自司盘-60、司盘-80、司盘-85、壬基酚聚氧乙烯醚、吐温-80、吐温-20、吐温-40和吐温-60中的一种或者几种；所述交联剂为环氧氯丙烷。
优选地，所述乳化剂由司盘-80和吐温-60按1:(0.1～1)的重量比组成。
优选地，所述步骤S4中带电配体的用量为2g，羰基二咪唑的用量为1g，阴离子淀粉的用量为4g。
优选地，所述带电配体为羧甲基壳聚糖，所述羧甲基壳聚糖的分子量为2～4×103，取代度为80～90％。
相应地，本发明还提供了一种制备上述的止血防粘连膜的方法，包括以下步骤：
A)止血材料的制备：由步骤S1～S4组成：
S1、酸解：取淀粉与1～38％的盐酸溶液按1:(1～100)的比例混合，搅拌得淀粉多糖溶液，将上述淀粉多糖溶液置于10～90℃的恒温水浴中反应0.1～10h，反应过程中持续搅拌，搅拌速度为200～3000rpm；
S2、交联：往上述酸解处理后的淀粉多糖溶液加入植物油、氢氧化钠溶液、乳化剂和交联剂，搅拌混合，其中，植物油、氢氧化钠溶液、乳化剂和交联剂的重量比为(1～2):(1～2):(0.1～0.9):(0.1～1)；
S3、阴离子化反应：将乙醇溶液、一氯醋酸、氢氧化钠溶液以及经上述S2步骤处理后的淀粉多糖溶液分别加入反应器中，充分搅拌，升温至30～90℃，反应1～24h后加入冰醋酸，调节pH为6.5～7.0，过滤，用乙醇溶液洗涤，干燥，得阴离子淀粉；
S4、阳离子化反应：将0.1～3g包括至少一个羧基官能团和至少一个氨基官能团的带电配体、0.1～3g羰基二咪唑加入到30～80ml的二甲基甲酰胺溶液中，常温反应1～3h，加入1～10g上述步骤S3所得的阴离子淀粉，搅拌均匀，升温至50～70℃，反应8～24h，静置分层后用乙醇洗涤并干燥，即得；
B)防粘连纤维素层的制备：将可降解高分子材料分散于有机溶剂中，得到高分子混合溶液，将高分子混合溶液通过静电纺丝，得到防粘连纤维层；
C)将上述止血材料加入纯化水，配制成1～5％的混合淀粉悬浮液，将该混合淀粉悬浮液经雾化后均匀喷涂在该防粘连纤维层表面，40～60℃干燥灭菌，即得。
本申请防粘连膜将连接包括至少一个羧基官能团和至少一个氨基官能团的带电配体的阴离子淀粉止血材料附着于由可降解高分子材料相互交织形成的防粘连纤维层外层。其能够快速吸干血液中的水分，形成凝胶状混合物能够黏附于伤口表面，并且发挥分子筛的作用，使血液中红细胞、凝血酶、血小板和纤维蛋白等有形成分在颗粒表面聚集，从而达到快速止血的作用，同时能够有效减少术后粘连的发生。
带电配体优选为羧甲基壳聚糖，羧甲基壳聚糖是壳聚糖的一种水溶性衍生物，羧甲基化的取代使两种异电基团(羧基和氨基)共存于同一葡聚糖链上。发明人发现，通过将同时含有羧基和氨基的羧甲基壳聚糖连接到可降解淀粉上，可以改变可降解淀粉的特性。优选是将羧甲基壳聚糖连接到阴离子可降解淀粉上。试验证明，将羧甲基壳聚糖连接到大部分阴离子可降解淀粉上可以明显地提高止血淀粉的止血速度，同时能够克服由于羧甲基壳聚糖的水溶性而导致止血材料对创面的粘附力不足的缺陷。试验结果证明，不经阴离子化反应，直接将可降解淀粉与羧甲基壳聚糖连接得到的止血材料，其止血时间延长了59s。值得提出的是，发明人同时发现，羧甲基壳聚糖的分子量和取代度对止血淀粉的性能有较大的影响。发明人经过大量的试验终于得出，羧甲基壳聚糖的分子量优选为2～4×103，更优选2.6×103，取代度优选为80～90％，更优选为88％更有利于止血淀粉性能的提升。
另外，发明人将马铃薯淀粉和玉米淀粉作为原料，经酸解、交联、阴离子化、阳离子化反应后制得的止血淀粉的在流血21.25～23.5s后即可止血，具有优异的止血性能。但令发明人意想不到的是，以葛根淀粉和莲藕淀粉作为原料经本发明方法制备得到的止血淀粉的止血性能不太理想，这可能是与淀粉中直链淀粉和支链淀粉的比例有关，而含有较多的支链淀粉更有利于止血材料的性能的提升。
本申请中所述乳化剂选自司盘-60、司盘-80、司盘-85、壬基酚聚氧乙烯醚、吐温-80、吐温-20、吐温-40和吐温-60中的一种或者几种。
优选地，本申请中所述乳化剂由司盘-80和吐温-60按1:(0.1～1)的重量比组成。
与现有技术相比，本发明止血防粘连膜具有以下优势：
1)本申请防粘连膜能够有效防粘连，同时具有优异的止血效果，在流血21.25～23.5s后即可迅速止血。
2)本申请通过在阴离子淀粉上连接同时含有一个以上羧基和氨基官能团的羧甲基壳聚糖，使得制备得到的止血材料的止血性能大大提升，取得了显著的进步。
具体实施方式：
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明部分原料的厂家信息
组分 厂家/CAS号
马铃薯淀粉 9005-25-8
玉米淀粉 9005-25-8
豌豆淀粉 烟台双塔食品股份有限公司
木薯淀粉 中山市弘欣生物科技有限公司
小麦淀粉 郑州明瑞化工产品有限公司
大米淀粉 江西金农生物科技有限公司
绿豆淀粉 济南兴森淀粉科技有限公司
荸荠淀粉 襄阳三珍食品有限公司
葛根淀粉 昆明朗盛生物科技有限公司
莲藕淀粉 广西南宁世博基业贸易有限公司
红薯淀粉 重庆金田农业集团有限公司
糯米淀粉 无锡金陵塔淀粉有限公司
甘薯淀粉 重庆金田农业集团有限公司
菱角淀粉 西安天瑞生物技术有限公司
实施例1、不同淀粉原料的组合对止血材料止血性能的影响试验
1.材料与方法
1.1试验动物：健康成年SD大鼠90只，雌雄不限，体重210～240g；健康成年新西兰兔8只，雌雄不限，体重1.9～2.1kg，均由广东省医学实验动物中心提供。
1.2试验方法
1.2.1止血时间及出血量测定将90只大鼠根据下表1的15种淀粉的组合制得的止血材料随机分为15组，每组6只。全部动物术前均禁食(不禁水)12h，3％戊巴比妥钠40mg/kg体重腹腔注射麻醉，于肋弓下沿腹中线作一长约2cm纵行切口，沿腹中线剪开腹肌，挤压腹部至肝中叶从切口处被挤出，吸干肝脏周围腹腔液后将称重后的无菌纱布垫于肝中叶下，于肝中叶下缘以上2cm处快速切除肝中叶。根据分组立即均匀涂抹上述15种淀粉的组合制得的止血材料300mg，并开始计时，直至出血停止，记录止血时间及出血量。止血时间为切除肝中叶开始至出血停止；出血量为切除前后无菌纱布重量差。
1.2.2体外促凝血测定
取根据表1的15种淀粉的组合制得的止血材料，分别置于5ml0.01mol/LPBS溶液(取8gNaCl/0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L制成0.01mol/L PBS溶液)中，终浓度为0.2mg/ml，分别标记好。各组取0.2ml溶液置于直径1cm、长10cm的试管璃管中，于37℃水浴箱中水浴2分钟。于每只新西兰兔耳中央动脉抽取30ml动脉血，分别加入2ml兔血于上述试管中，混合均匀后水浴，每隔30s倾斜试管，至血液凝结不流动，记录凝血时间，每组测量8个样本，结果取平均值。
1.3结果见表1。
表1试验结果
由上表可知，淀粉原料的种类对止血材料的止血性能有较大的影响。其中，以马铃薯淀粉和玉米淀粉、菱角淀粉和玉米淀粉、大米淀粉和绿豆淀粉作为原料经本发明申请所述制备方法制得的止血材料的止血性能较好。并且以马铃薯淀粉和玉米淀粉作为原料制得的止血材料的止血性能最佳，其止血时间为20s，出血量为0.38，体外促凝血时间为26s。
值得提出的是，以葛根淀粉和莲藕淀粉为原料经本发明申请所述制备方法制得的止血材料的止血性能不太理想，这一点是发明人意想不到的。
实施例2、一种止血防粘连膜
本发明实施例2所述止血防粘连膜由以下步骤制得：
A)止血材料的制备：由步骤S1～S4组成：
S1、酸解：取淀粉与15％的盐酸溶液按1:5的比例混合，搅拌得淀粉多糖溶液，将上述淀粉多糖溶液置于50℃的恒温水浴中反应15h，反应过程中持续搅拌，搅拌速度为600rpm，得到酸解后的淀粉多糖溶液；
S2、交联：往上述酸解处理后的淀粉多糖溶液中加入大豆油、氢氧化钠溶液、乳化剂和环氧氯丙烷，搅拌混合；其中，大豆油、氢氧化钠溶液、乳化剂和环氧氯丙烷的重量比为2:1:0.06：0.1，反应36h；
S3、阴离子化反应：将乙醇溶液、一氯醋酸、氢氧化钠溶液以及经上述S2步骤处理后的淀粉多糖溶液分别加入反应器中，充分搅拌，升温至50℃，反应3h后加入冰醋酸，调节pH为6.8，过滤，用乙醇溶液洗涤，干燥，得阴离子淀粉；
S4、阳离子化反应：将2g分子量为3×103，取代度为88％的羧甲基壳聚糖、1g羰基二咪唑加入到50ml的二甲基甲酰胺溶液中，常温反应2小时，加入4g上述步骤S3所得的阴离子淀粉，搅拌均匀，升温至60℃，反应12h，静置分层后用乙醇洗涤并干燥，即得；其中，所述淀粉由马铃薯淀粉和玉米淀粉按0.06:0.04的重量比组成，所述乳化剂由司盘-80和吐温-60按1:0.3的重量比组成；
B)防粘连纤维素层的制备：将分子量为3万的聚乳酸分散于由DMF、丙酮、THF和六氟异丙醇组成的有机溶剂中，得到浓度为15％的聚乳酸混合溶液，将聚乳酸混合溶液分别注入5个10ml注射器中，加上5号不锈钢枕头，在电压为10KV，溶液流速为1ml/h，接收距离为5cm的条件下进行静电纺丝，得到防粘连纤维层；
C)将上述止血材料加入纯化水，配制成3％的混合淀粉悬浮液，将该混合淀粉悬浮液经雾化后均匀喷涂在该防粘连纤维层表面，50℃干燥灭菌，即得。
实施例3、一种止血防粘连膜
本发明实施例3所述止血防粘连膜由以下步骤制得：
A)止血材料的制备：由步骤S1～S4组成：
S1、酸解：取淀粉与20％的盐酸溶液按1:1的比例混合，搅拌得淀粉多糖溶液，将上述淀粉多糖溶液置于30℃的恒温水浴中反应24h，反应过程中持续搅拌，搅拌速度为200rpm，得到淀粉多糖溶液；
S2、交联：往上述酸解处理后的淀粉多糖溶液中加入大豆油、氢氧化钠溶液、乳化剂和环氧氯丙烷，搅拌混合；其中，大豆油、氢氧化钠溶液、乳化剂和环氧氯丙烷的重量比为1:1:0.1:0.1，反应36h；
S3、阴离子化反应：将乙醇溶液、一氯醋酸、氢氧化钠溶液以及经上述S2步骤处理后的淀粉多糖溶液分别加入反应器中，充分搅拌，升温至30℃，反应1h后加入冰醋酸，调节pH为6.5，过滤，用乙醇溶液洗涤，干燥，得阴离子淀粉；
S4、阳离子化反应：将0.1g分子量为2×103，取代度为80％的羧甲基壳聚糖、0.1g羰基二咪唑加入到30ml的二甲基甲酰胺溶液中，常温反应1小时，加入1g上述步骤S3所得的阴离子淀粉，搅拌均匀，升温至50℃，反应8h，静置分层后用乙醇洗涤并干燥，即得；其中，所述淀粉由马铃薯淀粉和玉米淀粉按0.01:0.01的重量比组成，所述乳化剂由司盘-80和吐温-60按1:0.1的重量比组成；
B)防粘连纤维素层的制备：将分子量为0.5万的聚乳酸分散于由DMF、丙酮、THF和六氟异丙醇组成的有机溶剂中，得到浓度为20％的聚乳酸混合溶液，将聚乳酸混合溶液分别注入5个10ml注射器中，加上5号不锈钢枕头，在电压为30KV，溶液流速为5ml/h，接收距离为25cm的条件下进行静电纺丝，得到防粘连纤维层；
C)将上述止血材料加入纯化水，配制成1％的混合淀粉悬浮液，将该混合淀粉悬浮液经雾化后均匀喷涂在该防粘连纤维层表面，40℃干燥灭菌，即得。
实施例4、一种止血防粘连膜
本发明实施例4所述止血防粘连膜由以下步骤制得：
A)止血材料的制备：由步骤S1～S4组成：
S1、酸解：取淀粉与15％的盐酸溶液按10的比例混合，搅拌得淀粉多糖溶液，将上述淀粉多糖溶液置于60℃的恒温水浴中反应5h，反应过程中持续搅拌，搅拌速度为3000rpm；
S2、交联：往上述酸解处理后的淀粉多糖溶液中加入大豆油、氢氧化钠溶液、乳化剂和环氧氯丙烷，搅拌混合，其中，大豆油、氢氧化钠溶液、乳化剂和环氧氯丙烷的重量比为2:2:0.9:1，反应36h；；
S3、阴离子化反应：将乙醇溶液、一氯醋酸、氢氧化钠溶液以及经上述S2步骤处理后的淀粉多糖溶液分别加入反应器中，充分搅拌，升温至60℃，反应4h后加入冰醋酸，调节pH为7.0，过滤，用乙醇溶液洗涤，干燥，得阴离子淀粉；
S4、阳离子化反应：将3g分子量为4×103，取代度为90％的羧甲基壳聚糖、3g羰基二咪唑加入到80ml的二甲基甲酰胺溶液中，常温反应3小时，加入10g上述步骤S3所得的阴离子淀粉，搅拌均匀，升温至70℃，反应16h，静置分层后用乙醇洗涤并干燥，即得；其中，所述淀粉由马铃薯淀粉和玉米淀粉按0.1:0.2的重量比组成，所述乳化剂由司盘-80和吐温-60按1:1的重量比组成。
B)防粘连纤维素层的制备：将分子量为5万的聚乳酸分散于由DMF、丙酮、THF和六氟异丙醇组成的有机溶剂中，得到浓度为10％的聚乳酸混合溶液，将聚乳酸混合溶液分别注入8个10ml注射器中，加上5号不锈钢枕头，在电压为20KV，溶液流速为3ml/h，接收距离为15cm的条件下进行静电纺丝，得到防粘连纤维层；
C)将上述止血材料加入纯化水，配制成5％的混合淀粉悬浮液，将该混合淀粉悬浮液经雾化后均匀喷涂在该防粘连纤维层表面，60℃干燥灭菌，即得。
对比例1、一种止血防粘连膜
对比例1与实施例2的区别在于：去掉S3步骤，其余操作及参数如实施例2。
对比例2、一种止血防粘连膜
对比例2与实施例2的区别在于：将步骤S3和步骤S4调换顺序，其余操作及参数如实施例2。
对比例3、一种止血防粘连膜
对比例3与实施例2的区别在于：用精氨酸替换步骤S4中的羧甲基壳聚糖，其余操作及参数如实施例2。
对比例4、一种止血防粘连膜
对比例4与实施例2的区别在于：步骤S4中羧甲基壳聚糖的分子量为1×103，其余操作及参数如实施例2。
对比例5、一种止血防粘连膜
对比例5与实施例2的区别在于：用壳聚糖替换步骤S4中的羧甲基壳聚糖，其余操作及参数如实施例2。
试验例一、效果试验
(一)防粘连试验
1.材料与方法
1.1试验动物：健康成年新西兰兔15只，雌雄不限，体重1.9～2.1kg，均由广东省医学实验动物中心提供。
1.2.试验方法
1.2.1动物分组：将上述新西兰兔随机分为5组，按术后处死时间随机分为2、4、8、12、24周组，每组3只，采用自身对照。
1.2.2手术方法：进行3％戊巴比妥钠兔耳缘静脉注射麻醉后，以俯卧位头部支架固定，消毒铺单。取头部正中纵行切开头皮，行双侧顶部开窗，直径约1.0cm，剪除兔的硬脑膜1.0cm，用5号注射器针头轻轻划破珠网膜至使肉眼能看见脑脊液外漏，各周组置入直径约1.0cm的本申请实施例2～4所述止血防粘连膜，对侧空白对照，缝合头皮。
1.2.3术后处理
术后单笼饲养，自由饮水进食，每日观察伤口愈合情况。
1.2.4观察内容及方法
1.2.4.1大体观察术后2、4、8、12、24周后各处死3只兔子，肉眼观察硬脑膜下组织与瘢痕粘连情况，参考Rydell和Balazs标准进行粘连等级评分。评分标准如表2所示，评分结果如表3所示。
1.2.4.2光镜观察将处死的兔子的术区及周围颅骨连同颅骨下脑组织一并取出，3％硝酸脱钙1～2天，10％福尔马林固定2天。标本再经脱水、石蜡包埋，参考He和Revel标准进行组织粘连评分。评分标准如表4所示，评分结果如表5所示。
表2大体观察评分标准
0分 硬脑膜下组织与瘢痕无明显粘连
1分 硬脑膜下组织与瘢痕有薄而散在的膜性粘连，但牵扯瘢痕组织粘连易与硬脑膜下组织分离
2分 硬脑膜下组织与瘢痕粘连较广泛和致密，但仍可钝性分离，分离后硬脑膜下组织完整
3分 硬脑膜下组织与瘢痕粘连致密，需锐性分离，分离后硬脑膜下组织难以保持完整
表3术后不同时间瘢痕与硬膜下组织粘连大体观察评分结果
表4光镜观察评分标准
0分 硬脑膜下组织与瘢痕无粘连、间隙存在
1分 硬脑膜下组织与瘢痕仅见少量纤维束
2分 硬脑膜下组织与瘢痕粘连范围少于颅骨缺损横径2/3
3分 硬脑膜下组织与瘢痕粘连广泛，范围大于颅骨缺损横径2/3，和/或瘢痕组织侵入脑组织
表5术后不同时间瘢痕与硬膜下组织粘连光镜观察评分结果
由表3、表5可知，本申请实施例2～4所述止血防粘连膜对术后防粘连有明显效果。
(二)止血试验
2.材料与方法
2.1试验动物：健康成年新西兰兔4只，雌雄不限，体重1.9～2.1kg，均由广东省医学实验动物中心提供，标记为1～4号。
2.2试验方法
2.2.1止血时间及出血量测定按30mg/kg体重于兔耳静脉缓慢注入3％戊巴比妥钠，将动物背部剪毛并用碘尔康溶液消毒铺巾单后，沿脊柱两侧对称各剪8个圆形切口，直径约1.0cm，深度至皮肤全层，然后仔细避开皮下组织层中较大的血管，剪(分离)至筋膜层。在新西兰兔的一侧8个圆形切口处分别敷以本申请实施例2～4以及对比例1～5所述止血防粘连膜，另一侧对称性地敷以灭菌纱布止血，记录止血时间，观察与创面的粘合情况，每个样本重复4次。停止止血后揭下防粘连膜，放入预先配制好的氰化高铁血红蛋白试剂5ml中仔细清洗，以紫外分光光度计560nm波长光度比色，以其中Hb的含量代表出血量。
2.3结果见表6、表7。
表6本申请实施例2～4以及对比例1～5止血防粘连膜及纱布对照组的止血时间(s)
实施例2 实施例3 实施例4 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4 对比例5 对照组
1号 22 22 23 81 75 68 66 59 158
2号 20 23 24 86 72 70 70 55 142
3号 23 25 25 93 82 75 72 60 163
4号 20 21 22 80 73 72 68 62 136
平均值 21.25 22.75 23.5 85 75.5 70.75 69 59 149.75
表7本申请实施例2～4以及对比例1～5止血防粘连膜及纱布对照组的Hb光度吸收值A
由表6、表7可知，本申请所述止血防粘连在出血后21.25～23.5s内即可止血，具有优异的止血效果。值得提出的是，对比例1～5与实施例2相比，止血效果均有明显下降。从对比例1可看出，将羧甲基壳聚糖连接到阴离子可降解淀粉上比直接连接到可降解淀粉上更有利于提高止血材料的止血效果，这一点从对比例2的试验结果也可以看出。另外，与精氨酸相比，羧甲基壳聚糖的加入更有利于提高止血材料的止血效果，同时羧甲基壳聚糖的分子量对止血材料的止血效果也有一定的影响。

Claims (5)

1.一种止血防粘连膜，其特征在于，包括由分子量为0.5万～50万的可降解高分子材料相互交织而成的防粘连纤维层和附着于该防粘连纤维层上且由连接至少一个带电配体的阴离子淀粉制成的止血材料，所述带电配体为分子量为2～4×103，取代度为80～90％的羧甲基壳聚糖；所述止血材料由以下步骤制得：
S1、酸解：取淀粉与1～38％的盐酸溶液按1:(1～100)的比例混合，搅拌得淀粉多糖溶液，将上述淀粉多糖溶液置于10～90℃的恒温水浴中反应0.1～10h，反应过程中持续搅拌，搅拌速度为200～3000rpm；
S2、交联：往上述酸解处理后的淀粉多糖溶液加入植物油、氢氧化钠溶液、乳化剂和交联剂，搅拌混合，其中，植物油、氢氧化钠溶液、乳化剂和交联剂的重量比为(1～2):(1～2):(0.1～0.9):(0.1～1)；
S3、阴离子化反应：将乙醇溶液、一氯醋酸、氢氧化钠溶液以及经上述S2步骤处理后的淀粉多糖溶液分别加入反应器中，充分搅拌，升温至30～90℃，反应1～24h后加入冰醋酸，调节pH为6.5～7.0，过滤，用乙醇溶液洗涤，干燥，得阴离子淀粉；
S4、阳离子化反应：将0.1～3g包括至少一个羧基官能团和至少一个氨基官能团的带电配体、0.1～3g羰基二咪唑加入到30～80ml的二甲基甲酰胺溶液中，常温反应1～3h，加入1～10g上述步骤S3所得的阴离子淀粉，搅拌均匀，升温至50～70℃，反应8～24h，静置分层后用乙醇洗涤并干燥，即得；所述淀粉由马铃薯淀粉和玉米淀粉按(0.01～0.1):(0.01～0.2)的重量比组成。
2.如权利要求1所述的止血防粘连膜，其特征在于，所述可降解高分子材料选自聚乳酸类高分子材料、聚乙交酯类高分子材料、聚丙交酯类高分子材料、聚己内酯类高分子材料、聚三亚甲基碳酸酯类高分子材料和聚对二氧环己酮类高分子材料中的一种或几种。
3.如权利要求1所述的止血防粘连膜，其特征在于，所述步骤S2中所述植物油为大豆油；所述乳化剂选自司盘-60、司盘-80、司盘-85、壬基酚聚氧乙烯醚、吐温-80、吐温-20、吐温-40和吐温-60中的一种或者几种；所述交联剂为环氧氯丙烷。
4.如权利要求1所述的止血防粘连膜，其特征在于，所述步骤S4中带电配体的用量为2g，羰基二咪唑的用量为1g，阴离子淀粉的用量为4g。
5.一种制备如权利要求1～4任一所述的止血防粘连膜的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)止血材料的制备：由步骤S1～S4组成：
S1、酸解：取淀粉与1～38％的盐酸溶液按1:(1～100)的比例混合，搅拌得淀粉多糖溶液，将上述淀粉多糖溶液置于10～90℃的恒温水浴中反应0.1～10h，反应过程中持续搅拌，搅拌速度为200～3000rpm；
S2、交联：往上述酸解处理后的淀粉多糖溶液加入植物油、氢氧化钠溶液、乳化剂和交联剂，搅拌混合，其中，植物油、氢氧化钠溶液、乳化剂和交联剂的重量比为(1～2):(1～2):(0.1～0.9):(0.1～1)；
S3、阴离子化反应：将乙醇溶液、一氯醋酸、氢氧化钠溶液以及经上述S2步骤处理后的淀粉多糖溶液分别加入反应器中，充分搅拌，升温至30～90℃，反应1～24h后加入冰醋酸，调节pH为6.5～7.0，过滤，用乙醇溶液洗涤，干燥，得阴离子淀粉；
S4、阳离子化反应：将0.1～3g包括至少一个羧基官能团和至少一个氨基官能团的带电配体、0.1～3g羰基二咪唑加入到30～80ml的二甲基甲酰胺溶液中，常温反应1～3h，加入1～10g上述步骤S3所得的阴离子淀粉，搅拌均匀，升温至50～70℃，反应8～24h，静置分层后用乙醇洗涤并干燥，即得；
B)防粘连纤维素层的制备：将可降解高分子材料分散于有机溶剂中，得到高分子混合溶液，将高分子混合溶液通过静电纺丝，得到防粘连纤维层；
C)将上述止血材料加入纯化水，配制成1～5％的混合淀粉悬浮液，将该混合淀粉悬浮液经雾化后均匀喷涂在该防粘连纤维层表面，40～60℃干燥灭菌，即得。
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