CN106727807B - 一种人参酶解物及其制备工艺和应用 - Google Patents
一种人参酶解物及其制备工艺和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及中药技术领域，公开了一种人参酶解物及其制备工艺和应用。本发明所述制备工艺先提取人参，获得人参提取液，浓缩后调节pH值为酸性，获得人参浓缩液；向人参浓缩液中加入复合酶进行酶解，酶解后干燥获得人参酶解物；其中，所述复合酶为纤维素酶和选自果胶酶、半纤维素酶和β‑葡聚糖酶中一种或两种以上的酶。本发明通过适宜的酶组合以及酶解方式，对人参提取液进行了酶解处理，获得了特定皂苷成分组成的人参酶解物，对MDSC和结肠癌具有很好的抑制作用，同时与化疗药物联用对抑制结肠癌具备协同作用。
Description
技术领域
本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种人参酶解物及其制备工艺和应用。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病，目前肿瘤的常规治疗方法为手术切除、放疗和化疗，尽管取得了一些进展，但肿瘤复发和转移是困扰临床肿瘤治疗的具有普遍意义的难题。究其原因，在于现有治疗的目标仍然集中在肿瘤细胞本身，而忽略了其微环境的重要性。
在体外活性药物能够识别肿瘤抗原并杀伤肿瘤细胞。然而，要消除机体内形成的肿瘤仅靠识别肿瘤抗原是不够的。一个成型的肿瘤是一个复杂的组织，它不仅由肿瘤细胞组成，还包括基质细胞，炎症细胞，脉管系统和细胞外基质(ECM)，所有这些总和定义为肿瘤微环境(TME)。肿瘤的发生和转移与肿瘤细胞所处的内外环境有着密切关系。它不仅包括肿瘤所在组织的结构、功能和代谢，而且亦与肿瘤细胞自身的(核和胞质)内在环境有关。
肿瘤微环境与肿瘤细胞之间就像土壤与种子的关系，肿瘤细胞可以通过自分泌和旁分泌，改变和维持自身生存和发展的条件，促进肿瘤的生长和发展。全身和局部组织亦可通过代谢、分泌、免疫、结构和功能的改变，限制和影响肿瘤的发生和发展。肿瘤与环境，两者既是相互依存，相互促进，又是相互拮抗，相互斗争的。肿瘤恶变过程，就是肿瘤细胞与其微环境共进化的过程，其结果就是休眠肿瘤细胞的苏醒，进入快速增殖，并发生转移。因此，改善肿瘤微环境，维持肿瘤细胞的休眠状态，是目前研究的热点和重点。微环境是肿瘤研究前沿。
免疫负调控研究为肿瘤治疗提供了新策略。肿瘤微环境中，存在着大量的负调控细胞，它们相互作用，相互影响，伴随着肿瘤细胞和微环境的共进化。由于肿瘤细胞的免疫原性改变和非正常生长，刺激成纤维细胞释放炎症因子，抗原提呈细胞传递肿瘤抗原信号，共同招募免疫细胞浸润到肿瘤局部，而且肿瘤细胞的异常增殖引起对邻近细胞的压迫，导致缺血坏死等组织损伤，产生大量的炎性因子，因此肿瘤局部处于非可控性炎症状态，导致微环境免疫负调控的形成，诱导髓源抑制性细胞(MDSC)的形成。其结果是抑制细胞毒性T细胞(CTL)、自然杀伤细胞(NK)的活性，维持肿瘤局部的免疫耐受状态。
MDSC在肿瘤微环境中发挥了免疫抑制效应，抑制了杀伤性T细胞对肿瘤细胞的清除作用，因此目前MDSC成为肿瘤治疗的重要细胞靶点之一。MSC2细胞为MDSC细胞系中一种亚细胞，稳定，常用于诱导髓源抑制性细胞(MDSC)系列实施中，阐述相关机理。
人参及其相关提取物、酶解物等具有抑制肿瘤细胞本身的活性，但是目前的现有技术中尚未有相关的产品可以作用于MDSC，并具有明显的抑制活性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于一种人参酶解物的制备工艺，使得所述制备工艺制备的人参酶解物对MDSC具有很好的抑制作用，进而有效改善肿瘤微环境。
本发明的另外一个目的在于提供一种人参酶解物的制备工艺，使得所述制备工艺制备的人参酶解物对结肠癌具有明显的抑制作用，同时与化疗药物联用对抑制结肠癌具有协同作用。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种人参酶解物的制备工艺，提取人参，获得人参提取液，浓缩后调节pH值为酸性，获得人参浓缩液；向人参浓缩液中加入复合酶进行酶解，酶解后干燥获得人参酶解物；
其中，所述复合酶为纤维素酶和选自果胶酶、半纤维素酶和β-葡聚糖酶中任意一种或两种以上的酶。
本发明针对现有技术中缺乏能够抑制髓源抑制性细胞(MDSC)的人参提取物的问题，通过特殊的酶解工艺对人参提取液进行酶解，获得了对MDSC具有较好抑制作用的人参酶解物，解决了技术问题。
作为优选，所述提取人参为通过水煎法提取人参。在具体实施方式中，所述提取人参的方法可参照如下：
取人参药材，加入人参药材重量10-30倍水，提取1-3次、每次1.5-3小时，过滤，合并滤液，得人参提取液；或者取人参药材，粉碎，过60-120目筛，加入药材重量15-30倍水，煎煮1.5-3小时，得人参提取液。
作为优选，所述调节pH值为酸性为调节pH值为4.0-6.5，可采用苹果酸、醋酸、柠檬酸中的一种调节，pH值可具体调节为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0或6.5。
作为优选，所述人参浓缩液与人参的液料比为5-15ml：1g。在本发明具体实施方式中，所述人参浓缩液与人参的液料比为5ml:1g、8ml:1g、9ml:1g、10ml:1g、11ml:1g、12ml:1g或15ml:1g。
作为优选，所述复合酶和人参的质量比为0.01-0.14:1。在本发明具体实施方式中，所述复合酶和人参的质量比为0.01:1、0.04:1、0.05:1、0.07:1、0.08:1、0.12:1或0.14:1。作为优选，所述复合酶中各酶的质量相同，所采用的纤维素酶酶活为300-3000u/ml，果胶酶酶活为300-3000u/ml，半纤维素酶活为300-3000u/ml，β-葡聚糖酶酶酶活为3000-30000u/ml。
作为优选，所述酶解为在40-70℃下酶解1-6天，更优选为酶解4-5天。在具体实施方式中，所述酶解为在55℃下酶解5天、在70℃下酶解6天、在40℃下酶解1天、在60℃下酶解5天、在55℃下酶解4天、在50℃下酶解3天或在45℃下酶解2天。
本发明所述复合酶可一次性全部加入，但分次加入所获得的人参酶解物活性更佳，故作为优选，所述加入复合酶为将复合酶按重量份分成6等份，每隔4-24h加入一等份；在具体实施方式中，加入的间隔时间可以具体选择为4h、12h、16h、20h或24h。
此外，在对酶解后的酶解物干燥前，本发明制备工艺还可包括加入辅料后再干燥；优选的所述辅料选自麦芽糊精、微晶纤维素、二氧化硅和淀粉中的一种或几种。
经过本发明制备的人参酶解物，含水量低于8％，含有0.69-3.7wt％的人参总皂苷，所述人参总苷中含有5.2-11.4wt％的稀有皂苷；具体地，所述稀有皂苷由以下重量份比的物质组成：人参皂苷Rg3 1.7-3.2份、人参皂苷F1 0-1.9份、人参皂苷CK 0.8-1.8份和人参皂苷Rh2 0-2.9份；进一步地，所述稀有皂苷由以下重量份比的物质组成：人参皂苷Rg32.1-2.9份、人参皂苷F1 1.2-1.9份、人参皂苷CK 0.8-1.0份和人参皂苷Rh2 1.0-2.5份。
同时，本发明制备的人参酶解物对MDSC具有很好的抑制作用，进而可有效改善肿瘤微环境，维持肿瘤细胞的休眠状态从而起到抗肿瘤作用。本发明人参酶解物对结肠癌CT26细胞具有很好的抑制作用，同时与化疗药物联用对结肠癌CT26肿瘤水鼠的肿瘤抑制效果优于单一用药选择，具备协同作用。
由此，本发明提出了由所述制备工艺制备的人参酶解物，以及所述酶解物在制备髓源抑制性细胞(MDSC)抑制剂和/或制备治疗结肠癌药物中的应用。其中，所述治疗结肠癌药物包括所述人参酶解物和化疗药物。所述化疗药物选自广谱抗肿瘤药物。在实施例中，广谱抗肿瘤药物优选5-氟尿嘧啶，剂量为5毫克/公斤/天，皮下注射。
本发明抗肿瘤人参酶解物可以添加医学或食品可接受的载体、赋形剂、赋形剂和/或填充剂，制成任何一种临床上或药学上可接受的剂型的药物可口服制剂。如可将其制成口服制剂，如常规的固体制剂如片剂、胶囊、软胶囊等；液体制剂如口服液，合剂、糖浆剂等；还可制成如注射剂等其他剂型。
由以上技术方案可知，本发明通过适宜的酶组合以及酶解方式，对人参提取液进行了酶解处理，获得了特定皂苷成分组成的人参酶解物，对MDSC和结肠癌具有很好的抑制作用，同时与化疗药物联用对抑制结肠癌具备协同作用。
具体实施方式
本发明公开了一种人参酶解物及其制备工艺和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述人参酶解物及其制备方法和应用已经通过实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品、方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下就本发明所提供的一种人参酶解物及其制备工艺和应用做进一步说明。
实施例1：制备本发明所述人参酶解物
a.人参提取液的制备：先取人参药材饮片，加入药材重量20倍水，提取2次、每次2小时，过滤，合并滤液，得人参提取液；
b.取步骤a中所述人参提取液经减压浓缩后得浓缩液，浓缩液与人参药材的液料比为9ml：1g，最后向所述浓缩液中加醋酸，调节PH值至4.5，得人参浓缩液，备用；
c.酶解反应：取步骤b中所述人参浓缩液，保持所述人参浓缩液温度为45℃，先往所述人参浓缩液中添加酶解物，然后置于酶解罐中进行酶解反应，所述酶解反应时间为2天，得人参酶解中间产物；将所述中间产物进行干燥后得人参酶解物。所述人参酶解物含水量低于6％。
其中，所述酶解物选自纤维素酶和半纤维素酶，其中纤维素酶和半纤维素酶的质量比为1：1；按质量比，所述酶解物与人参药材的质量比为0.05：1。添加酶解物的方法为：一次性加入。
此外，在将人参酶解中间产物干燥前，可向所述人参酶解中间产物中添加淀粉辅料，然后干燥，制得人参酶解物。
运用高效液相法测定经上述方法制备的人参酶解物，所述人参酶解物中含有3.4wt％的人参总皂苷，所述人参总苷中含有6.1wt％的稀有皂苷。进一步的，所述稀有皂苷由以下重量份比的物质组成：人参皂苷Rg3 1.7份、人参皂苷CK1.6份和人参皂苷Rh2 0.7份。
实施例2：制备本发明所述人参酶解物
a.人参提取液的制备：先取人参药材，加入药材重量15倍水，提取2次、每次2.5小时，过滤，合并滤液，得人参提取液；
b.取步骤a中所述人参提取液经减压浓缩后得浓缩液，浓缩液与人参药材的液料比为10ml：1g，最后向所述浓缩液中加苹果酸，调节PH值至5.0，得人参浓缩液，备用；
c.酶解反应：取步骤b中所述人参浓缩液，保持所述人参浓缩液温度为50℃，先往所述人参浓缩液中添加酶解物，然后置于酶解罐中进行酶解反应，所述酶解反应时间为3天，得人参酶解中间产物；将所述中间产物进行干燥后得人参酶解物。所述人参酶解物含水量低于5％。
其中，所述酶解物选自果胶酶和纤维素酶，其中果胶酶和纤维素酶的质量比为1：1；按质量比，所述酶解物与人参药材的质量比为0.08：1。添加酶解物的方法为：先将所述酶解物按重量份比分成6等份，每隔12h加入一等份，并搅拌均匀。
此外，在将人参酶解中间产物干燥前，可向所述人参酶解中间产物中添加麦芽糊精和微晶纤维素辅料，然后干燥，制得人参酶解物。其中，麦芽糊精和微晶纤维素的质量比为1：1。
运用高效液相法测定经上述方法制备的人参酶解物，所述人参酶解物中含有2.8wt％的人参总皂苷，所述人参总苷中含有6.3wt％的稀有皂苷。进一步的，所述稀有皂苷由以下重量份比的物质组成：人参皂苷Rg3 2.0份、人参皂苷CK1.2份和人参皂苷Rh2 1.2份。
实施例3：制备本发明所述人参酶解物
a.人参提取液的制备：先取人参药材，加入药材重量20倍水，提取2次、每次2小时，过滤，合并滤液，得人参提取液；
b.取步骤a中所述人参提取液经减压浓缩后得浓缩液，浓缩液与人参药材的液料比为12ml：1g，最后向所述浓缩液中加柠檬酸，调节PH值至6.0，得人参浓缩液，备用；
c.酶解反应：取步骤b中所述人参浓缩液，保持所述人参浓缩液温度为60℃，先往所述人参浓缩液中添加酶解物，然后置于酶解罐中进行酶解反应，所述酶解反应时间为5天，得人参酶解中间产物；将所述中间产物进行干燥后得人参酶解物。所述人参酶解物含水量低于5％。
其中，所述酶解物选自果胶酶、纤维素酶和β-葡聚糖酶，其中果胶酶、纤维素酶和β-葡聚糖酶的质量比为1：1：1；按质量比，所述酶解物与人参药材的质量比为0.12：1。添加酶解物的方法为：先将所述酶解物按重量份比分成6等份，每隔20h加入一等份，并搅拌均匀。
此外，在将人参酶解中间产物干燥前，可向所述人参酶解中间产物中添加麦芽糊精辅料，然后干燥，制得人参酶解物。
运用高效液相法测定经上述方法制备的人参酶解物，所述人参酶解物中含有2.6wt％的人参总皂苷，所述人参总苷中含有11.4wt％的稀有皂苷。进一步的，所述稀有皂苷由以下重量份比的物质组成：人参皂苷Rg3 2.9份、人参皂苷F1 1.9份、人参皂苷CK 1.0份和人参皂苷Rh2 2.5份。
实施例4：制备本发明所述人参酶解物
a.人参提取液的制备：先取人参药材，粉碎，过60目筛，加入药材重量15倍水，煎煮3小时，得人参提取液；
b.取步骤a中所述人参提取液经减压浓缩后得浓缩液，浓缩液与人参药材的液料比为8ml：1g，最后向所述浓缩液中加柠檬酸，调节PH值至4.0，得人参浓缩液，备用；
c.酶解反应：取步骤b中所述人参浓缩液，保持所述人参浓缩液温度为40℃，先往所述人参浓缩液中添加酶解物，按质量比，所述酶解物与人参药材的质量比为0.04：1。然后置于酶解罐中进行酶解反应，所述酶解反应时间为1天，得人参酶解中间产物；将所述中间产物进行干燥后得人参酶解物。所述人参酶解物含水量低于6％。
其中，所述酶解物选自果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶，三者的质量比为1：1：1。添加酶解物的方法为：先将所述酶解物按重量份比分成6等份，每隔4h加入一等份，并搅拌均匀。其中所述酸选自柠檬酸。
此外，在将人参酶解中间产物干燥前，可向所述人参酶解中间产物中添加麦芽糊精和微晶纤维素辅料，然后干燥，制得人参酶解物。其中麦芽糊精和微晶纤维素的质量比为1：1。
运用高效液相法测定经上述方法制备的人参酶解物，所述人参酶解物中含有0.67wt％的人参总皂苷，所述人参总苷中含有5.3wt％的稀有皂苷。进一步的，所述稀有皂苷由以下重量份比的物质组成：人参皂苷Rg3 3.1份、人参皂苷F1 1.8份。
实施例5：制备本发明所述人参酶解物
a.人参提取液的制备：先取人参药材，粉碎，过100目筛，加入药材重量30倍水，煎煮3小时，得人参提取液；
b.取步骤a中所述人参提取液经减压浓缩后得浓缩液，浓缩液与人参药材的液料比为15ml：1g，最后向所述浓缩液中加柠檬酸，调节PH值至6.5，得人参浓缩液，备用；
c.酶解反应：取步骤b中所述人参浓缩液，保持所述人参浓缩液温度为70℃，先往所述人参浓缩液中添加酶解物，按质量比，所述酶解物与人参药材的质量比为0.08：1。然后置于酶解罐中进行酶解反应，所述酶解反应时间为6天，得人参酶解中间产物；将所述中间产物进行干燥后得人参酶解物。所述人参酶解物含水量低于8％。
其中，所述酶解物选自果胶酶和纤维素酶，二者的比为1：1。添加酶解物的方法为：先将所述酶解物按重量份比分成6等份，每隔24h加入一等份，并搅拌均匀。
此外，在将人参酶解中间产物干燥前，可向所述人参酶解中间产物中添加微晶纤维素辅料，然后干燥，制得人参酶解物。
运用高效液相法测定经上述方法制备的人参酶解物，所述人参酶解物中含有1.6wt％的人参总皂苷，所述人参总苷中含有8.8wt％的稀有皂苷。进一步的，所述稀有皂苷由以下重量份比的物质组成：人参皂苷Rg3 2.4份、人参皂苷CK1.0份和人参皂苷Rh2 3.0份。
实施例6：本发明人参酶解物对髓源抑制性细胞的抑制研究
实验样品制备：取人参药材，按实施例1-5酶解工艺制备的抗肿瘤人参酶解物，将1-5实施例抗肿瘤人参酶解物干燥至含水量低于6％后，分别用MSC2细胞培养体系液制成浓度均为2mg生药材/ml的溶液，得实施例1-5样品溶液，样品标记为实施例1-5。
对照样品制备：
对照样品1：取同一批人参药材，粉碎后过80目筛，加入药材重量20倍水，提取2次，每次2小时，过滤，合并提取液，浓缩后干燥至含水量低于6％，用MSC2细胞培养体系液制成浓度为2mg生药材/ml的溶液，样品标记为对照样品1。
对照样品2：先取同一批人参药材，粉碎后过80目筛，加入药材重量20倍水，提取2次，每次2小时，过滤，合并提取液，浓缩液与人参药材的液料比为12ml：1g，调节PH值至5.5，得人参浓缩液。然后往人参浓缩液中添加纤维素酶，纤维素酶的酶活为300-3000u/ml，同本发明，按质量比，所述纤维素酶与人参药材的比为0.08：1。然后置于酶解罐中进行酶解反应4天，得人参酶解中间产物；将所述中间产物进行干燥后得人参酶解物。所述人参酶解物含水量低于6％。最后用MSC2细胞培养体系液制成浓度为2mg生药材/ml的溶液，样品标记为对照样品2。
对照样品3：先取同一批人参药材，粉碎后过80目筛，加入药材重量20倍水，提取2次，每次2小时，过滤，合并提取液，浓缩液与人参药材的液料比为12ml：1g，调节PH值至5.8，得人参浓缩液。然后往人参浓缩液中添加果胶酶和β-葡聚糖酶(1:1质量比，酶活同本发明，果胶酶酶活为300-3000u/ml，β-葡聚糖酶酶活为3000-30000u/ml)，按质量比，所述复合酶与人参药材的比为0.07：1。然后置于酶解罐中进行酶解反应4天，得人参酶解中间产物；将所述中间产物进行干燥后得人参酶解物。所述人参酶解物含水量低于6％。最后用MSC2细胞培养体系液制成浓度为2mg生药材/ml的溶液，样品标记为对照样品3。
空白组：以相同体积的培养体系代替样品。
实验方法：按常规实验方法培养MDSC细胞系MSC2细胞，并将MSC2细胞接种于96孔板中，接种的MSC2细胞密度为1×104个/孔。分别取实施例1-5样品、对照样品，分别加入接种成功的MSC2的96孔板中，并留有空白组，接种48h后，采用MTT(噻唑蓝)法，利用酶标仪于570nm测定测定细胞吸光度，吸光度值越低代表对细胞抑制作用越好，并记录吸光度值。
实验结果：MTT测定细胞增殖结果运用统计学进行统计分析，统计分析软件为SPSS16.0，分析计量数据多组间比较采用方差分析，显著性水平为α＝0.05，p<0.05。结果进行方差分析结果如表1所示。
表1 MSC2细胞的抑制效应
注：*表示样品与空白对照组比较，P＜0.01。
由以上结果可以看出，实施例1-5对MSC2细胞具有抑制效应，与空白组相比具有统计学意义，且抑制效果均优于对照样品1-3。相对于对照样品(人参提取液，未经酶解或虽经酶解但是所用酶解制剂不同)而言，对髓样抑制性细胞(MDSC)抑制率显著提高，有更强的抗肿瘤价值，进一步说明对髓样抑制性细胞(MDSC)的形成具有抑制作用，有助于维持肿瘤细胞处于休眠状态或者逆转激活状态的肿瘤细胞重新回到休眠状态，有助于提升改善肿瘤微环境的效应，从而加强其抗肿瘤活性。
实施例7：抗肿瘤人参酶解物对结肠癌CT26细胞的抑制研究
实验样品制备：取人参药材，按实施例1-5酶解工艺制备的抗肿瘤人参酶解物，将1-5实施例抗肿瘤人参酶解物干燥至含水量低于6％后，分别用细胞培养体系液制成浓度均为2mg生药材/ml的溶液，得实施例1-5样品溶液，样品标记为实施例1-5。
对照样品制备：
对照样品1：取同一批人参药材，粉碎后过80目筛，加入药材重量20倍水，提取2次，每次2小时，过滤，合并提取液，浓缩至含水量低于6％，用细胞培养体系液制成浓度为2mg/ml的溶液，样品标记为对照样品。
对照样品2：先取同一批人参药材，粉碎后过80目筛，加入药材重量20倍水，提取2次，每次2小时，过滤，合并提取液，浓缩液与人参药材的液料比为12ml：1g，调节PH值至5.5，得人参浓缩液。然后往人参浓缩液中添加纤维素酶，纤维素酶的酶活为300-3000u/ml，同本发明，按质量比，所述纤维素酶与人参药材的比为0.08：1。然后置于酶解罐中进行酶解反应4天，得人参酶解中间产物；将所述中间产物进行干燥后得人参酶解物。所述人参酶解物含水量低于6％。最后用细胞培养体系液制成浓度为2mg生药材/ml的溶液，样品标记为对照样品2。
对照样品3：先取同一批人参药材，粉碎后过80目筛，加入药材重量20倍水，提取2次，每次2小时，过滤，合并提取液，浓缩液与人参药材的液料比为12ml：1g，调节PH值至5.8，得人参浓缩液。然后往人参浓缩液中添加果胶酶和β-葡聚糖酶(1:1质量比，酶活同本发明，果胶酶酶活为300-3000u/ml，β-葡聚糖酶酶活为3000-30000u/ml)，按质量比，所述复合酶与人参药材的比为0.07：1。然后置于酶解罐中进行酶解反应4天，得人参酶解中间产物；将所述中间产物进行干燥后得人参酶解物。所述人参酶解物含水量低于6％。最后用细胞培养体系液制成浓度为2mg生药材/ml的溶液，样品标记为对照样品3。
空白组：以相同体积的培养体系代替样品。
实验方法：
制备荷瘤(结肠癌CT26)小鼠脾脏细胞单细胞悬液：取小鼠脾脏在PBS缓冲液中进行研磨，经100目滤网过滤后离心(1500r/min)3min，去上清。加入红细胞裂解液(RLB)裂解1min，加入5mlPBS重悬，过滤后离心(1500r/min)3min，去上清。加入1640+/+培养基重悬，细胞板计数得到细胞液浓度，加入1640+/+培养基调至所需终浓度，得到脾脏单细胞悬液。接种于96孔板，2×106/孔，48h后，进行流式检测MDSC比例：CT26荷瘤小鼠脾细胞接种于96孔板，细胞密度为5×104/孔，取实施例1-5样品、对照样品和阳性对照，分别加入接种成功的结肠癌CT26的96孔板中，并留有空白组。阴性对照每孔加入等体积的1640+/+培养基至终体积200μl/孔。37℃，5％CO2细胞培养箱培养48h。适当力度吹打细胞后吸出液体，分别注入1.5ml离心管，离心(4000r/min，4℃)5min。去上清，加入含2％NCS的PBS 50μL，依比例加入流式染料，冰上放置，抗体染色30min(7AAD最后染5min)后，离心(4000r/min，4℃)5min，沉淀用200ml含2％NCS的PBS重悬，将细胞悬液转移至流式管，上机检测，流式细胞仪为FACScan flow cytometer(BD Calibur)，采用Flowjo 7.6进行结果分析。实验结果数值越低代表相应样品对结肠癌CT26细胞抑制作用越好，并记录。
实验结果：检测结果运用统计学进行统计分析，统计分析软件为SPSS16.0，分析计量数据多组间比较采用方差分析，显著性水平为α＝0.05，p<0.05。结果进行方差分析结果如表2所示。
表2结肠癌CT26细胞的抑制效应
注：*表示样品与空白对照组比较，P＜0.01
由以上结果可以看出，实施例1-5对结肠癌CT26细胞具有抑制效应，与空白组相比具有统计学意义，且抑制效果均优于对照样品。相对于对照样品(人参提取液，未经酶解或虽经酶解但是所用酶解制剂不同)而言，对结肠癌CT26细胞的抑制效果显著，具有更强的抗肿瘤价值。
实施例8：抗肿瘤人参酶解物与化疗药联用协同抗肿瘤研究
实验样品制备：取人参药材，按实施例1-5酶解工艺制备的抗肿瘤人参酶解物，将1-5实施例抗肿瘤人参酶解物干燥至含水量低于6％，样品标记为实施例1-5。
对照样品制备：
对照样品1：取同一批人参药材，粉碎后过80目筛，加入药材重量20倍水，提取2次，每次2小时，过滤，合并提取液，浓缩至含水量低于6％，样品标记为对照样品1。
对照样品2：先取同一批人参药材，粉碎后过80目筛，加入药材重量20倍水，提取2次，每次2小时，过滤，合并提取液，浓缩液与人参药材的液料比为12ml：1g，调节PH值至5.5，得人参浓缩液。然后往人参浓缩液中添加纤维素酶，纤维素酶的酶活为300-3000u/ml，同本发明，按质量比，所述纤维素酶与人参药材的比为0.08：1。然后置于酶解罐中进行酶解反应4天，得人参酶解中间产物；将所述中间产物进行干燥后得人参酶解物。所述人参酶解物含水量低于6％。最后用细胞培养体系液制成浓度为2mg生药材/ml的溶液，样品标记为对照样品2。
对照样品3：先取同一批人参药材，粉碎后过80目筛，加入药材重量20倍水，提取2次，每次2小时，过滤，合并提取液，浓缩液与人参药材的液料比为12ml：1g，调节PH值至5.8，得人参浓缩液。然后往人参浓缩液中添加果胶酶和β-葡聚糖酶(1:1质量比，酶活同本发明，果胶酶酶活为300-3000u/ml，β-葡聚糖酶酶活为3000-30000u/ml)，按质量比，所述复合酶与人参药材的比为0.07：1。然后置于酶解罐中进行酶解反应4天，得人参酶解中间产物；将所述中间产物进行干燥后得人参酶解物。所述人参酶解物含水量低于6％。最后用细胞培养体系液制成浓度为2mg生药材/ml的溶液，样品标记为对照样品3。
阳性对照：5-氟尿嘧啶(5Fu)注射液，皮下注射，剂量为5毫克/公斤/天。
空白对照：以相同体积的生理盐水为空白对照。
实验方法：取结肠癌细胞系CT26，于皮下接种于Balb/c小鼠，接种剂量为1×106/只。12天后，实施例1-5组取实施例1-5样品用蒸馏水溶解后给鼠灌胃，每只小鼠灌胃剂量以人参药材计、1.5克/公斤/天，每天灌胃1次。对照样品1-3组取对照组1-3样品用蒸馏水溶解后给鼠灌胃，每只小鼠灌胃剂量以人参药材计、1.5克/公斤/天，每天灌胃1次。实施例1-5组和对照样品1-3组，每天还给予皮下注射广谱抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶(5Fu)，剂量为5毫克/公斤/天。阳性对照组，每天单皮下注射广谱抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶(5Fu)，剂量为5毫克/公斤/天。空白对照组采用相同体积的蒸馏水灌胃。
实施例1-3组、对照样品1-3组、阳性对照组和空白组其他喂养相同。每组样本例数为8只。连续进行实验20天时，记录肿瘤大小(长和宽)，计算肿瘤体积，公式为1/2×长×宽2。肿瘤体积数值越低代表对该样品对肿瘤的抑制作用越好。
实验结果：检测结果运用统计学进行统计分析，统计分析软件为SPSS16.0，分析计量数据多组间比较采用方差分析，显著性水平为α＝0.05，p<0.05。实验结果如表3所示。
表3协同抗肿瘤结果(单位：mm3)
注：*表示样品与空白对照组比较，P＜0.01
结果显示，第20天时，实施例1-5与化疗药联用组，结肠癌肿瘤体积小于单纯化疗组(阳性对照)，且优于对照样品1-3组。本结果说明实施例1-5人参酶解物可以增强化疗药的抗肿瘤效果，可用于肿瘤化疗的治疗或辅助治疗。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种人参酶解物的制备工艺，其特征在于，通过水煎法提取人参，获得人参提取液，浓缩后调节pH值为酸性，获得人参浓缩液；将复合酶按重量份分成6等份，每隔4-24h加入一等份，向人参浓缩液中加入复合酶在40-70℃下酶解1-6天，酶解后干燥获得人参酶解物；所述人参酶解物含有0.69-3.7wt%的人参总皂苷，所述人参总苷中含有5.2-11.4 wt%的稀有皂苷，其中所述稀有皂苷由以下重量份比的物质组成：人参皂苷Rg3 1.7-3.2份、人参皂苷F1 0-1.9份、人参皂苷CK 0.8-1.8份和人参皂苷Rh2 0-2.9份；
所述复合酶和人参的质量比为0.01-0.14:1，所述复合酶中各酶质量相等；
其中，所述复合酶为纤维素酶和选自果胶酶、半纤维素酶和β-葡聚糖酶中任意一种或两种以上的酶。
2.根据权利要求1所述制备工艺，其特征在于，所述通过水煎法提取人参具体为：
取人参药材，加入人参药材重量10-30倍水，提取1-3次、每次1.5-3小时，过滤，合并滤液，得人参提取液；或者取人参药材，粉碎，过60-120目筛，加入药材重量15-30倍水，煎煮1.5-3小时，得人参提取液。
3.根据权利要求1所述制备工艺，其特征在于，所述调节pH值为酸性为调节pH值为4.0-6.5。
4.根据权利要求1所述制备工艺，其特征在于，所述人参浓缩液与人参的液料比为5-15ml:1g。
5.权利要求1-4任意一项所述制备工艺制备的人参酶解物，其特征在于，含有0.69-3.7wt%的人参总皂苷，所述人参总苷中含有5.2-11.4 wt%的稀有皂苷。
6.根据权利要求5所述人参酶解物，其特征在于，所述稀有皂苷由以下重量份比的物质组成：人参皂苷Rg3 1.7-3.2份、人参皂苷F1 0-1.9份、人参皂苷CK 0.8-1.8份和人参皂苷Rh2 0-2.9份。
7.权利要求5或6所述人参酶解物在制备治疗结肠癌药物中的应用，所述治疗结肠癌药物包括所述人参酶解物和5-氟尿嘧啶。
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| 刘发贵.人参稀有皂苷脂肪酸修饰及其生物活性研究.《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生辑》.2012,第2012年卷(第05期),第9页第1、2段，第25页第5段. * |
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