CN106701872B - 酶解α-乳白蛋白多肽、酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束及其制备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及酶解α‑乳白蛋白多肽、酶解α‑乳白蛋白多肽纳米胶束及其制备。本发明以一定纯度的α‑乳白蛋白为原料，在特定的酶存在条件下进行酶解制得较为理想的酶解α‑乳白蛋白多肽；采用该酶解α‑乳白蛋白多肽可制得一种稳定的小粒径酶解α‑乳白蛋白多肽纳米胶束，原料成本低，易获得，且制备工艺简单；而胶束粒径较小，分散性好，生物相容性好，稳定性高；该胶束可以包埋疏水性物质，以该胶束为载体可以制成能够包埋疏水性物质的负载型酶解α‑乳白蛋白多肽纳米胶束，该负载型纳米胶束粒径小、稳定性好、封装效率高且无毒。
Description
技术领域
本发明属于纳米胶束制备技术领域，涉及酶解α-乳白蛋白多肽、酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束及其制备和应用。
背景技术
聚合物胶束是近年来兴起的一种新型纳米药物载体，为两亲性嵌段共聚物溶于水后在疏水、氢键、静电等分子间作用力的推动下自发形成具有疏水性内核与亲水性外壳的一种自组装结构。其具有以下优点：①疏水性内核可对水溶性差的药物起到增溶作用，具有较高的载药量，并对药物实现可控释放。②粒径约为10-200nm，粒径较小且均一，外壳具有亲水性和柔韧性，可大大降低胶束被网状内皮系统(reticuloendothelial system，RES)识别和摄取的机会，体内循环时间长，并可通过高通透性和滞留(enhanced permeabilityand retention，EPR)效应实现被动靶向。③高度的热力学稳定性和动力学稳定性使聚合物胶束不易被破坏，具有很高的耐稀释能力。由于聚合物胶束的诸多优越性，可作为一种良好的难溶性物质输送载体，因此相关研究得到国内外积极重视，所开发的药物主要有抗肿瘤药物、抗炎药物、抗真菌药物、抗肝炎药物以及其他疾病治疗用难溶性药物等。Jie Wang等人(Jie Wang,Guang Yang,Xing Guo,Zhaomin Tang,et al.Redox-responsivepolyanhydride micelles for cancer therapy.Biomaterials 2014；35:3080-3090)，将单体和姜黄素溶解到THF中，并逐滴滴加到去离子水中，滴加过程中溶液需不断搅拌。但是，该方法所制备的载体有一定的毒性，所制备的胶束粒径较大，而且制备过程较为复杂。
因此，目前存在的问题是需要研究开发一种制备过程简单，且所制备的胶体粒径较小，毒性较低的载体。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种酶解α-乳白蛋白多肽、酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束及其制备和应用。本发明方法制备工艺简单，所制得的酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束粒径较小，分散性好，生物相容性好，稳定性高；可包埋疏水性物质，封装效率高。
为此，本发明第一方面提供了一种酶解α-乳白蛋白多肽，其为两亲性酶解α-乳白蛋白多肽，且分子量为9.9-11KDa。
根据本发明，所述酶解α-乳白蛋白多肽是由α-乳白蛋白溶液在酶存在条件下进行酶解获得的，所述酶为地衣芽孢杆菌蛋白酶，酶切位点为谷氨酸和天冬氨酸的羧基端。
在本发明的一些实施例中，所述α-乳白蛋白的纯度≥60％(质量)。优选所述α-乳白蛋白的纯度为60％-80％(质量)。
本发明第二方面提供了一种酶解α-乳白蛋白多肽的制备方法，其包括酶解的步骤：向α-乳白蛋白液中加入酶液，混合均匀后，进行酶解反应，酶解反应结束后离心处理，并将上清液冷冻干燥，制得酶解α-乳白蛋白多肽，其中，所述α-乳白蛋白液的浓度为20-40g/L。优选所述α-乳白蛋白液的浓度为25-30g/L。所述酶液与α-乳白蛋白的质量比为1:(20-30)。优选所述酶液与α-乳白蛋白的质量比为1:(20-25)。所述酶液的浓度为80-120mg/mL。优选所述酶液的浓度为90-100mg/mL
在本发明的一些实施例中，所述酶解反应的温度为45-55℃。优选所述酶解反应的温度为45-50℃。
在本发明的另一些实施例中，所述酶解反应的时间为15-30min。优选所述酶解反应的时间为17-20min。
本发明第三方面提供了一种酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束，其由本发明第一方面所述的酶解α-乳白蛋白多肽或由本发明第二方面所述的方法制备的酶解α-乳白蛋白多肽溶于水制得，所述酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的临界胶束浓度为0.75μg/mL。
根据本发明，所述酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的粒径为15-25nm。优选所述酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的粒径为15-20nm。所述酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的最大粒径与最小粒径之差≤10nm。
本发明第四方面提供了一种负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束，其包括酶解α-乳白蛋白胶束及其所包埋的疏水性物质颗粒，并且疏水性物质与酶解α-乳白蛋白多肽的质量比为(0.89-2.25):5。
本发明第五方面提供了一种负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的制备方法，其包括：
步骤A，将疏水性物质溶液与上述酶解α-乳白蛋白多肽或上述方法制备的酶解α-乳白蛋白多肽溶液混合，搅拌均匀后，制成负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束基液；
步骤B，负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束基液反应后，制得负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束；
其中，负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束基液中，疏水性物质与酶解α-乳白蛋白多肽的质量比为(1-3):5。
在本发明的一些实施例中，在步骤A中，所述疏水性物质溶液由疏水性物质与有机溶剂配制而成，并且疏水性物质溶液的浓度为1-3mg/mL。
在本发明的另一些实施例中，在步骤A中，所述酶解α-乳白蛋白多肽溶液由酶解α-乳白蛋白多肽与pH 7-7.5的Tirs-HCl缓冲液配制而成，并且酶解α-乳白蛋白多肽溶液的浓度为1-2mg/mL。
在本发明的又一些实施例中，在步骤A中，所述疏水性物质溶液与酶解α-乳白蛋白多肽溶液的体积比为1:(5-6)。优选所述疏水性物质溶液与酶解α-乳白蛋白多肽溶液的体积比为1:5。
在本发明的一些实施例中，在步骤B中，所述反应的时间为30-60min。优选所述反应的时间为30-40min。
本发明第六方面提供了一种分离提纯α-乳白蛋白的方法，其包括：
步骤S1，将乳清分离蛋白(WPI)溶于水中制得乳清分离蛋白液Ⅰ，将乳清分离蛋白液Ⅰ的pH调节至5.2，再离心处理除去β-乳球蛋白[等电点(pI)5.2]，取上清液作为乳清分离蛋白液Ⅱ；
步骤S2，将乳清分离蛋白液Ⅱ的pH调节至4.75，离心处理除去乳清蛋白聚集物[(whey protein aggregates)pI～4.8]，取上清液冷冻干燥，制得较纯的α-乳白蛋白。
在步骤S1和S2中，优选所述离心的温度为4℃；优选所述离心的速度为10000r/min，优选所述离心的时间为2h。
本发明第七方面提供了一种酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的应用，包括将酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束作为疏水性物质的载体，提高其生物利用度。
附图说明
下面将结合附图来说明本发明。
图1为实施例2中的酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的透射电镜图片。
图2为实施例4中包埋了疏水性物质的负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束与疏水性物质溶液的对比图；图中附图标记的含义：1包埋了疏水性物质β-胡萝卜素的负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的水溶液；2疏水性物质β-胡萝卜素水溶液。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。
如前所述，现有的负载型胶束制备过程较为复杂，所制成的胶束粒径较大，且载体有一定的毒性。
为克服上述问题，本发明的发明人对聚合物负载型胶束进行了大量的研究，本发明的发明人研究发现，以一定纯度的α-乳白蛋白(α-lactalbumin)为原料，在特定的酶存在条件下进行酶解可以制得较为理想的酶解α-乳白蛋白多肽；采用该酶解α-乳白蛋白多肽可以制得一种稳定的小粒径纳米胶束；以该胶束为载体可以制成能够包埋疏水性物质的负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束，该负载型纳米胶束粒径小、稳定性好且无毒。
因此，本发明涉及一种酶解α-乳白蛋白多肽。所述酶解乳白蛋白多肽实际上为两亲性的，其由α-乳白蛋白溶液在酶存在条件下进行酶解制得，分子量为9.9-11KDa。基于此，本发明的酶解α-乳白蛋白多肽也可称为酶解α-乳白蛋白多肽。
在本发明的一些实施例中，例如，所述酶可以为地衣芽孢杆菌蛋白酶，且酶切位点为谷氨酸和天冬氨酸的羧基端。
在本发明的另一些实施例中，所述α-乳白蛋白的纯度≥60％(质量)。优选所述α-乳白蛋白的纯度为60％-80％(质量)。
本发明的发明人对α-乳白蛋白的纯度与酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的制备过程进行了考察，发现当α-乳白蛋白的纯度小于60％(质量)时，酶解过程出现沉淀。
在本发明的一些实施方式中，例如，优选根据乳清分离蛋白(whey proteinisolation，WPI)中各成分的等电点不同，利用等电点沉淀法来分离提纯α-乳白蛋白，具体方法包括：
步骤S1，将乳清分离蛋白溶于水中制得乳清分离蛋白液Ⅰ，使用HCl将乳清分离蛋白液Ⅰ的pH调节至5.2，再离心处理除去β-乳球蛋白[等电点(pI)5.2]，取上清液作为乳清分离蛋白液Ⅱ；
步骤S2，将乳清分离蛋白液Ⅱ的pH调节至4.75，离心处理除去乳清蛋白聚集物(pI～4.8)，取上清液冷冻干燥，制得α-乳白蛋白；
在步骤S1和S2中，优选所述离心的温度为4℃；优选所述离心的速度为10000r/min；优选所述离心的时间为2h。
在本发明的一个实施例中，利用等电点沉淀法来分离提纯α-乳白蛋白。称取5gWPI，缓慢加入50mL蒸馏水中(磁力搅拌器500rpm)。然后稀释浓HCl用于调节pH。先用pH计调节pH至5.2，然后离心处理(4℃、10000r/min、2h)除去β-乳球蛋白(β-lactolglobulin)(pI5.2)，接着取上清液于烧杯中，再调节pH至4.75，同样离心条件下除去乳清蛋白聚集物(pI～4.8)，然后取上清液进行真空冷冻干燥，即得到提纯后的α-乳白蛋白。
本发明所述用语乳清蛋白聚集物(whey protein aggregates)是指除α-乳白蛋白和β-乳球蛋白以外的其它小分子蛋白。
本发明所述用语“pI～4.8”是指等电点(pI)在4.8左右，包括4.8。
在本发明的一些实施方式中，本发明采用酶解α-乳白蛋白的方法制备酶解α-乳白蛋白多肽，其包括：
制备α-乳白蛋白液的步骤：将α-乳白蛋白溶于水中，混合均匀后制得浓度为20-40mg/mL，优选浓度为25-30mg/mL，进一步优选浓度为30mg/mL的α-乳白蛋白液；
制备酶液的步骤：将粗酶液在4℃条件下，以5000r/min的转速离心处理30min后，上清液用0.22μm的微滤膜过滤，制得浓度为80-120mg/mL，优选浓度为90-100mg/mL，进一步优选浓度为100mg/mL的酶液；
酶解的步骤：按照酶液与α-乳白蛋白液的质量比为1:(20-30)，优选1:25的量向α-乳白蛋白液中加入酶液，漩涡混合均匀后，在45-55℃，优选45-50℃，进一步优选50℃条件下进行酶解反应15-30min，优选17-20min，进一步优选17min，酶解反应结束后以10000r/min的转速离心处理5min，并将上清液冷冻干燥，制得酶解α-乳白蛋白多肽。
本发明中，所述酶解过程中的缓冲液为0.075mol/L、pH 7.5Tris-HCl缓冲液。
本发明的发明人研究发现，采用上述方法和反应条件可以较好的控制酶切位点，例如，将酶切位点完全控制在谷氨酸和天冬氨酸的羧基端，从而制得分子量合适的量亲性的酶解α-乳白蛋白多肽。该分子量合适的两亲性的酶解α-乳白蛋白多肽可以制得一种稳定的小粒径纳米胶束；以该胶束为载体可以制成能够包埋疏水性物质的负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束，该负载型纳米胶束粒径小、稳定性好且无毒。
在一个优选的实施例中，例如，可以按照以下步骤制备酶解α-乳白蛋白多肽：
步骤(1)，称取纯化后的α-乳白蛋白6mg溶于200μL超纯水中，制得浓度为30mg/mL的α-乳白蛋白液；
步骤(2)，将粗酶液离心处理(4℃，5000r/min，30min)，然后用移液枪吸取上清酶液于离心管中，再用注射器吸取酶液过0.22μm滤膜，即得到浓度为100mg/mL的酶液；
步骤(3)，吸取2.4μL步骤(2)制得的酶液加入步骤于(1)制得的α-乳白蛋白液中，然后涡旋混合30s，接着50℃水浴中反应17min，10000r/min离心处理5min，然后取上清液真空冷冻干燥，即制得酶解α-乳白蛋白多肽。
本发明还涉及一种酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束，其由上酶解α-乳白蛋白多肽或上述方法制备的酶解α-乳白蛋白多肽溶于水制得，所述酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的临界胶束浓度为0.75μg/mL。
在本发明的一些实施例中，所述酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的粒径为15-25nm；优选所述酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的粒径为15-20nm；进一步优选所述酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的粒径为20nm；且所述酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的最大粒径与最小粒径之差≤10nm。
本发明中所用“水”一词，在没有特别指定的情况下，是指去离子水。
本发明还进一步涉及一种酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的应用，包括将酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束作为疏水性物质的载体，提高其生物利用度。
本发明另外还涉及一种负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束，其包括酶解α-乳白蛋白胶束及其所包埋的疏水性物质颗粒，所述酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束通过疏水作用将疏水性物质包埋在其疏水内核，并且疏水性物质与酶解α-乳白蛋白多肽的质量比为(0.89-2.25):5。
在本发明的一些实施例中，所述疏水性物质为疏水性色素或疏水性药物。所述疏水性色素包括β-胡萝卜素、虾青素和番茄红素中的至少一种。所述疏水性药物包括姜黄素、阿霉素和紫杉醇中的至少一种。
本发明另外还进一步涉及一种负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的制备方法，其包括：
步骤A，将疏水性物质溶液与上述酶解α-乳白蛋白多肽或上述方法制备的酶解α-乳白蛋白多肽溶液混合，搅拌均匀后，制成负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束基液；
步骤B，负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束基液在常温下，反应30-60min，优选反应30-40min，进一步优选反应30min后，制得负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束；
其中，负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束基液中，疏水性物质与酶解α-乳白蛋白多肽的质量比为(1-3):5。
在本发明的一个实施例中，所述疏水性物质溶液由疏水性物质与有机溶剂配制而成，并且疏水性物质溶液的浓度为1-3mg/mL。
本发明中，所述有机溶剂为亲水性醇，其选自甲醇、乙醇和丙醇中的至少一种。优选有机溶剂为乙醇。
在本发明的另一个实施例中，所述酶解α-乳白蛋白多肽溶液由酶解α-乳白蛋白多肽纳米材料与pH为7-7.5，优选pH为7.5的Tirs-HCl缓冲液配制而成，并且酶解α-乳白蛋白多肽溶液的浓度为1-3mg/mL。优选酶解α-乳白蛋白多肽溶液的浓度为1-2mg/mL。进一步优选酶解α-乳白蛋白多肽溶液的浓度为1mg/mL。
在本发明的一个具体实施例中，将酶解α-乳白蛋白多肽纳米材料与pH 7.5 Tirs-HCl缓冲液混合，在20rmp下旋转混合30min，制得酶解乳白蛋白多肽溶液。
本发明中，所述负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束基液，既可以按照疏水性物质与酶解α-乳白蛋白多肽的质量比为(1-3):5的量将疏水性物质溶液与酶解α-乳白蛋白多肽溶液混合，搅拌均匀后制得；也可以采用浓度为1-3mg/mL的疏水性物质溶液与浓度为1mg/mL的酶解α-乳白蛋白多肽溶液，并按照疏水性物质溶液与酶解α-乳白蛋白多肽溶液的体积比为1:(5-6)，优选1:5的量将疏水性物质溶液与酶解α-乳白蛋白多肽溶液混合，搅拌均匀后制得。
在本发明的一个具体实施例中，负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束：将疏水性物质溶于无水乙醇1mL中，多肽溶于5mL pH 7.5Tris-HCl缓冲液中，将疏水物质和多肽溶液混合，搅拌均匀；其中疏水性物质的用量为1-3mg，多肽的用量为5mg；室温下反应30-60min，即得分散性较好的包埋疏水性物质的酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束。
本发明中的测定方法包括：
(1)酶解α-乳白蛋白多肽的分子量的测定
本发明中，采用质谱(Q-TOF 2,Micromass)测量酶解α-乳白蛋白多肽的分子量，使用Masslynx software version 3.3处理数据。
(2)酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束粒径的测定
本发明中，采用激光粒度仪(Zetasizer Nano ZS，英国马尔文仪器有限公司)测定酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的粒径。
(3)酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的形态观察
本发明中，采用透射电子显微镜(JEM-1400，日本电子)观察酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的形态。
(4)酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的临界胶束浓度的检测
本发明中，采用多功能酶标仪(Infinite M200，Tecan)测定包埋在酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束中荧光染料的荧光强度，并由此判断临界胶束浓度。
本发明以一定纯度的α-乳白蛋白为原料，在特定的酶存在条件下进行酶解制得较为理想的酶解α-乳白蛋白多肽；采用该酶解α-乳白蛋白多肽制得一种稳定的小粒径纳米胶束，原料成本低，易获得，可以有效降低成本；制备工艺简单；胶束粒径较小，分散性好，生物相容性好，稳定性高；该胶束可以包埋疏水性物质，以该胶束为载体可以制成能够包埋疏水性物质的负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束，该负载型纳米胶束粒径小、稳定性好、封装效率高且无毒。
实施例
下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例1：制备酶解α-乳白蛋白多肽。
1)准确称取α-乳白蛋白6mg于1.5mL离心管中，加入200μL pH＝7.5，75mM Tris-HCl缓冲液，溶解后，加入1.2μL蛋白水解酶；
2)用2mL注射器吸取溶液，于0.2μm聚醚砜针头式过滤器过滤溶液一次；
3)50℃水浴加热17min，离心后取上清液；
4)将上清液冻干，得到酶解后的多肽。
经检测，酶解α-乳白蛋白多肽的分子量为9.9-11KDa。
实施例2：制备酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束。
1)准确称取多肽5mg溶于5mL pH＝7.5，75mM Tris-HCl缓冲液中；
2)旋转混合30min，转速为20rmp，即可得到空白多肽纳米胶束。
用透射电镜观察这些空白多肽纳米胶束，结果如图1所示。从图1可以看出本发明的酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束粒径较小，20nm左右，分散性好。
实施例3：制备负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束。
1)取β-胡萝卜素溶于无水乙醇中，使β-胡萝卜素浓度为1.0mg/mL；
2)准确称取多肽5mg溶于5mL pH＝7.5，75mM Tris-HCl缓冲液中，迅速加入1mL的β-胡萝卜素/无水乙醇溶液，旋转混合30min，用0.22μm的聚醚砜过滤器过滤，除去未包埋的β-胡萝卜素，即可得到封装β-胡萝卜素的载药胶束；多肽纳米胶束对β-胡萝卜素的包埋率为88.6％，载药量为15.05％(质量)。
实施例4：制备负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束。
1)取β-胡萝卜素溶于无水乙醇中，使β-胡萝卜素浓度为2.0mg/mL；
2)准确称取多肽5mg溶于5mL pH＝7.5，75mM Tris-HCl缓冲液中，迅速加入1mL的β-胡萝卜素/无水乙醇溶液，旋转混合30min，用0.22μm的聚醚砜过滤器过滤，除去未包埋的β-胡萝卜素，即可得到封装β-胡萝卜素的载药胶束；多肽纳米胶束对β-胡萝卜素的包埋率为78.7％，载药量为23.94％(质量)。
将包埋了疏水性物质的负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束与疏水性物质溶液进行对比，结果如图2所示。
从图2可以看出，β-胡萝卜素经由酶解乳白蛋白多肽纳米胶束包埋后形成包埋了β-胡萝卜素的负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束，可以较好的溶于水溶剂体系；而经酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束包埋的β-胡萝卜素水溶剂体系中出现不溶性颗粒，不能很好地形成分散体系；由此证明本发明制得的酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束可以提高β-胡萝卜素的溶解度。
实施例5：制备负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束。
1)取姜黄素溶于无水乙醇中，使姜黄素浓度为2.0mg/mL；
2)准确称取多肽5mg溶于5mL pH＝7.5，75mM Tris-HCl缓冲液中，迅速加入1mL姜黄素/无水乙醇溶液，旋转混合30min，用0.22μm的聚醚砜过滤器过滤，除去未包埋的姜黄素，即可得到封装姜黄素的载药胶束；多肽纳米胶束对姜黄素的包埋率为92.73％，载药量为27.06％(质量)。
实施例6：制备负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束。
1)取姜黄素溶于无水乙醇中，使姜黄素浓度为3.0mg/mL；
2)准确称取多肽5mg溶于5mL pH＝7.5，75mM Tris-HCl缓冲液中，迅速加入1mL姜黄素/无水乙醇溶液，旋转混合30min，用0.22μm的聚醚砜过滤器过滤，除去未包埋的姜黄素，即可得到封装姜黄素的载药胶束；多肽纳米胶束对姜黄素的包埋率为75.0％，载药量为31.03％(质量)。
上述实施例2-6中的酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的分析结果表明，本发明所制备的酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的平均粒径为20nm左右，分散性好。另外，疏水性物质经由酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束包埋后可以大幅度提高溶解度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (14)
1.一种酶解α-乳白蛋白多肽的制备方法，其包括酶解的步骤：向α-乳白蛋白溶液中加入酶液，混合均匀后，进行酶解反应，酶解反应结束后离心处理，并将上清液冷冻干燥，制得酶解α-乳白蛋白多肽，其中，所述酶为地衣芽孢杆菌蛋白酶，酶切位点为谷氨酸和天冬氨酸的羧基端，所述α-乳白蛋白液的浓度为20-40g/L；所述酶液与α-乳白蛋白的质量比为1:(20-30)；所述酶液的浓度为80-120mg/mL；所述酶解反应的时间为15-30min；所述酶解α-乳白蛋白多肽为两亲性酶解α-乳白蛋白多肽，且分子量为9.9-11KDa；所述α-乳白蛋白的纯度≥60％(质量)。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述α-乳白蛋白液的浓度为25-30g/L；所述酶液与α-乳白蛋白的质量比为1:(20-25)；所述酶液的浓度为90-100mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述酶解反应的温度为45-55℃。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述酶解反应的温度为45-50℃。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述酶解反应的时间为17-20min。
6.一种酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束，其由权利要求1-5中任意一项所述的方法制备的酶解α-乳白蛋白多肽溶于水制得，所述酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的临界胶束浓度为0.75μg/mL。
7.根据权利要求6所述的纳米胶束，其特征在于，所述酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的粒径为15-25nm；所述酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的最大粒径与最小粒径之差≤10nm。
8.根据权利要求6或7所述的纳米胶束，其特征在于，所述酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的粒径为15-20nm。
9.一种负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束，其包括权利要求6-8中任意一项所述的酶解α-乳白蛋白胶束及其所包埋的疏水性物质颗粒，并且疏水性物质与酶解α-乳白蛋白多肽的质量比为(0.89-2.25):5。
10.一种负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束的制备方法，其包括：
步骤A，将疏水性物质溶液与权利要求1-5中任意一项所述的方法制备的酶解α-乳白蛋白多肽溶液混合，搅拌均匀后，制成负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束基液；
步骤B，负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束基液反应后，制得负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束；
其中，在负载型酶解α-乳白蛋白多肽纳米胶束基液中，疏水性物质与酶解α-乳白蛋白多肽的质量比为(1-3):5。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于：
在步骤A中，所述疏水性物质溶液由疏水性物质与有机溶剂配制而成，并且疏水性物质溶液的浓度为1-3mg/mL；
在步骤A中，所述酶解α-乳白蛋白多肽溶液由酶解α-乳白蛋白多肽与pH7-7.5的Tirs-HCl缓冲液配制而成，并且酶解α-乳白蛋白多肽溶液的浓度为1-3mg/mL；在步骤A中，所述疏水性物质溶液与酶解α-乳白蛋白多肽溶液的体积比为1:(5-6)。
12.根据权利要11所述的制备方法，其特征在于，在步骤A中，所述酶解α-乳白蛋白多肽溶液的浓度为1-2mg/mL。
13.根据权利要求10-12中任意一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤B中，所述反应的时间为30-60min。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，在步骤B中，所述反应时间为30-40min。
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