CN106699898B - 一种可以增大电子传递的融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可以增大电子传递的融合蛋白及其应用。本发明中发现的蛋白信息如下：由序列表中序列2的氨基酸序列组成的蛋白质，该蛋白含有铁硫簇，参与电子的传递并传至固氮酶形成H₂。实验表明在野生型鱼腥藻7120中表达本发现的蛋白时，转基因藻株能够增大H₂的生成。该蛋白的表达所用的启动子受铜离子浓度调控，当过表达株处在缺铜培养基中，H₂的积累量与野生株相同。该蛋白在藻株中表达可使糖原的积累量增大，提高藻体生物量的积累。

Description

一种可以增大电子传递的融合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种可以增大电子传递的融合蛋白与其应用。

背景技术

由于化石燃料日益枯竭并且燃烧后造成环境污染，所以寻找清洁能源是解决问题的关键。氢能是所有的能源中能量密度最大的能量源，且燃烧后形成水，不会污染环境。特别是在当今环境问题已经严重影响人们的生活情况下，发展可再生和环境友好性能源是解决经济发展瓶颈的关键要素之一。在生产氢的过程中，利用生物产氢是不占用耕地、不消耗粮食，藻类生物利用无机物合成有机物并可以生产氢气，被认为是最具吸引力的获得氢气的方式之一。但是，其中需要解决的关键问题是有效提高藻类产H₂量。其中，鱼腥藻7120(Anabaena sp.PCC7120)是丝状蓝藻，是广泛用于光合作用与产H₂的重要模式藻种。因此，研究鱼腥藻7120产氢过程中的相关问题，能够更好的获得更多的H₂，也为其他生物的产氢提高提供理论基础。

近年来，人们将基因工程在藻类中应用来提高H₂量，在此过程中基因元件是重要的基础。开发具有能够提高藻类产H₂能力的新蛋白，不仅可以为工程藻株的设计提供可利用的基因元件，也可以对发展提高藻类产H₂的新方法提供依据，并对促进藻类能源资源的可持续发展有重要价值。

固氮酶将氢质子和电子生成H₂，但是由于固氮酶是以复合体形式存在，调控其酶的表达量是很难做到的，所以产氢阶段如何改变细胞中电子的流向，使之更多的流向固氮酶获得更高的H₂产量是藻类产氢研究的重中之重，目前大量研究多集中在胞内电子传递链阻断和产氢环境的研究上(比如加入电子传递抑制剂、删除非目的电子传递链上关键基因或利用缺硫培养环境等等)。但是，产氢过程中的关键酶是固氮酶，本发明拟对固氮酶及其所涉及的电子传递路径做相关修饰以便提高H₂的产量。

发明内容

本发明发现将鱼腥藻7120的Fd蛋白与nifH蛋白连接形成融合蛋白(FNET1蛋白)，能够显著生产更多的H₂。不囿于任何理论的，发明人推测FNET1蛋白可以做为电子传递的元件在细胞中行使功能，传递电子至固氮酶反应中心，能够与固氮酶其余亚基形成新的复合体，消耗电子和质子生成氢气，所以FNET1蛋白能够在具有固氮酶的宿主中传递电子后生成H₂的作用。

本发明的目的是提供一种增大电子传递的融合蛋白及其应用。

本发明所涉及的蛋白命名为FNET1，其氨基酸序列为SEQ ID No:2所示，含有铁硫簇。此蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因再进行生物表达得到。因此，编码所述蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为核苷酸序列如SEQ ID No:1所示的DNA分子。

具体地，该DNA分子由1191个核苷酸组成，第1至1191位为ORF，编码氨基酸如SEQID No:2所示的FNET1蛋白。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的载体构建。所述生物转运载体包括运载质粒，如pRL271、pRL277等或其它衍生载体(Javier et al.Role of a Microcin-C-likebiosynthetic gene cluster in allelopathic interactions in marineSynechococcus，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2013；Jeffet al.Reduction of conjugaltransfer efficiency by three restriction activities ofAnabaena sp.strain PCC7120，J.Bacteriol.，1997)。使用所述基因构建重组载体时，在其转录起始核苷酸前加上一种增强型、组成型、组织特异性或诱导性启动子，例如铜离子启动子PpetE，光诱导启动子PpsbAII等等。此外，使用本发明的基因构建重组载体时，启动子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组载体进行加工，加入具有抗抗生素的基因等，以便获得转化株。

本发明中，所述重组载体中启动所述fnet1基因转录的启动子为铜离子诱导型启动子PpetE(在本文中有时也简写为启动子P，例如在质粒图1中)。

更为具体的，所述构建重组载体的起始载体是pRL271，最终的运载质粒是fnet1-pRL271。在本发明的一个实施例中，所述的重组克隆方法是SLIC。

所述表达盒有能够启动所述fnet1基因表达的启动子，所述fnet1基因，以及转录终止序列组成。

所述FNET1蛋白，或所述核酸分子fnet1，或所述重组载体、表达盒或重组菌任一的应用也属于本发明的保护范围：

(a1)调控鱼腥藻7120的产氢量；

(a2)电子传递链的重新构建；

(a3)选育产氢量提高的鱼腥藻7120种株。

在本发明中，所述调控鱼腥藻7120的产氢量具体体现在：在所述鱼腥藻7120体内，若fnet1转录表达，则所述转基因藻株的产氢量会被提高。

在上述获得的阳性转基因藻株中，将携带有fnet1基因(FNET1的编码基因)的重组载体导入所述目的藻中，具体可为：通过三亲结合转化方法转化鱼腥藻7120(Anabaenasp.PCC7120)细胞，从而获得鱼腥藻7120的FNET1过表达藻株。

本发明的另一个目的是提供一种电子传递链修改的方法。因为FNET1蛋白含有铁硫簇，为电子载体，可以传递电子。电子从光系统I被FNET1接收后直接传递至固氮酶反应中心。

本发明所提供的修改电子传递链的方法，包括如下步骤：

a)将本发明所述的FNET1蛋白的编码基因导入鱼腥藻7120中获得到转基因鱼腥藻7120藻株，并将其置于适合所述编码基因转录、表达的条件下；和

b)从步骤a)所得转基因藻株中选出与野生型鱼腥藻7120藻株相比产氢量提高的转基因阳性藻株。

在此基础上，可通过如下步骤验证转基因藻株的产氢量是由于FNET1蛋白的作用所引起：

c)将步骤b)获得的阳性转基因鱼腥藻7120藻株和野生型同时放置于缺铜培养基中培养；和

d)当所述藻株生长至对数期，光厌氧条件下测定H₂产量。

如野生型与转基因藻株的产氢量相当，则证明转基因藻株的产氢量是由于FNET1蛋白的作用所引起的。

上述获得的阳性转基因藻株中，其细胞内的电子传递链是被修改的，FNET1可以接受PSI的电子直接传递到反应中心生成H₂。

所述FNET1蛋白的编码基因具体可通过含有所述FNET1蛋白的编码基因的重组载体导入所述目的鱼腥藻中或整合至基因组上，并且所述FNET1蛋白的转录启动是受铜离子诱导，所以在有铜离子的环境中，转基因株氢气的产量是高于野生株。当所述转基因株放置于缺铜培养基中培养时，启动子是不工作的，所以在缺少铜离子的培养环境中，FNET1蛋白不被表达，产H₂总积累量与野生型相当，从而说明提高H₂的产量是FNET1的作用。

附图说明

图1为pPT27质粒示意图。

图2为fnet1-pPT27质粒构建示意图，箭头方向代表着基因的转录方向。

图3为SLIC克隆方法构建pPT27运载质粒的流程示意图。

图4为野生株和转基因藻株的产氢积累量图。其中wt代表野生型鱼腥藻7120；FNET1代表转基因株。

图5为野生株和转基因藻株培养在缺铜环境中光诱导条件下，测定的产氢积累量。

图6a和6b分别为野生株和转基因藻株在诱导产H₂阶段，反应中心亚基nifD和nifK的转录量变化。

具体实施方式

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

鱼腥藻7120(Anabaena sp.PCC 7120，简称野生型藻株或wt株)，从中科院水生所购得。

三亲结合转化的初始质粒RP4或pIncP、pRL623、pRL271由Wolk教授提供。

下述实施例中所用的培养基：

(1)BGII₀培养基：NaCl 1.03g/L，K₂HPO₄0.04 g/L，MgSO₄0.075 g/L，CaCl₂·2H₂O0.036g/L，柠檬酸0.006g/L，柠檬酸铁0.006g/L，Na₂EDTA0.001 g/L，Na2CO30.02 g/L，A₅液(A₅液:H₃BO₃2.86 g/L，MnCl₂·4H₂O 1.81g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.222g/L，Na₂MoO₄·H₂O 0.39g/L，CuSO4·5H₂O 0.079g/L，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.0494g/L)1mL,pH为8.0。

(2)固体BGII₀培养基：在BGII₀培养基中加入1.5％的琼脂粉。

(3)缺铜BGII₀培养基：NaCl 1.03g/L，K₂HPO₄0.04 g/L，MgSO₄0.075 g/L，CaCl₂·2H₂O 0.036g/L，柠檬酸0.006g/L，柠檬酸铁0.006g/L，Na₂EDTA0.001 g/L，Na2CO30.02 g/L，A₅液(A₅液:H₃BO₃2.86 g/L，MnCl₂·4H₂O 1.81g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.222g/L，Na₂MoO₄·H₂O0.39g/L，FeSO4·7H₂O 0.088g/L，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.0494g/L)1mL,pH为8.0。

下述实施例中，关于作为实验材料的鱼腥藻7120的培养具体如下：配制培养基溶液，121℃高温灭菌20min。待培养基温度降至室温后再使用，用接种针从固体培养基上挑取单克隆至液体培养基中光照培养，培养温度是30度。固体培养时，将单克隆转到固体培养基上划线培养。

实施例一鱼腥藻7120 FNET1基因的获得

1.鱼腥藻7120总DNA提取

100mg材料，加入1mL预热CTAB提取液(100mmol/LTris，100mmol/L EDTA，1.4mol/LNaCI，2％CTAB)，使用前加入2％β巯基乙醇和0.1ml玻璃珠用震荡器破碎，随后65℃水浴lh，其间每隔5min振荡混匀。加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)混合振荡20min，10000rpm离心10min，取上清，加入0.35倍体积的无水乙醇和0.2体积的5mol/L的KAc混匀，离心后取上清加入半体积异丙醇，-20℃冷冻30min，10000rpm离心10min，吹干后加入400μMNaCl和1.5μl RNase，37℃水浴30min消解RNA。加入预冷的无水乙醇沉淀，-20℃静置10min后离心，沉淀用70％酒精洗涤，晾干后溶于200μl TE中。

2.FNET1基因序列的扩增

以步骤一提取的总DNA为模板，分别使用片段一上下游引物和片段二上下游引物进行PCR反应。反应程序：98℃预变性5分钟；98℃变形10s，60℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。引物由生工生物工程股份有限公司合成，序列如下:

片段一上游引物：

CAGGTTAGGAGAACGCCGTCGACATGGCTAGCTACCAAGTTAG(SEQ ID No:9)

片段一下游引物：

CTAATGTTTTCGTCAGTCATGGTACCAGCAAGGTACGGTTCTTG(SEQ ID No:10)

片段二上游引物：

GGTACCATGACTGACGAAAACATTAG(SEQ ID No:11)

片段二下游引物：

CCAATATTTTAATGATTTCAAGTCTAGACTATTTGGTAGCTTCTGCGG(SEQ ID No:12)

将通过上述PCR得到的片段一和片段二利用融合PCR的方法(将上述片段一和片段二在95度变性30秒，再迅速降低至55度15秒，72度延伸1分45秒，并做30个循环回收)连接为一个片段，即fnet1，并连接至T载体上进行序列测序实验，测序结果为SEQ ID No：1。

实施例二转基因藻株的获得

1.通用运载质粒的构建

使用以下步骤构建通用运载质粒pPT27：

A.使用限制性内切酶XhoI酶切含有蔗糖致死基因的载体质粒pRL271，使其线性化并回收片段；

B.从鱼腥藻7120基因组DNA扩增同源重组双交换上游片段(SEQ ID No:5)、下游片段(SEQ ID No:6)和诱导型启动子P(SEQ ID No:7)，从质粒kan-pUC19中扩增筛选抗性基因kan(SEQ ID No:8)；

C.将步骤B获得的同源重组双交换片段上游片段、下游片段、诱导型启动子P和筛选抗性基因kan及线性pRL271连接获得pPT27质粒(SEQ ID No:3，见图1)。

2.穿梭质粒的构建

使用前述构建的通用运载质粒pPT27，利用SLIC的方法获得最后的穿梭运载质粒fnet1-pPT27(SEQ ID No:4，见图2和图3)。

3.转基因藻株的获得

使用先前文献记载的方法，将前述获得的穿梭运载质粒fnet1-pPT27以及帮助质粒pRL623和结合质粒pIncP与野生型鱼腥藻7120共培养，2～3周获得转化子，之后液体扩培。

4.验证整合情况

利用以下引物对：

上游引物：

GCAGAAATTCGATATCTAGATCTCGAGTCTTCCTGTAAACGGTATGG(SEQ ID No:13)下游引物：

GGCGGACGGGAAGTATCCAGCTCGAGGTATGAGACTTATGACAAACCC(SEQ ID No:14)通过PCR扩增检测藻株的整合情况。当转化子所扩增的片段大于野生型扩增片段时，说明整合成功。然后提取野生株和转基因株的总蛋白，使用NifH抗体鉴定蛋白的表达情况以再次确认。

实施例三藻株产氢量的检测

以实施例2获得的FNET1转基因藻和野生型分别在BGII₀培养基和缺铜BGII₀培养基上培养，测定各藻株和在各条件下的产氢量和叶绿素含量(测定方法请参见Improvingconversion efficiency of solar energy to electricity in cyanobacterial PEMFCby high levels of photo-H 2 production，International Journal of HydrogenEnergy，2013)。

结果显示，FNET1蛋白的表达可以显著提高H₂的产量，H₂的产量被提升了3.9倍(图3)。由于FNET1含有铁硫簇，可以转移电子，将电子直接转移至固氮酶反应中心，进而修改电子传递链。当野生型和转基因藻株培养在缺铜培养基生长至对数期，在光厌氧条件下测定产氢积累量，结果揭示野生株和转基因藻株产氢总量相同(图4)。这说明FNET1蛋白在鱼腥藻7120产氢过程中起着重要的角色。在产氢阶段，检测固氮酶反应中心亚基的转录量可以反映出潜在产氢能力的变化，通过实验证明在转基因藻株中nifD和nifK的转录量是增大的(图5)。

分析产氢提高的原因，由于FNET1含有铁硫簇，并且会接收来自光合系统I传递的电子，所以修改了胞内的电子传递量。在产氢过程中，分析野生型和转基因株中固氮酶核心亚基nifD/nifK的转录量变化时发现，在转基因藻株中，二个基因的转录是被提高的。

实施例四藻株中糖原的含量

当藻株生长OD₇₅₀至0.5、0.85、1.1时收集细胞，加入5％H₂SO₄沸水浴处理30min。10000rpm离心后，过滤除杂质，HPLC测定葡萄糖含量。这一过程中需要测定叶绿素含量。

结果显示，表达FNET1蛋白的转基因株中含有的糖原的量要高于野生株。nifH的调节是受光照影响，而fnet1序列也含有这一受调控的功能域。在藻丝体生长阶段，并至OD₇₅₀约为0.85时，nifH的转录量是所受影响的是有限，而Fd的转录量是增大的，说明增大了流向碳循环的电子，使糖原的含量增加(表1)。这说明FNET1蛋白在整个电子传递链中起着不可忽视的作用，无论是光发酵产氢阶段或是藻体生长阶段。

表1.野生株和转基因藻株在生长阶段的糖原含量变化

SEQUENCE LISTING

<110> 清华大学

<120> 一种可以增大电子传递的融合蛋白及其应用

<130> 20161213-2

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1191

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggctagct accaagttag attgatcaac aagaaacaag acatcgatac taccatcgag 60

attgatgaag aaaccacaat tttagatggc gcagaagaaa atggtattga attacctttc 120

tcttgccatt ctggttcttg ttctagctgt gtaggcaaag ttgttgaagg tgaagttgac 180

caatctgatc aaatcttctt agatgatgaa cagatgggta aaggcttcgc tctactttgt 240

gttacttacc ctcgttccaa ctgcacaatt aagacccacc aagaaccgta ccttgctggt 300

accatgactg acgaaaacat tagacagata gctttctacg gtaaaggcgg tatcggtaaa 360

tctaccacct cccaaaacac ccttgcagct atggcagaaa tgggtcaacg catcatgatt 420

gtaggttgcg accctaaagc tgactccacc cgtctgatgc ttcactccaa agctcaaacc 480

accgtactac acttagctgc tgaacgcggt gcagtagaag acttagaact ccacgaagta 540

atgttgaccg gtttccgtgg cgttaagtgc gtagaatctg gtggtccaga acccggtgta 600

ggttgcgccg gtcgtggtat catcaccgcc attaacttct tagaagaaaa cggcgcttac 660

caagacctag acttcgtatc ctacgacgta ttgggtgacg ttgtatgtgg tggtttcgct 720

atgcctatcc gtgaaggtaa agcacaagaa atctacatcg ttacctctgg tgaaatgatg 780

gcgatgtatg ctgctaacaa catcgctcgc ggtattttga aatatgctca ctccggtggt 840

gtacgtttag gtggtttgat ctgtaacagc cgtaaggttg accgtgaaga cgagttaatc 900

atgaacttgg ctgaacgttt gaacacccaa atgattcact tcgtacctcg tgacaacatc 960

gttcaacacg cagaattgcg ccgtatgacc gttaacgagt acgcaccaga cagcaaccaa 1020

ggtcaagagt accgcgcatt agctaagaag atcatcaaca acgacaagct caccattcct 1080

acaccaatgg aaatggatga actagaagct ctgttgatcg aatacggtct attagacgac 1140

gacaccaagc actctgaaat catcggtaag cccgcagaag ctaccaaata g 1191

<210> 2

<211> 396

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ala Ser Tyr Gln Val Arg Leu Ile Asn Lys Lys Gln Asp Ile Asp

1 5 10 15

Thr Thr Ile Glu Ile Asp Glu Glu Thr Thr Ile Leu Asp Gly Ala Glu

20 25 30

Glu Asn Gly Ile Glu Leu Pro Phe Ser Cys His Ser Gly Ser Cys Ser

35 40 45

Ser Cys Val Gly Lys Val Val Glu Gly Glu Val Asp Gln Ser Asp Gln

50 55 60

Ile Phe Leu Asp Asp Glu Gln Met Gly Lys Gly Phe Ala Leu Leu Cys

65 70 75 80

Val Thr Tyr Pro Arg Ser Asn Cys Thr Ile Lys Thr His Gln Glu Pro

85 90 95

Tyr Leu Ala Gly Thr Met Thr Asp Glu Asn Ile Arg Gln Ile Ala Phe

100 105 110

Tyr Gly Lys Gly Gly Ile Gly Lys Ser Thr Thr Ser Gln Asn Thr Leu

115 120 125

Ala Ala Met Ala Glu Met Gly Gln Arg Ile Met Ile Val Gly Cys Asp

130 135 140

Pro Lys Ala Asp Ser Thr Arg Leu Met Leu His Ser Lys Ala Gln Thr

145 150 155 160

Thr Val Leu His Leu Ala Ala Glu Arg Gly Ala Val Glu Asp Leu Glu

165 170 175

Leu His Glu Val Met Leu Thr Gly Phe Arg Gly Val Lys Cys Val Glu

180 185 190

Ser Gly Gly Pro Glu Pro Gly Val Gly Cys Ala Gly Arg Gly Ile Ile

195 200 205

Thr Ala Ile Asn Phe Leu Glu Glu Asn Gly Ala Tyr Gln Asp Leu Asp

210 215 220

Phe Val Ser Tyr Asp Val Leu Gly Asp Val Val Cys Gly Gly Phe Ala

225 230 235 240

Met Pro Ile Arg Glu Gly Lys Ala Gln Glu Ile Tyr Ile Val Thr Ser

245 250 255

Gly Glu Met Met Ala Met Tyr Ala Ala Asn Asn Ile Ala Arg Gly Ile

260 265 270

Leu Lys Tyr Ala His Ser Gly Gly Val Arg Leu Gly Gly Leu Ile Cys

275 280 285

Asn Ser Arg Lys Val Asp Arg Glu Asp Glu Leu Ile Met Asn Leu Ala

290 295 300

Glu Arg Leu Asn Thr Gln Met Ile His Phe Val Pro Arg Asp Asn Ile

305 310 315 320

Val Gln His Ala Glu Leu Arg Arg Met Thr Val Asn Glu Tyr Ala Pro

325 330 335

Asp Ser Asn Gln Gly Gln Glu Tyr Arg Ala Leu Ala Lys Lys Ile Ile

340 345 350

Asn Asn Asp Lys Leu Thr Ile Pro Thr Pro Met Glu Met Asp Glu Leu

355 360 365

Glu Ala Leu Leu Ile Glu Tyr Gly Leu Leu Asp Asp Asp Thr Lys His

370 375 380

Ser Glu Ile Ile Gly Lys Pro Ala Glu Ala Thr Lys

385 390 395

<210> 3

<211> 9733

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gctggctgtt ttacgcgtat gacaggctcc ggaagacggt tgttgcgcac gtattcggtg 60

aacgcactat ggcgacgctg gggcgtctta tgagcctgct gtcacccttt gacgtggtga 120

tatggatgac ggatggctgg ccgctgtatg aatcccgcct gaagggaaag ctgcacgtaa 180

tcagcaagcg atatacgcag cgaattgagc ggcataacct gaatctgagg cagcacctgg 240

cacggctggg acggaagtcg ctgtcgttct caaaatcggt ggagctgcat gacaaagtca 300

tcgggcatta tctgaacata aaacactatc aataagttgg agtcattacc aaaaggttag 360

gaatacggtt agccatttgc ctgcttttat atagttcata tgggattcac ctttatgttg 420

ataagaaata aaagaaaatg ccaataggat atcggcattt tcttttgcgt ttttatttgt 480

taactgttaa ttgtccttgt tcaaggatgc tgtctttgac aacagatgtt ttcttgcctt 540

tgatgttcag caggaagctt ggcgcaaacg ttgattgttt gtctgcgtag aatcctctgt 600

ttgtcatata gcttgtaatc acgacattgt ttcctttcgc ttgaggtaca gcgaagtgtg 660

agtaagtaaa ggttacatcg ttaggatcaa gatccatttt taacacaagg ccagttttgt 720

tcagcggctt gtatgggcca gttaaagaat tagaaacata accaagcatg taaatatcgt 780

tagacgtaat gccgtcaatc gtcatttttg atccgcggga gtcagtgaac aggtaccatt 840

tgccgttcat tttaaagacg ttcgcgcgtt caatttcatc tgttactgtg ttagatgcaa 900

tcagcggttt catcactttt ttcagtgtgt aatcatcgtt tagctcaatc ataccgagag 960

cgccgtttgc taactcagcc gtgcgttttt tatcgctttg cagaagtttt tgactttctt 1020

gacggaagaa tgatgtgctt ttgccatagt atgctttgtt aaataaagat tcttcgcctt 1080

ggtagccatc ttcagttcca gtgtttgctt caaatactaa gtatttgtgg cctttatctt 1140

ctacgtagtg aggatctctc agcgtatggt tgtcgcctga gctgtagttg ccttcatcga 1200

tgaactgctg tacattttga tacgtttttc cgtcaccgtc aaagattgat ttataatcct 1260

ctacaccgtt gatgttcaaa gagctgtctg atgctgatac gttaacttgt gcagttgtca 1320

gtgtttgttt gccgtaatgt ttaccggaga aatcagtgta gaataaacgg atttttccgt 1380

cagatgtaaa tgtggctgaa cctgaccatt cttgtgtttg gtcttttagg atagaatcat 1440

ttgcatcgaa tttgtcgctg tctttaaaga cgcggccagc gtttttccag ctgtcaatag 1500

aagtttcgcc gactttttga tagaacatgt aaatcgatgt gtcatccgca tttttaggat 1560

ctccggctaa tgcaaagacg atgtggtagc cgtgatagtt tgcgacagtg ccgtcagcgt 1620

tttgtaatgg ccagctgtcc caaacctcca ggccttttgc agaagagata tttttaattg 1680

tggacgaatc gaattcagga acttgatatt tttcattttt ttgctgttca gggatttgca 1740

gcatatcatg gcgtgtaata tgggaaatgc cgtatgtttc cttatatggc ttttggttcg 1800

tttctttcgc aaacgcttga gttgcgcctc ctgccagcag tgcggtagta aaggttaata 1860

ctgttgcttg ttttgcaaac tttttgatgt tcatcgttca tgtctccttt tttatgtact 1920

gtgttagcgg tctgcttctt ccagccctcc tgtttgaaga tggcaagtta gttacgcaca 1980

ataaaaaaag acctaaaata tgtaaggggt gacgccaaag tatacacttt gccctttaca 2040

cattttaggt cttgcctgct ttatcagtaa caaacccgcg cgatttactt ttcgacctca 2100

ttctattaga ctctcgtttg gattgcaact ggtctatttt cctcttttgt ttgatagaaa 2160

atcataaaag gatttgcaga ctacgggcct aaagaactaa aaaatctatc tgtttctttt 2220

cattctctgt attttttata gtttctgttg catgggcata aagttgcctt tttaatcaca 2280

attcagaaaa tatcataata tctcatttca ctaaataata gtgaacggca ggtatatgtg 2340

atgggttaaa aaggatcgat cctctagcta gagtcgacct gcatccctta acttacttat 2400

taaataattt atagctattg aaaagagata agaattgttc aaagctaata ttgtttaaat 2460

cgtcaattcc tgcatgtttt aaggaattgt taaattgatt ttttgtaaat attttcttgt 2520

attctttgtt aacccatttc ataacgaaat aattatactt ttgtttatct ttgtgtgata 2580

ttcttgattt ttttctactt aatctgataa gtgagctatt cactttaggt ttaggatgaa 2640

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<210> 4

<211> 10924

<212> DNA

<213> 人工序列

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aaaccacaat tttagatggc gcagaagaaa atggtattga attacctttc tcttgccatt 6960

ctggttcttg ttctagctgt gtaggcaaag ttgttgaagg tgaagttgac caatctgatc 7020

aaatcttctt agatgatgaa cagatgggta aaggcttcgc tctactttgt gttacttacc 7080

ctcgttccaa ctgcacaatt aagacccacc aagaaccgta ccttgctggt accatgactg 7140

acgaaaacat tagacagata gctttctacg gtaaaggcgg tatcggtaaa tctaccacct 7200

cccaaaacac ccttgcagct atggcagaaa tgggtcaacg catcatgatt gtaggttgcg 7260

accctaaagc tgactccacc cgtctgatgc ttcactccaa agctcaaacc accgtactac 7320

acttagctgc tgaacgcggt gcagtagaag acttagaact ccacgaagta atgttgaccg 7380

gtttccgtgg cgttaagtgc gtagaatctg gtggtccaga acccggtgta ggttgcgccg 7440

gtcgtggtat catcaccgcc attaacttct tagaagaaaa cggcgcttac caagacctag 7500

acttcgtatc ctacgacgta ttgggtgacg ttgtatgtgg tggtttcgct atgcctatcc 7560

gtgaaggtaa agcacaagaa atctacatcg ttacctctgg tgaaatgatg gcgatgtatg 7620

ctgctaacaa catcgctcgc ggtattttga aatatgctca ctccggtggt gtacgtttag 7680

gtggtttgat ctgtaacagc cgtaaggttg accgtgaaga cgagttaatc atgaacttgg 7740

ctgaacgttt gaacacccaa atgattcact tcgtacctcg tgacaacatc gttcaacacg 7800

cagaattgcg ccgtatgacc gttaacgagt acgcaccaga cagcaaccaa ggtcaagagt 7860

accgcgcatt agctaagaag atcatcaaca acgacaagct caccattcct acaccaatgg 7920

aaatggatga actagaagct ctgttgatcg aatacggtct attagacgac gacaccaagc 7980

actctgaaat catcggtaag cccgcagaag ctaccaaata gtctagactt gaaatcatta 8040

aaatattggg aaaataaaat aaatagagac tttaatatat aacgtctcta tttagggaat 8100

aaaggtaagc catttaatta gttttggttt aatcaacagc aactatcaca tctgaggatt 8160

taattaaagc gtatgcttgc ttaccctcag ccagttggag tttatctgct gatgatttgg 8220

tgatgatcga aactatctct actccaggag ctagttctaa tgttacttcg gtgttaactg 8280

taccaggcac aactttttta acagttgttt tcagaaaatt acgtgcgcta acttccatat 8340

cttataatct tacctgttta caggaaacag aataccaaca tttacggtaa ataaaatcac 8400

ccctttagac ttttttaatt atttcgatag atataaattt aaaccaaaac caaaaaccag 8460

atacccgact tctttaagaa gtcgggtatc tatggggatt ttggtagctg acatcataca 8520

agataactgt caaaatagct gccgttgtag tattttttaa gcggatttaa tcaatgtaca 8580

cggcgatcgt tataaacatt cataatctaa gcttatcaga gtgataatat ataagtaagc 8640

taaattgttg ctagtgaacc tagacctcag caaaaagcga ttacagggtt atctcagaca 8700

ttcctacctt aatactggtc aatcttagaa attgggtaga tggtcatata tcttcaagat 8760

gatactctcg gaacgctgcg gaaatcttca aacaaaaaca accagattta ttagggtttg 8820

tcataagtct catacctcga gctggatact tcccgtccgc cagggggaca tgccggcgat 8880

gctgaaggtc gcgcgcattc ccgatgaaga ggccggttac cgcctgtttg aggatatagt 8940

aatctttcta aatagctttg gattggagga gtatggccac taatactaag ttcagctaat 9000

aaaaaaattt gctaaagaac tccagctgga tttcactgat gagaatatcg tcggagataa 9060

atataataat tccacggact atagactata ctagtatact ccgtctactg tacgatacac 9120

ttccgctcag gtccttgtcc tttaacgagg attgttacgt acgctaatgg cgtcaaaaca 9180

aagactctag acctaggcct taagatcgaa agagctggta gttggcgcac tgttcgaaga 9240

actgccgatg tccagtaaga ttcttactat gctggttgaa ccggatgctg gtaaagctac 9300

ttgggttgct gcttctactt atggtaccga tacaactact ggtgaggaag ttaaaggagc 9360

tcgcgaaagc ttgcatgcct gcagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg 9420

aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg 9480

caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag 9540

ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc 9600

gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga 9660

tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat 9720

atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc 9780

tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 9840

accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 9900

gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 9960

caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc 10020

tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 10080

ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 10140

tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 10200

gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 10260

attgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 10320

gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 10380

gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 10440

ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 10500

ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta 10560

ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag 10620

tgagcgagga agcggaagag cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta 10680

tttcacaccg catatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc 10740

agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac 10800

acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt 10860

gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag 10920

gcag 10924

<210> 5

<211> 903

<212> DNA

<213> 鱼腥草

<400> 5

cagaaattcg atatctagat ctcgagtctt cctgtaaacg gtatggatca ttgcttccca 60

tcaaatgcag tgtccaactc tggcttaatt ctcgaagaat tcagggagat ttaacttcga 120

gaactatatc gatcctataa atttgaggag aatcggcaaa tggctagcta ccaagttaga 180

ttgatcaaca agaaacaaga catcgatact accatcgaga ttgatgaaga aaccacaatt 240

ttagatggcg cagaagaaaa tggtattgaa ttacctttct cttgccattc tggttcttgt 300

tctagctgtg taggcaaagt tgttgaaggt gaagttgacc aatctgatca aatcttctta 360

gatgatgaac agatgggtaa aggcttcgct ctactttgtg ttacttaccc tcgttccaac 420

tgcacaatta agacccacca agaaccgtac cttgcttaat tcattgctgt agtcgctact 480

atttacagct tgtgcaagtg tagcttaaat caggatgaag gatatttttc atcctgattt 540

cttatataaa tctattctga atttattaac accaatgttt actccattta ctgtaaatgg 600

cagttctttg caattgctaa aagttggcga tcgcggaata gtcaagttct gcaatattca 660

agataaaaat attctcaaaa aactcaagtc tctgggctta aataccggag tcactatcac 720

catagagcaa gaattccctt ctttaattat tcaagtagga agcattctct tagaaataga 780

taaagaactt gctcgtaaca tctacgttcg tgtaattaat aattgattga attgagaaaa 840

atcttcatta ataagtacta tatcttacag tattagagta cctcacgctg ccgcaagcac 900

tca 903

<210> 6

<211> 866

<212> DNA

<213> 鱼腥草

<400> 6

caggttagga gaacgccgtc gactctagac ttgaaatcat taaaatattg ggaaaataaa 60

ataaatagag actttaatat ataacgtctc tatttaggga ataaaggtaa gccatttaat 120

tagttttggt ttaatcaaca gcaactatca catctgagga tttaattaaa gcgtatgctt 180

gcttaccctc agccagttgg agtttatctg ctgatgattt ggtgatgatc gaaactatct 240

ctactccagg agctagttct aatgttactt cggtgttaac tgtaccaggc acaacttttt 300

taacagttgt tttcagaaaa ttacgtgcgc taacttccat atcttataat cttacctgtt 360

tacaggaaac agaataccaa catttacggt aaataaaatc acccctttag acttttttaa 420

ttatttcgat agatataaat ttaaaccaaa accaaaaacc agatacccga cttctttaag 480

aagtcgggta tctatgggga ttttggtagc tgacatcata caagataact gtcaaaatag 540

ctgccgttgt agtatttttt aagcggattt aatcaatgta cacggcgatc gttataaaca 600

ttcataatct aagcttatca gagtgataat atataagtaa gctaaattgt tgctagtgaa 660

cctagacctc agcaaaaagc gattacaggg ttatctcaga cattcctacc ttaatactgg 720

tcaatcttag aaattgggta gatggtcata tatcttcaag atgatactct cggaacgctg 780

cggaaatctt caaacaaaaa caaccagatt tattagggtt tgtcataagt ctcatacctc 840

gagctggata cttcccgtcc gcctca 866

<210> 7

<211> 394

<212> DNA

<213> 鱼腥草

<400> 7

catgctggag ttcttcgccc accggggatc ccagtactca gaattttttg ctgaggtact 60

gagtacacag ctaataaaat tgggcaatct ccgcgcctct atgacttgaa ggagagtgta 120

ggggtatagg ggaaagatat cttttatcta catcacataa ataaaaaatt taatttgtcg 180

ctctggctgc atatattgat gtatttttag ccataagttt tttagtgcca tgtaattata 240

gtgattttta gcgatcgcag agcatttttc cctggattta tcgcgatctc aaaaaaaatt 300

tgcccgaagt atgacagatt gtcatatttg gtgtcgattt tatttaaaat gaaataagaa 360

aaataaaact acaggttagg agaacgccgt cgac 394

<210> 8

<211> 1343

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cctcacgctg ccgcaagcac tcagggcgca agggctgcta aaggaagcgg aacacgtaga 60

aagccagtcc gcagaaacgg tgctgacccc ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga 120

caagggaaaa cgcaagcgca aagagaaagc aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat 180

akctagactg kkyggtttwa tggaaccagc caaggcgaac cgggaattcg cccagykggg 240

gccgcccttc tggataaggg ttggggaagc ccctgacaaa gtaaactgga tggctttcyt 300

gccgccaagg atctgatggc gcaggggatc aagatctgat caaggagaca ggatgaggat 360

cgtttcgcat gattgaacaa ggtggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga 420

ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc 480

ggctgtcagc gcaggggcgc cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg 540

aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc 600

gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg 660

ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct 720

gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg 780

aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat 840

ctggacgaag agcatcasgg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc 900

atgcccgacg gcgatgatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg 960

gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc 1020

tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaar agcttggcgg cgaatgggct 1080

gaccgccttc ctcstgcttw acggtatcgc cgccttccsg attcgcagcg cawcggccty 1140

ctatcggcct tcttggacga gttcttctga gcgggactct ggggttcgaa atgaccgacc 1200

aagcgacgcc caacctgcca tcacgagatt tcgattccac cgccgccttc tatgaaaggt 1260

tgggcttcgg aatcgttttc cgggacgccg gctggatgat cctccagcgc ggggatctca 1320

tgctggagtt cttcgcccac cgg 1343

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caggttagga gaacgccgtc gacatggcta gctaccaagt tag 43

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctaatgtttt cgtcagtcat ggtaccagca aggtacggtt cttg 44

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggtaccatga ctgacgaaaa cattag 26

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccaatatttt aatgatttca agtctagact atttggtagc ttctgcgg 48

<210> 13

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gcagaaattc gatatctaga tctcgagtct tcctgtaaac ggtatgg 47

<210> 14

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggcggacggg aagtatccag ctcgaggtat gagacttatg acaaaccc 48

Claims (8)

1.一种FNET1蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No:2。

2.权利要求1所述的FNET1蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其核苷酸序列为SEQ ID No:1。

4.含有权利要求2或3所述的编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。

5.权利要求1所述的蛋白或其编码基因在制造具有高产H₂能力的转基因丝状蓝藻中的应用。

6.获得具有高产H₂能力的转基因丝状蓝藻的方法，包括以下步骤：将权利要求2或3所述的编码基因导入丝状蓝藻中，得到具有高产H₂能力的转基因丝状蓝藻。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述编码基因是通过权利要求4所述的重组表达载体或表达盒导入所述丝状蓝藻中的。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述丝状蓝藻为鱼腥藻7120。

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