CN106699858B - GhNAC79及其在调控植物抗旱性中的应用 - Google Patents

GhNAC79及其在调控植物抗旱性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了GhNAC79及其在调控植物抗旱性中的应用。本发明公开的GhNAC79，是如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列2、序列2的第143‑232位或序列2的第1‑187位的蛋白质；A2)将序列表中序列2或序列2的第143‑232位或序列2的第1‑187位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，本发明的GhNAC79可以提高植物的抗旱能力，抑制GhNAC79基因的表达可以降低植物的抗旱能力，可利用本发明的GhNAC79及其编码基因调控植物的抗旱性。

Description

GhNAC79及其在调控植物抗旱性中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，GhNAC79及其在调控植物抗旱性中的应用。
背景技术
棉花是纤维的主要来源，相对于水稻和小麦，棉花对干旱具有较高的抗性。中国有10％的耕地缺乏水分，严重时可减产50％左右。随着全球气候变化以及环境污染，干旱已经成为限制棉花产量和品质的重要因素。因此通过生物技术手段，挖掘干旱相关基因，培育高抗棉花材料对于棉花育种具有非常重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗旱性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种具有抗旱功能的蛋白质。
本发明所提供的蛋白质，其名称为GhNAC79，是如下A1)、A2)、A3)、A4)或A5)：
A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；
A2)氨基酸序列是序列2的第143-232位的蛋白质；
A3)氨基酸序列是序列2的第1-187位的蛋白质；
A4)将序列表中序列2或序列2的第143-232位或序列2的第1-187位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A5)在A1)或A2)或A3)或A4)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述A4)中的GhNAC79，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述A4)中的GhNAC79可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述A4)中的GhNAC79的编码基因可通过将序列1的第53-751位、序列1的第479-751位或序列1的第53-613位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与GhNAC79相关的生物材料。
本发明所提供的与GhNAC79相关的生物材料，为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码GhNAC79的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B8)降低GhNAC79表达的核酸分子；
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下b1)-b5)中任一种：
b1)其编码序列是序列表中序列1的第53-751位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
b2)其编码序列是序列表中序列1的第479-751位或序列1的第479-767位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
b3)其编码序列是序列表中序列1的第53-613位或序列1的第23-613位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码GhNAC79的cDNA分子或基因组DNA分子；
b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码GhNAC79的cDNA分子或基因组DNA分子；
B8)所述核酸分子为序列表中序列1所示的DNA分子中任一片段或其互补片段。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，序列1的第53-751位核苷酸所示的DNA分子编码序列2所示的蛋白质。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GhNAC79的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的GhNAC79的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GhNAC79且具有GhNAC79功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2或序列2的第143-232位或序列2的第1-187位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，B2)所述的含有编码GhNAC79的核酸分子的表达盒(GhNAC79基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GhNAC79的DNA，该DNA不但可包括启动GhNAC79基因转录的启动子，还可包括终止GhNAC79基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
可用现有的表达载体构建含有所述GhNAC79基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pBI 121或pGBKT7。所述载体具体可为VIGS载体，如pCLCrVA载体或pYL156载体。
B3)所述重组载体可含有序列1的第53-751位所示的用于编码GhNAC79的DNA序列；进一步B3)所述重组载体具体可为pBI 121-GhNAC79、pGBKT7-ADfra2、pGBKT7-Adfra3或pGBKT7-Adfra4。所述pBI 121-GhNAC79为将pBI 121载体的XbaI和SacI识别位点间的DNA序列替换为序列1的第53-751位所示的DNA序列，得到表达序列2所示的GhNAC79的重组载体。所述pGBKT7-ADfra2为将EcoRI和BamHI识别位点间的DNA序列替换为序列1的第23-613位所示的DNA序列得到的表达序列2的第1-187位所示蛋白质的重组载体。所述pGBKT7-Adfra3为将EcoRI和BamHI识别位点间的DNA序列替换为序列1的第479-767位所示的DNA序列得到的表达序列2的第143-232位所示蛋白质的重组载体。所述pGBKT7-Adfra4为将EcoRI和BamHI识别位点间的DNA序列替换为序列1的第23-767位所示的DNA序列得到的表达序列2的第所示蛋白质的重组载体。
B8)所述核酸分子可为序列表中序列1的第504-775位核苷酸所示的DNA分子。
B9)所述重组载体可含有序列表中序列1的第504-775位核苷酸所示的DNA分子。进一步B9)所述重组载体具体可为下述B9a)或B9b)：B9a)将pCLCrVA载体的SpeI和AscI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列1的第504-775位核苷酸所示的DNA分子得到的重组载体；B9b)将pYL156载体的EcoRI和BamHI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列1的第504-775位核苷酸所示的DNA分子得到的重组载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。所述酵母可为酵母菌株Y2H。所述细菌可为农杆菌，如农杆菌LBA4404。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
为解决上述技术问题，本发明还提供了植物抗旱产品。
本发明所提供的植物抗旱产品，含有GhNAC79或所述生物材料。
上述植物抗旱产品中，所述植物抗旱产品可以以GhNAC79或所述生物材料作为活性成分，还可以将GhNAC79或所述生物材料与其它抗旱物质进行组合得到的组合物作为活性成分。
为解决上述技术问题，本发明还提供了GhNAC79、或所述生物材料在下述1)-15)中任一种中的应用：
1)调控植物抗旱性；
2)制备植物抗旱产品；
3)培育抗旱植物；
4)调控植物ABA敏感性；
5)制备植物ABA敏感产品；
6)培育ABA敏感植物；
7)调控植物气孔开度；
8)制备调控植物气孔开度产品；
9)培育气孔开度降低植物；
10)调控植物水分散失；
11)制备调控植物水分散失产品；
12)培育水分散失降低植物；
13)调控植物开花时间；
14)制备促进植物开花产品；
15)培育提前开花植物。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一方法：
X1)一种培育抗旱性转基因植物的方法，包括：增加目的植物中GhNAC79的活性或增加目的植物中GhNAC79的含量或促进GhNAC79的编码基因的表达，得到转基因植物；所述转基因植物抗旱性高于所述目的植物；
X2)培育抗旱性降低的植物的方法，包括：降低目的植物中GhNAC79的活性、降低目的植物中GhNAC79的含量、抑制目的植物中GhNAC79的编码基因的表达或敲除目的植物中GhNAC79的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物的抗旱性低于所述目的植物。
上述方法中，所述增加目的植物中GhNAC79的含量可通过向所述目的植物中导入GhNAC79的编码基因实现。
所述抑制目的植物中GhNAC79的编码基因的表达可通过病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)来实现。所述抑制目的植物中GhNAC79的编码基因的表达具体可通过将序列表中序列1的第504-775位核苷酸所示的DNA片段导入所述目的植物实现。
上述方法中，所述GhNAC79的编码基因可为编码序列是序列表中序列1的第53-751位的DNA分子。
在本发明的实施例中，所述GhNAC79的编码基因(即序列1的第53-751位核苷酸所示的DNA分子)通过含有GhNAC79基因表达盒的GhNAC79基因重组表达载体导入目的植物中。
上述方法中，其中所述GhNAC79基因可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，以达到更好的表达效果：
1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述GhNAC79基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
所述GhNAC79基因表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
所述培育抗旱性转基因植物的方法还包括从导入序列2所示的GhNAC79的编码基因的植株中筛选表达所述编码基因的植株，得到所述转基因植物。
上述方法中，所述将序列表中序列1的第504-775位核苷酸所示的DNA片段(将该片段命名为片段1)导入所述目的植物可通过pCLCrVA载体或pYL156载体将所述片段1导入所述目的植物。
本发明中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述GhNAC79基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本发明中，所述植物、所述受体植物和所述目的植物均可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为棉花或拟南芥。
本发明中，所述抗旱具体可体现为对PEG(如PEG6000)或甘露醇模拟的干旱环境的抗性。
实验证明，本发明的GhNAC79可以提高植物的抗旱能力，抑制GhNAC79基因的表达可以降低植物的抗旱能力：
1)干旱处理后的导入GhNAC79编码基因的转基因植株的生长状况明显好于野生型，并且叶片卷曲程度显著小于野生型；转基因植株的气孔开度极显著小于野生型(转基因植株的气孔开度为0.6690±0.0502，野生型的气孔开度为0.7360±0.0614)；在甘露醇模拟的干旱环境中，导入GhNAC79编码基因的转基因植株的生长状况明显优于野生型，转基因植株的干湿比显著小于野生型，GhNAC79及其编码基因可以降低植物在干旱环境中的气孔开度，进一步可以减少植株水分的散失，提高抗旱能力；正常生长状况下，单位面积内转基因植株和对照植株的叶片气孔数目和气孔开度没有明显差异；干旱处理14天后，转基因植株叶片的气孔开度显著小于对照植株，转基因植株叶片气孔平均为16个/64mm2，对照植株叶片气孔平均为14个/64mm2，GhNAC79及其编码基因可以通过调控气孔开度调控棉花干旱抗性；
2)在pCLCrVA-pCLCrVB体系中，GhNAC79编码基因在基因沉默植株中的表达量显著低于空载体对照，对各棉花干旱处理后，待所有植株濒临死亡后，再复水，结果表明抑制GhNAC79的表达使转基因棉花对干旱抗性降低，并且复水后无法恢复生长；在pYL156-pYL192体系中，GhNAC79编码基因在基因沉默植株中的表达量显著低于空载体对照,对各植株进行干旱处理，基因沉默植株出现显萎蔫时，空载体对照植株的叶片均未出现萎蔫表型，结果表明抑制GhNAC79编码基因的表达，植物幼苗对干旱的抗性降低，表明GhNAC79及其编码基因可以正调控棉花的抗干旱能力。
另外，GhNAC79编码基因的表达能够被PEG6000和甘露醇模拟的干旱环境诱导，而NaCl模拟的高盐环境对GhNAC79编码基因的表达无明显影响。GhNAC79的转录活性位于C端，序列1的第479-767位、序列1的第23-613位和序列1的第23-767位编码的蛋白质具有转录激活活性。
实验证明，可利用本发明的GhNAC79及其编码基因调控植物的抗旱性。
附图说明
图1为GhNAC79转录活性检测结果。图1中a为转录激活实验中，不同基因片段以及阳性对照和阴性对照的生长情况，a中左图是无X-a-Gal底物条件下酵母的生长情况，a图右图是存在X-a-Gal底物情况下酵母的显色情况；b为对应a图中，各个酵母单克隆包含的基因片段，P为阳性对照，N为阴性对照，1-4分别表示pGBKT7-ADfra1、pGBKT7-ADfra2、pGBKT7-ADfra3和pGBKT7-ADfra4。
图2为GhNAC79编码基因的组织表达模式。
图3为GhNAC79编码基因在干旱和盐处理下的表达情况。
图4为GhNAC79编码基因在干旱和盐不同处理时间下的表达情况。横坐标表示不同处理时间。
图5为转基因拟南芥的表型。其中，OE3、OE5、OE10、OE17分别代表4个转基因拟南芥株系。
图6为转基因拟南芥在不同生长条件下对干旱的响应。a-b：拟南芥播种14天后进行干旱处理，a：转基因拟南芥和野生型拟南芥的表型，b：转基因拟南芥和野生型拟南芥的气孔开度；c-d：培养基中种植的拟南芥在甘露醇模拟的干旱环境中的表型，c：转基因拟南芥和野生型拟南芥的表型，d：转基因拟南芥和野生型拟南芥的干湿重比。
图7为棉花中GhNAC79编码基因的表达受到抑制后的表型。a-b为pCLCrVA-pCLCrVB体系的实验结果，其中，a为GhNAC79编码基因的相对表达量，b为干旱处理后棉花的表型；pCLCrVA为空载体对照植株，pCLCrVA::PDS为指示植株，pCLCrVA::GhNAC79为转基因植株，1-4为不同的转基因株系。c-d为pYL156-pYL192体系的实验结果，其中c为GhNAC79编码基因的相对表达量，d为干旱处理后棉花的表型；pYL156::PDS为指示植株，pYL156为空载体对照植株，pYL156::GhNAC79为转基因植株，1-4为不同的转基因株系。
图8为转基因棉花干旱处理后的表型。其中，a为气孔开度的结果，正常水分管理指所有植株均正常水分管理；干旱处理指所有植株均利用20％的PEG6000水溶液进行模拟干旱处理。b：干旱处理7天后转基因棉花和空载体植株的表型以及干旱处理14天后转基因棉花和空载体植株的表型。a图和b图中，对照：空载体植株；株系8和株系36分别为GhNAC79的不同转基因株系。
图中，﹡﹡表示差异达到极显著水平(p<0.01)，﹡表示差异达到显著水平(p<0.05)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的陆地棉品种中棉所10号(CCRI 10)为国家审定品种(GS08007-1984)，由张裕繁、刁光中、黄祯茂、喻树迅、李武斌和王者民育成，详细信息：
http://www.cricaas.com.cn/succeedvariety/mhpz/4ca5b972dea522b4/，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的陆地棉中棉所24为国家审定品种(GS08007-1984)，由黄祯茂、喻树迅、姜瑞云、原日红育成，详细信息：
http://www.cricaas.com.cn/succeedvariety/mhpz/65121237a4e927f1/，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pGBKT7载体为北京华诺时代科技有限公司产品；pBI 121载体为北京华越洋生物科技有限公司产品；pCLCrVA载体和pCLCrVB载体记载在文献(Gu et al.，Aversatile system for functional analysis of genes and microRNAs in cotton，Plant Biotechnology Journal(2014)12,pp.638–649)中；pYL156载体和pYL192载体记载在文献(Turgay Unver et al.，Virus-Induced Gene Silencing,a PostTranscriptional Gene Silencing Method，International Journal of PlantGenomics，Volume 2009)中；公众可从申请人处获得这些载体，这些载体只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
pCLCrVA::PDS为将pCLCrVA载体的SpeI和AscI识别序列间的DNA片段替换为pds基因序列得到的重组载体，pYL156::PDS为将pYL156载体的EcoRI和BamHI识别序列间的DNA片段替换为pds基因序列得到的重组载体。其中，pds基因序列为：
TTCCCGTCCAACTAAACCATTGAAAGTCATAATTGCTGGTGCAGGTATCAATTTTGTCTTAGTTCTTATATTCGTTTTCTTCATCTTTCGGGAAATCCATTTTCTACGCCTTTGAACCTTTTTTTGCAGCTTCATGGTGCCTTTGCTGCTGCTAATTTTCTAAGAAGTTACTTATTTTTCCTACTGATGAACTGAATTTCGGCTTGACTTA。
实施例1、GhNAC79及其编码基因的制备与特性
本发明从陆地棉品种中棉所10号(CCRI 10)的叶片中克隆到了序列1所示的DNA分子，其中序列1的第53-751位编码序列2所示的蛋白质，将该蛋白质命名为GhNAC79。
1、GhNAC79的转录活性
分别利用表2中的引物，从CCRI 10的叶片克隆到了含有不同长度GhNAC79编码基因片段的DNA分子，将利用ADfra-1、ADfra-2、ADfra-3和ADfra-4得到的序列正确的DNA分子分别命名为DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3和DNA片段4。
表2、引物序列
其中，下划线为限制性内切酶的识别序列，EcoRI：GAATTC，CCG为保护碱基；BamHI：GGATCC，CGC为保护碱基。
将DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3和DNA片段4均利用EcoRI和BamHI双酶切后分别与EcoRI和BamHI双酶切pGBKT7载体得到的载体骨架连接，得到4个重组质粒，将其分别命名为pGBKT7-ADfra1(pGBKT7-fra1(23-485))、pGBKT7-ADfra2(pGBKT7-fra2(23-613))、pGBKT7-ADfra3(pGBKT7-fra3(479-767))和pGBKT7-ADfra4(pGBKT7-fra4(23-767))，其中，pGBKT7-ADfra1含有序列表中序列1的第23-485位所示的DNA分子，pGBKT7-ADfra2含有序列表中序列1的第23-613位所示的DNA分子，pGBKT7-ADfra3含有序列表中序列1的第479-767位所示的DNA分子，pGBKT7-ADfra4含有序列表中序列1的第23-767位所示的DNA分子，即含有GhNAC79编码基因的完整序列。
将pGBKT7-ADfra1、pGBKT7-ADfra2、pGBKT7-ADfra3和pGBKT7-ADfra4分别导入酵母菌株Y2H(Clontech)中，通过缺失培养基和特异PCR确定阳性单克隆，同时设置阳性对照(pGBKT7-p53+pGADT7-largeT)和阴性对照(pGBKT7-laminC+pGADT7-largeT)，pGBKT7-p53和pGADT7-largeT分别含有SV40大T抗原和鼠p53的AD和BD的融合蛋白，pGBKT7-laminC含有人lamin C与BD的融合蛋白，具体操作步骤如下：
1、根据clontech的酵母转化说明书(YeastmakerTMYeast TransformationSystem 2User Manual)，将包含不同基因片段的重组载体(pGBKT7-ADfra1、pGBKT7-ADfra2、pGBKT7-ADfra3和pGBKT7-ADfra4)分别转入酵母Y2H中。
2、利用SD/-Trp/25mM 3-AT筛选培养基(该培养基为向SD/-Trp中加入3-AT得到的3-AT浓度为25mM的培养基)筛选得到阳性酵母菌株，同时将阳性菌株转移至SD/-Trp/25mM3-AT/X-a-Gal固体培养基(该培养基为向SD/-Trp/25mM 3-AT筛选培养基中添加X-a-Gal得到的培养基)中，观察菌株的颜色变化。待到菌株出现蓝色，调取对应菌斑，转移至SD/-Trp/25mM 3-AT液体培养基中，30℃摇床中扩摇，直至菌液出现浑浊。
3、利用特异PCR进一步确定阳性单克隆：
取浑浊菌液10μl,利用PCR仪器破壁(99℃10min,4℃1min,2个循环)
PCR检测：
A、引物：T7(上游引物):TAATACGACTCACTATAGGGC；R:对应基因片段的反向引物(下游引物)
B、PCR体系(使用LA Taq DNA polymerase聚合酶)
1μl 10m M上游引物、1μl 10mM下游引物、0.25μl 5U/μl TaKaRa LA Taq、2.5μl10×Taq Buffer II、4μl dNTP Mixture(2.5mM each)、2μl破壁菌液，加灭菌水至25μl。
C、PCR循环
4℃保存
结果如图1所示：结果表明GhNAC79的转录活性位于C端，序列1的第479-767位、序列1的第23-613位和序列1的第23-767位编码的蛋白质具有转录激活活性，序列1的第479-767位编码序列2的第143-232位所示的蛋白质，序列1的第23-613位编码序列2的第1-187位所示的蛋白质，序列1的第23-767位编码序列2所示的GhNAC79蛋白质。
2、GhNAC79编码基因的表达模式
利用引物对(F:AATCACATTAATCGGTTTAC和R:CTAAAGATTCCAAAACCCATC)检测GhNAC79编码基因在陆地棉品种中棉所10号中的表达模式，所用内参为GhHIS3基因，内参的引物为：GhHis3F：GAAGCCTCATCGATACCGTC；GhHis3R：CTACCACTACCATCATGGC)。实验重复三次。
2.1GhNAC79在不同组织中的表达模式
选取组织为根、茎、子叶、真叶、花、0DPA、5DPA、10DPA、15DPA、20DPA和25DPA。其中0DPA、5DPA、10DPA、15DPA、20DPA和25DPA分别表示纤维发育不同时间(DPA：Days afteranthesis,开花后天数)。
结果显示GhNAC79编码基因在子叶及纤维发育后期高表达(图2)。
2.2干旱与高盐对GhNAC79编码基因表达的影响
选取陆地棉品种中棉所10号的健康种子30粒，双氧水消毒后，随机分为三组，分别点播于含有200mM甘露醇的1/2MS固体培养基(1/2MS固体培养基为将MS培养基中的各微量元素浓度减半得到的培养基)和含有200mM NaCl的1/2MS固体培养基中，以1/2MS固体培养基作为对照组。密闭条件下，25℃，16h光照/8h黑暗条件下培养，15天后，取叶片检测GhNAC79编码基因的表达情况。结果显示，在密闭条件下，GhNAC79编码基因在叶片中的表达量能够被甘露醇模拟的干旱环境诱导，GhNAC79编码基因在叶片中的表达量在盐(200mMNaCl)处理后没有显著性变化(图3)。
将PEG6000溶于水中，得到PEG6000质量百分比浓度为20％的PEG6000溶液；将NaCl溶于水中，得到NaCl浓度为200mM的NaCl溶液。
选取陆地棉品种中棉所10号的真叶30片，随机分为三组，即对照组、干旱处理组和盐处理组。将对照组、干旱处理组和盐处理组的叶片分别浸泡在水、PEG6000溶液和NaCl溶液中，分别在浸泡0、2、4、6、8、12和24小时时取叶片检测GhNAC79编码基因的表达情况。结果显示，棉花叶片经PEG6000溶液处理24小时时，GhNAC79编码基因高表达，GhNAC79编码基因的表达受PEG6000模拟的干旱环境的影响，而GhNAC79编码基因的表达情况不受NaCl模拟的盐环境的影响(图4)。图4中，A-G分别表示干旱处理组表达量由高到低的时间点。
结果表明，GhNAC79编码基因的表达能够被PEG6000和甘露醇模拟的干旱环境诱导，而NaCl模拟的高盐环境对GhNAC79编码基因的表达无明显影响。
实施例2、GhNAC79及其编码基因可以提高拟南芥的抗旱性
1、转基因拟南芥的制备
表达载体的制备：将pBI 121载体的XbaI和SacI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列1的第53-751位所示的GhNAC79编码基因，得到重组载体，将该重组载体命名为pBI121-GhNAC79。
重组菌的制备：将pBI 121-GhNAC79导入农杆菌LBA4404中，得到重组菌，将该重组菌命名为LBA4404-pBI 121-GhNAC79。将pBI 121导入农杆菌LBA4404中，得到重组菌(作为空载体对照)，将该重组菌命名为LBA4404-pBI 121。
利用花絮侵染法转化拟南芥：
利用含有卡那霉素、链霉素和利福平的LB液体培养基培养LBA4404-pBI 121-GhNAC79，至农杆菌培养液OD600值在1.2到1.6之间时，将农杆菌培养液室温5000rpm离心15min，弃上清，将沉淀悬浮于渗透液中，使OD600＝0.8，得到农杆菌悬浮液。其中渗透液为向1/2MS培养基中添加Silwet-77得到的Silwet-77的体积分数为0.02％的液体。
将Columbia生态型拟南芥的花絮在农杆菌悬浮液中浸泡1min，避光培养48小时开盖，之后正常光照培养。分别在7天后和14天后分别重复上述步骤1次。最终得到T0代转基因拟南芥，收获T1代转基因拟南芥种子。
将T1代转基因拟南芥种子灭菌后，点播至含有卡那霉素的1/2MS固体培养基中，培养箱中培养14天后，选取绿色拟南芥，移栽至营养土中，培养室中正常生长。待绿色植株生长健壮后，提取叶片DNA，并利用引物(F:GCTCTAGAAGACTGGCATGAATAAACAAG和R:CGAGCTCAGCTTCTCCATCTACACATCA)进行PCR检测，筛选含有目的基因的阳性植株，得到T1代转基因阳性植株，收获T2代转基因种子。按照上述方法得到T4代转基因种子。
按照上述方法，利用LBA4404-pBI 121进行对照实验，得到转空载体对照植株。
2、转基因植株的抗旱性检测
选取四个转基因株系(OE3、OE5、OE10和OE17，即分别为株系3、株系5、株系10和株系17)的T4代转基因种子播种，播种20天后，每个株系选取12盆，将这12盆随机分为四组：对照组、干旱处理组、脱落酸(ABA)处理组和盐处理组，每组3盆。
将对照组所有植株根部灌溉500ml的灭菌水。
将干旱处理组所有植株根部灌溉500ml的20％(质量百分比)PEG6000水溶液。
将脱落酸(ABA)处理组所有植株叶面喷施200ml的50μM ABA水溶液。
将盐处理组所有植株根部灌溉500ml的200mM的NaCl水溶液。
每个处理均利用Columbia生态型拟南芥(即野生型，WT)与转空载体对照植株作为对照。在处理7天后，观察各组的表型(图5)。结果显示，对于对照组和盐处理组，不同转基因株系植株的表型与野生型及转空载体对照植株没有明显差异；对于干旱处理组和ABA处理组，OE3、OE5、OE10和OE17均抽薹开花，而野生型及转空载体对照植株均与对照组和盐处理组各植株没有明显差异。结果说明GhNAC79及其编码基因可以使拟南芥对PEG6000模拟的干旱和ABA更加敏感。
为了进一步确定GhNAC79对干旱的响应，选取转基因株系OE3的T4代转基因种子播种，播种14天后，选取20株随机分为两组：对照组和干旱处理组，每组10株。将对照组植株根部灌溉500ml的灭菌水，将干旱处理组植株根部灌溉500ml的20％(质量百分比)PEG6000水溶液。每种处理均利用Columbia生态型拟南芥(即野生型，WT)作为对照。在处理7天后，观察各组的表型，并利用拟南芥倒数第二片莲座叶的背部表皮制片，在显微镜下观察气孔运动，利用显微镜的标尺测量并记录气孔最宽与最长处，计算气孔开度，气孔开度为气孔最宽与最长处的比值(图6中a和b)，所得到的气孔开度值为同一植株20个气孔开度的平均值。结果显示，每种处理下野生型与转空载体对照植株的表型及气孔开度无显著差异，干旱处理后的转基因植株的生长状况明显好于野生型，并且叶片卷曲程度显著小于野生型拟南芥；在对照组的处理下，转基因植株与野生型拟南芥的气孔开度无显著差异，在干旱处理下，转基因植株的气孔开度极显著小于野生型拟南芥(转基因植株的气孔开度为0.6690±0.0502，野生型拟南芥的气孔开度为0.7360±0.0614)(p<0.01)。表明，GhNAC79及其编码基因可以降低拟南芥在干旱环境中的气孔开度，进一步可以减少植株水分的散失，提高抗旱能力。
制备0mM甘露醇培养基和100mM甘露醇培养基：0mM甘露醇培养基即为1/2MS培养基，100mM甘露醇培养基为向0mM甘露醇培养基添加甘露醇得到的甘露醇浓度为100mM的培养基。
将转基因株系OE3的T4代转基因种子与Columbia生态型拟南芥(即野生型，WT)播种至0mM甘露醇培养基和100mM甘露醇培养基中，并利用转空载体对照植株作为对照，每个培养皿中均播种转基因种子与野生型种子，每个培养皿中转基因种子与野生型种子均为15粒，设置3个重复，播种后正常培养，观察表型。在播种15天后，分别取转基因植株和野生型植株15株，称取湿重，然后烘干称量干重，计算干湿比(干湿比＝干重/湿重，也即干湿重比)。结果(图6中c和d)显示，转空载体对照植株与野生型在不同处理下的表型与干湿比均无显著差异，在0mM甘露醇培养基中，野生型与转基因植株的表型与干湿比无显著差异；在100mM甘露醇培养基中，转基因植株的生长状况明显优于野生型，转基因植株的干湿比显著小于野生型(p<0.05)。表明，转基因拟南芥抗甘露醇模拟的干旱环境的能力高于野生型，在干旱环境中的失水能力小，保水能力强。表明GhNAC79及其编码基因可以提高拟南芥的抗旱能力。
实施例3、抑制棉花GhNAC79编码基因的表达可以降低棉花的抗旱性
利用pCLCrVA-pCLCrVB和pYL156-pYL192两种VIGS体系诱导GhNAC79基因沉默。
1、VIGS载体及重组菌的构建
将pCLCrVA载体的SpeI和AscI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列1的第504-775位核苷酸所示的DNA分子，得到重组载体，将该重组载体命名为pCLCrVA::GhNAC79。扩增序列1的第504-775位核苷酸所示的DNA分子所用引物为：F1：ACTAGTCTACACCTCCTATCCTAAGAC，R1：GGCGCGCCAGCTTCTCCATCTACACAT。
将pYL156载体的EcoRI和BamHI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列1的第504-775位核苷酸所示的DNA分子，得到重组载体，将该重组载体命名为pYL156::GhNAC79。扩增序列1的第504-775位核苷酸所示的DNA分子所用引物为：F2：GAATTCCTACACCTCCTATCCTAAGAC；R2：GGATCCAGCTTCTCCATCTACACAT。
分别将pCLCrVA::GhNAC79、pCLCrVA载体(作为空载体对照)、pCLCrVA::PDS(作为指示载体)和辅助质粒载体pCLCrVB导入农杆菌LBA4404中，将得到重组菌分别命名为LBA4404-pCLCrVA::GhNAC79、LBA4404-pCLCrVA、LBA4404-pCLCrVA::PDS和LBA4404-pCLCrVB。
分别将pYL156::GhNAC79、pYL156载体(作为空载体对照)、pYL156::PDS(作为指示载体)和辅助质粒载体pYL192导入农杆菌LBA4404中，将得到重组菌分别命名为LBA4404-pYL156::GhNAC79、LBA4404-pYL156、LBA4404-pYL156::PDS和LBA4404-pYL192。
2、VIGS侵染棉花子叶及抗旱性检测
根据文献(Gu et al.,2014,A versatile system for functional analysis ofgenes and microRNAs in cotton；Kumagai et al.,1995,Cytoplasmic inhibition ofcarotenoid biosynthesis with virus-derived RNA)的实验步骤，用LBA4404-pCLCrVA::GhNAC79、LBA4404-pCLCrVA和LBA4404-pCLCrVA::PDS分别与LBA4404-pCLCrVB等摩尔混合后侵染陆地棉品种中棉所10号棉花幼苗子叶，均侵染10株幼苗，分别得到基因沉默棉株、空载体对照棉株和指示棉株。将这三种棉花幼苗黑暗条件下放置过夜后，在培养室正常生长(22℃，16h光照/8h黑暗，低湿)，待侵染LBA4404-pCLCrVA::PDS的指示棉花幼苗叶片出现白化表型，利用实施例1中GhNAC79编码基因的表达模式的检测方法在转录水平检测GhNAC79编码基因在棉花叶片中的表达量并进行干旱处理，观察表型。干旱处理方法如下：对空载体对照棉株和基因沉默棉株根部均灌溉500mL的20％(质量百分比)PEG6000水溶液，待所有棉株出现显著性萎蔫(表现为棉株所有叶片严重失水，萎蔫：成熟叶片卷曲，下垂，干枯，幼嫩叶片卷曲。)后，每个棉株根部灌溉500mL无菌水进行复水，复水2天后拍照记录各棉株表型。
根据文献(Unver and Budak 2009,Virus-induced gene silencing,a posttranscriptional gene silencing method)的实验步骤，用LBA4404-pYL156::GhNAC79、LBA4404-pYL156和LBA4404-pYL156::PDS分别与LBA4404-pYL192等摩尔混合后侵染陆地棉品种中棉所10号棉花幼苗子叶，均侵染10株幼苗，分别得到基因沉默棉株、空载体对照棉株和指示棉株。将这三种棉花幼苗黑暗条件下放置过夜后，在培养室正常生长(22℃，16h光照/8h黑暗，低湿)，待侵染LBA4404-pYL156::PDS的指示棉花幼苗叶片出现白化表型，利用实施例1中GhNAC79编码基因的表达模式的检测方法在转录水平检测GhNAC79编码基因在棉花叶片中的表达量并进行干旱处理，观察表型。干旱处理方法如下：对空载体对照棉株和基因沉默棉株根部均灌溉500mL的20％(质量百分比)PEG6000水溶液，待基因沉默棉株出现显萎蔫后拍照记录各棉株表型。
结果如图7所示。
在pCLCrVA-pCLCrVB体系中，GhNAC79编码基因在基因沉默棉株中的表达量显著低于空载体对照(p<0.01)，对各棉花干旱处理后，待所有植株濒临死亡后，再复水，结果表明抑制GhNAC79的表达使转基因棉花对干旱抗性降低，并且复水后无法恢复生长，表明GhNAC79及其编码基因可以正调控棉花的抗干旱能力。
在pYL156-pYL192体系中，GhNAC79编码基因在基因沉默棉株中的表达量显著低于空载体对照(p<0.01),对各棉花进行干旱处理，基因沉默棉株出现显萎蔫时，载体对照棉株的叶片均未出现萎蔫表型，结果表明抑制GhNAC79编码基因的表达，棉花幼苗对干旱的抗性降低，表明GhNAC79及其编码基因可以正调控棉花的抗干旱能力。
实施例4、GhNAC79及其编码基因可以提高棉花对干旱的抗性
1、pBI121::GhNAC79过表达载体的构建
根据文献(Zhang 2008,Establishment of high frequency regenerationsystem and genetic analysis for mature leaf petioles in Upland cotton(G.hirsutum L.))的转化方法，利用实施例2的LBA4404-pBI121-GhNAC79对陆地棉中棉所24(CCRI24)进行转化，得到T0代转基因棉花，并利用实施例2的LBA4404-pBI 121作为空载体对照，得到空载体植株。
2、阳性棉花植株的检测
利用在pBI 121-GhNAC79中35S启动子和GhNAC79编码基因的序列上设计的引物(F(35S)：CCTAACAGAACTCGCCGTA；R：TCCCAATCTGAGTAAACCGAT)鉴定T0代阳性转基因棉花。
将T0代阳性转基因棉花并嫁接至根系旺发达的海岛棉枕木上，塑料袋密封条件下培养半个月后，打开塑料袋封口，待幼苗适应开放条件后，将生长良好的转基因株系移栽至营养土中，继续培养。
3、转基因棉花的抗旱性检测
将T0代阳性转基因棉花的两个株系Line8(株系8)和Line36(株系36)继代培养至T1代，利用步骤2的引物对对叶片基因组DNA进行检测筛选阳性植株，待阳性植株生长良好时，进行干旱处理，处理方法如下：将对照棉花、转基因棉花Line8和Line36各取6株，随机平均分为三组，即3个重复，每个重复包含6株棉株：对照2株，转基因株系Line8和Line36各2株。每组棉株放置于同一个塑料培养盆中，盆中倒入1L 20％(质量百分比)PEG6000水溶液进行干旱处理，培养室中正常生长，观察棉花的表型并拍照记录。
利用空载体植株作为对照，结果如图8所示。结果显示，干旱处理7天后，对照棉株最底部的真叶萎焉并下垂，转基因棉株相对正常生长，干旱处理14天后，对照棉株的底部真叶掉落，转基因棉株相对正常生长。进一步说明GhNAC79及其编码基因能够提高棉花对干旱的抗性。正常生长状况下，单位面积内转基因棉花和对照植株的叶片气孔数目和气孔开度没有明显差异；干旱处理14天后，转基因棉花叶片的气孔开度显著小于对照植株(与对照植株相比，Line8和Line36气孔开度分别达到了显著水平(p<0.05)和极显著水平(p<0.01))，转基因棉花叶片气孔平均为16个/64mm2，对照植株叶片气孔平均为14个/64mm2，说明GhNAC79及其编码基因可以通过调控气孔开度调控棉花干旱抗性。
<110> 中国农业科学院棉花研究所
<120> GhNAC79及其在调控植物抗旱性中的应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 793
<212> DNA
<213> 棉花
<400> 1
cacgggggac tctagaagac tggcatgaat aaacaagtat aggcatataa aaatggagga 60
tatgccacca gggtttcggt tctatcctac tgaagaagag ctggtttcgt tttatctcca 120
caagaagctt gaagctaaaa cagatgatga tctcaaccat gttatgaatc gtgttatacc 180
agttgtcgac atttataact tcaatccttg ggatcttcct caattctcag ataacctatg 240
tcataaagac ccagagcaat ggtttttctt cattccaagg caagagagtg aagctcgagg 300
agggagacca aagcggctaa catcatcggg gtactggaaa gccactggtt cacctggtta 360
tgtttactct tccaacagtc gccccatagg tgtcaaacga accatggtct tctacaacgg 420
aagagcccca aatgggaaga aaactgactg gaaaatgaac gaatataaag ctattcaaga 480
ccatgtttct ttagctaatg ccactacacc tcctatccta agacaagaat tcagcttgtg 540
ccgggtttat aagaaatcga aatgtttgag gtcattcgat agacggccgc cagggatatt 600
aaagatggga gaatcgatcc ctcgactcga taataatcac attaatcggt ttactcagat 660
tgggatgaac gataactcat cgacaaaaaa agacgttgtc gacgacgacg aatatgcatt 720
ttgggatgtt gatgggtttt ggaatcttta gagatgatgt gtagatggag aagctgagct 780
cgaatttccc cga 793
<210> 2
<211> 232
<212> PRT
<213> 棉花
<400> 2
Met Glu Asp Met Pro Pro Gly Phe Arg Phe Tyr Pro Thr Glu Glu Glu
1 5 10 15
Leu Val Ser Phe Tyr Leu His Lys Lys Leu Glu Ala Lys Thr Asp Asp
20 25 30
Asp Leu Asn His Val Met Asn Arg Val Ile Pro Val Val Asp Ile Tyr
35 40 45
Asn Phe Asn Pro Trp Asp Leu Pro Gln Phe Ser Asp Asn Leu Cys His
50 55 60
Lys Asp Pro Glu Gln Trp Phe Phe Phe Ile Pro Arg Gln Glu Ser Glu
65 70 75 80
Ala Arg Gly Gly Arg Pro Lys Arg Leu Thr Ser Ser Gly Tyr Trp Lys
85 90 95
Ala Thr Gly Ser Pro Gly Tyr Val Tyr Ser Ser Asn Ser Arg Pro Ile
100 105 110
Gly Val Lys Arg Thr Met Val Phe Tyr Asn Gly Arg Ala Pro Asn Gly
115 120 125
Lys Lys Thr Asp Trp Lys Met Asn Glu Tyr Lys Ala Ile Gln Asp His
130 135 140
Val Ser Leu Ala Asn Ala Thr Thr Pro Pro Ile Leu Arg Gln Glu Phe
145 150 155 160
Ser Leu Cys Arg Val Tyr Lys Lys Ser Lys Cys Leu Arg Ser Phe Asp
165 170 175
Arg Arg Pro Pro Gly Ile Leu Lys Met Gly Glu Ser Ile Pro Arg Leu
180 185 190
Asp Asn Asn His Ile Asn Arg Phe Thr Gln Ile Gly Met Asn Asp Asn
195 200 205
Ser Ser Thr Lys Lys Asp Val Val Asp Asp Asp Glu Tyr Ala Phe Trp
210 215 220
Asp Val Asp Gly Phe Trp Asn Leu
225 230

Claims (8)

1.蛋白质，是如下A1）、A2）、A3）、A4）：
A1）氨基酸序列是序列2的蛋白质；
A2）氨基酸序列是序列2的第143-232位的蛋白质；
A3）氨基酸序列是序列2的第1-187位的蛋白质；
A4）在A1）或A2）或A3）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1）至B6）中的任一种：
B1）编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；
B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；
B5）降低权利要求1所述蛋白质表达的核酸分子；所述核酸分子为序列表中序列1的第53-751位的DNA分子；
B6）含有B5）所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1）所述核酸分子为如下b1）-b3）中任一种：
b1）其编码序列是序列表中序列1的第53-751位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
b2）其编码序列是序列表中序列1的第479-751位或序列1的第479-767位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
b3）其编码序列是序列表中序列1的第53-613位或序列1的第23-613位核苷酸的cDNA分子或DNA分子。
4.植物抗旱产品，其特征在于：所述产品含有权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料；所述植物为棉花或拟南芥。
5.权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料在下述1）-15）中任一种中的应用：
1）调控植物抗旱性；
2）制备植物抗旱产品；
3）培育抗旱植物；
4）调控植物ABA敏感性；
5）制备植物ABA敏感产品；
6）培育ABA敏感植物；
7）调控植物气孔开度；
8）制备调控植物气孔开度产品；
9）培育气孔开度降低植物；
10）调控植物水分散失；
11）制备调控植物水分散失产品；
12）培育水分散失降低植物；
13）调控植物开花时间；
14）制备促进植物开花产品；
15）培育提前开花植物；
所述植物为棉花或拟南芥。
6.下述任一方法：
X1）一种培育抗旱性转基因植物的方法，包括：增加目的植物中权利要求1所述蛋白质的活性或增加目的植物中权利要求1所述蛋白质的含量或促进权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达，得到转基因植物；所述转基因植物抗旱性高于所述目的植物；
X2）培育抗旱性降低的植物的方法，包括：降低目的植物中权利要求1所述蛋白质的活性、降低目的植物中权利要求1所述蛋白质的含量、抑制目的植物中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达或敲除目的植物中权利要求1所述蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物的抗旱性低于所述目的植物；
所述植物为棉花或拟南芥。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述增加目的植物中权利要求1所述蛋白质的含量通过向所述目的植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因实现；
所述抑制目的植物中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达通过将序列表中序列1的第504-775位核苷酸所示的DNA片段导入所述目的植物实现。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：权利要求1所述蛋白质的编码基因为编码序列是序列表中序列1的第53-751位的DNA分子。
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