CN106692158A - 维生素b1、虫草酸、核黄素及其组合物在降尿酸药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种核黄素、维生素B₁、虫草酸及其组合物在降尿酸药物中的应用。体内实验结果表明：核黄素、维生素B₁和虫草酸均可降低血清中尿酸的含量，其中，核黄素的降尿酸作用最为显著，这三种化合物具有协同作用，且对肝、肾、脾无毒。实验结果表明，其降尿酸活性可能是由于对URAT1蛋白的抑制作用。

Description

维生素B1、虫草酸、核黄素及其组合物在降尿酸药物中的应用

【技术领域】

本发明属于医药保健领域，具体涉及到维生素B₁、虫草酸、核黄素及其组合物在降尿酸药物中的应用。

【背景技术】

痛风病严重困扰人类生活，新西兰、美国和中国的流行病学研究表明痛风病症变得越来越普遍，发病率约为2％，并不断升高。其中65岁及以上人群发生率最高，男性的发病率比女性发病率两倍还高。痛风病是高尿酸血症发展的结果，是由于体内尿酸浓度高于血液溶解能力(>360μmol/L)，导致尿酸钠晶体在软组织、关节沉积，这些沉积结晶引起软组织、关节和骨组织反复发炎性剧烈疼痛，严重降低患者生活质量。

痛风病分为急性和慢性两种。目前市场上针对急性痛风病治疗药物包括非甾体抗炎药、秋水仙素、促肾上腺皮质激素或类固醇，这些药物主要是作用于炎症因子，降低患者痛苦。对于慢性痛风病，管理血液尿酸水平是关键。目前，用来降低人体内尿酸浓度的药物主要有：抑制尿酸合成、促尿酸排泄以及类尿酸酶药物，包括别嘌呤醇、非布司他、苯溴马隆、丙磺舒、Lesinurad、尿酸酶、拉布立酶、PEG改性的尿酸酶等，这些药物存在对肝和肾代谢器官有较强副作用或在体内引起免疫反应产生抗体等问题，也容易引发胃肠道和心血管病。这使得患有肝病和肾病的患者、患有高血压、充血性心力衰竭、胃炎/溃疡或者肾功能不全的痛风患者使用上述药物通常具有较高危险性。因此，发现和开发新的高效、安全的降尿酸药物迫在眉睫。

【发明内容】

针对上述情况，本发明的目的是提供了维生素B₁、虫草酸、核黄素及其组合物在降尿酸药物中的应用。具体方案如下：

维生素B₁在降尿酸药物中的应用。

虫草酸在降尿酸药物中的应用。

核黄素在降尿酸药物中的应用。

一种具有降尿酸活性的组合物，包括以下至少一种化合物或其药学上可接受的盐、其N-氧化物类衍生物、其单一异构体或异构体混合物、其螯合物及其其非共价复合物：维生素B₁、虫草酸、核黄素。

优选的，所述具有降尿酸活性的组合物，包括维生素B₁、虫草酸、核黄素，且其比例为1:1:1。

一种降尿酸药物，至少包括维生素B₁、虫草酸、核黄素这三种化合物中的一种。

本发明所述的维生素B₁、虫草酸、核黄素及其组合物在应用时，可经任何常规给药途径施用，尤其是：消化道途径，例如口服，如采用片剂或胶囊剂形式；或者，非肠道途径，如采用注射剂或混悬液形式，局部给药如采用外用药水、凝胶、软膏或药膏或鼻用或栓剂形式。该药物组合物含有本发明化合物的任意形式或其药学可接受的盐，辅以至少一种以上药学上可接受的辅料或稀释剂，并通过混合、制粒或包衣方法等常规方式制备。

例如，口服剂型可以是片剂或明胶胶囊，含有与活性成分共存的：(1)稀释剂，如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素、甘氨酸等；(2)润滑剂，如硅胶、滑石粉、十八酸或其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇，等；对于片剂还包括(3)粘合剂，如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧基甲基纤维素纳、聚乙烯吡咯酮等；如果需要，还包括(4)崩解剂，如淀粉、琼脂、褐藻酸或褐藻酸盐或泡腾剂混合物，等；和/或(5)吸收剂、着色剂、香精和甜味剂。注射剂型可以是水性等渗溶液或混悬剂，栓剂可通过脂肪乳或混悬剂制备。这些药物组合物可经灭菌和/或含有佐剂，如保鲜剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂，助溶剂，调节渗透压的盐和/或缓冲液。此外，它们还可以包括其它治疗活性物质。经皮给药剂型为含有有效治疗剂量的本发明所述化合物或其组合物，并辅以辅料，药物载体包括易吸收的药学上可接受的溶剂以协助释放作用于宿主皮肤。局部使用的适宜剂型，如用于皮肤和眼睛，优选本领域熟知的水溶液、药膏、乳膏或凝胶剂。这些剂型可能含有助溶剂、稳定剂、增效剂剂、缓冲液和防腐剂。

本发明所述的维生素B₁、虫草酸、核黄素及其组合物可在有效治疗剂量下联合其它一种或一种以上的治疗剂一起施用(药物联合)。例如，与其它缓解症状物质、非留体类抗炎药物、抑制尿酸合成药物、抑制尿酸重吸收药物联合应用的协调效应，如：秋水仙碱；布洛芬，扶他林，吲哚美辛，塞来考昔；别嘌呤醇、非布司他；苯溴马隆、丙磺舒、Lesinurad、尿酸酶、拉布立酶、PEG改性的尿酸酶。当本发明的化合物与其他治疗法联合使用时，联合施用化合物的剂量取决于所用的联合药物的类型、联合应用的特定的药物，以及治疗者的身体状况等。

本发明的优点及应用效果：

(1)本发明发现了维生素B₁、虫草酸、核黄素均具有降低血清中尿酸含量的作用，其中，核黄素的降尿酸作用最为显著，且这三种化合物具有协同作用，因此，提供了一种维生素B₁、虫草酸、核黄素及其组合物在降尿酸药物中应用。

(2)毒理实验表明，本发明所述的维生素B₁、虫草酸、核黄素对对肝、肾、脾无毒，克服了现有降尿酸药物对肾脏或肝脏有害的缺陷。

【附图说明】

图1为相同剂量的维生素B₁、虫草酸、核黄素及其组合物对小鼠血清中尿酸浓度的影响。

图2为不同剂量的维生素B₁、虫草酸、核黄素对小鼠血清中尿酸浓度的影响。

图3为不同剂量的维生素B₁、虫草酸、核黄素对小鼠尿液中尿酸浓度的影响。

图4为不同剂量的维生素B₁、虫草酸、核黄素对小鼠肝脏XOD活性的影响。

图5为不同剂量的维生素B₁、虫草酸、核黄素对小鼠肾脏URAT1水平的影响。

图6为不同剂量的维生素B₁、虫草酸、核黄素对小鼠血尿素氮浓度的影响。

图7为不同剂量的维生素B₁、虫草酸、核黄素对小鼠血清肌酐浓度的影响。

图8为不同剂量的维生素B₁、虫草酸、核黄素对小鼠肝脏系数的影响。

图9为不同剂量的维生素B₁、虫草酸、核黄素对小鼠肾脏系数的影响

图10为不同剂量的维生素B₁、虫草酸、核黄素对小鼠脾脏系数的影响。

【具体实施方式】

为了验证本发明的应用效果，下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。在未作说明的情况下，本发明采用的试剂、设备和方法均为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。

实施例1

维生素B₁、虫草酸、核黄素及其组合物在相同剂量下(20mg/kg/d)对高尿酸小鼠的作用：

取70只雄性SPF昆明小鼠(20±2g，购自南方医科大学)，随机分为7组：正常对照组、模型对照组、阳性对照组、维生素B₁组、虫草酸组、核黄素组、组合物组(维生素B₁、虫草酸、核黄素的质量比为1:1:1)。除正常对照组腹腔注射和灌胃生理盐水外，其他组按照100mg/kg/d的剂量腹腔注射氧嗪酸钾盐，同时灌胃600mg/kg/d剂量的次黄嘌呤建立高尿酸血症小鼠模型。造模前一个小时禁食不禁水，造模后1小时，阳性对照组灌胃5mg/kg/d剂量的别嘌呤醇(AL)，维生素B₁组灌胃20mg/kg/d剂量的维生素B₁，虫草酸组灌胃20mg/kg/d剂量的虫草酸，核黄素组灌胃20mg/kg/d剂量的核黄素，组合物组灌胃20mg/kg/d剂量的维生素B₁、虫草酸、核黄素的组合物(1:1:1)，正常对照组和模型对照组则灌胃相同体积的生理盐水，连续7天。第7天灌胃给药1小时后，麻醉摘眼球取血，使用离心机在3500r/min速度下离心10min分离得到血清，检测各组小鼠血清中尿酸浓度。

高尿酸血症动物模型对研究尿酸代谢及相关疾病极重要。由于尿酸在啮齿类动物体内肝脏中可进一步降解为尿囊素的尿酸酶，因此在这些动物建立高尿酸模型模型是比较困难的。氧嗪酸钾是尿酸酶阻断剂，常用于提高模型小鼠血清高尿酸水平；次黄嘌呤是尿酸黄嘌呤氧化酶氧化成尿酸的嘌呤分解代谢途径的前体。人类高尿酸血症是因为食用富嘌呤食物或从尿酸经肾排泄水平低。模仿人类的小鼠高尿酸血症的病理，本实施例通过联合使用氧嗪酸钾和次黄嘌呤建立了高尿酸血症小鼠模型。由于只需要很短的时间和较少的氧嗪酸钾和次黄嘌呤，因此该模型特别适合于药物的筛选。

结果如图1所示(*和**表示与正常对照组相比，差异显著分别为P<0.05和P<0.01；#和##表示与模型对照组相比，差异显著分别为P<0.05和P<0.01；Δ和ΔΔ表示与阳性对照组相比，差异显著分别为P<0.05和P<0.01)。与正常对照组相比，模型对照组血清尿酸水平达到386.8μmol/L，高于正常对照组326.1μmol/L，差异显著性为P<0.05，这表明高尿酸血症小鼠模型造模成功。与模型对照组相比，阳性对照组中，别嘌呤醇成功地使高尿酸小鼠血清尿酸水平从386.8μmol/L降到230.6μmol/L，差异显著性为P<0.01，这进一步说明高尿酸血症小鼠模型造模成功，并且商业药别嘌呤醇成功地使高尿酸血症小鼠血液尿酸水平降低。维生素B₁使高尿酸小鼠血清尿酸水平从386.8μmol/L降为258.6μmol/L，这与模型对照组相比差异显著性为P<0.01；甘露醇使高尿酸血症小鼠血清尿酸水平从386.8μmol/L降为216.7μmol/L，这与模型对照组相比差异显著性为P<0.01；核黄素使高尿酸血症小鼠血清尿酸水平从386.8μmol/L降为166.7μmol/L，这与模型对照组相比差异显著性为P<0.01，与阳性对照组相比差异显著性P<0.01，说明维生素B₁、甘露醇、核黄素均可有效地降低了高尿酸小鼠的血清尿酸水平，并且核黄素的降尿酸活性比别嘌呤醇更强。组合物组小鼠血清尿酸水平从高尿酸血症小鼠386.8μmol/L降为128.6μmol/L，这与模型对照组相比差异显著性为P<0.01，与阳性对照组相比差异显著性P<0.01，即组合物的降尿酸活性也高于比别嘌呤醇，且维生素B₁、甘露醇和核黄素三种化合物的降尿酸活性具有协同效应。

综上所述，维生素B₁、甘露醇、核黄素均具有良好的降尿酸效果，其降尿酸效果可以使高尿酸模型组血液尿酸浓度降低到低于正常小鼠尿酸水平，其中核黄素降尿酸活性优于别嘌呤醇，并且三种化合物表现出协同效应。

实施例2

维生素B₁、虫草酸、核黄素及其组合物在不同剂量下对高尿酸小鼠的影响、作用机制及毒理实验：

试剂来源：氧嗪酸钾和次黄嘌呤从奥德里奇试剂公司购买，别嘌呤醇由东京化工有限公司提供，苯溴马隆核黄素、维生素B1和虫草酸从阿拉丁试剂有限公司购买。血清尿酸水平检测试剂盒从南京建成生物工程研究所购买。XOD检测试剂盒和URAT1蛋白质检测试剂盒从R&D System公司购买。

实验动物：所有动物实验计划均经过广东微生物研究所伦理委员会批准(GT-IACUC201608151)。用于这项研究的雄性SPF级昆明小鼠(20±2g)购自广东省医学实验动物中心，实验前1周，所有的动物屏障环境中饲养，并允许自由进食食物和水，环境温度控制在24-26摄氏度，给药之前，小鼠禁食1h，自由给水。

本实施例分别采用别嘌呤醇和苯溴马隆(FDA批准的高尿酸血症药物)作为阳性对照组。将实验小鼠随机分为13组(每组10只)：正常对照组，模型对照组，别嘌呤醇对照组，苯溴马隆对照组，核黄素低、中、高剂量组，维生素B₁低、中、高剂量组和虫草酸低、中、高剂量组。给药前一小时进行造模，造模方法同实施例1。

每个小鼠每天给药一次，持续一周。其中，正常对照组和模型对照组小鼠灌胃同样体积的生理盐水(0.9％)，别嘌呤醇对照组小鼠给药别嘌呤醇(5mg/kg)，苯溴马隆对照组小鼠给药苯溴马隆(7.8mg/kg)，核黄素低、中、高剂量组小鼠分别灌胃5、10和20mg/kg剂量的核黄素，维生素B₁低、中、高剂量组小鼠分别灌胃11、22和44mg/kg剂量的维生素B₁，虫草酸低、中、高剂量组小鼠分别灌胃10、20和40mg/kg剂量的虫草酸。

所有的小鼠7天后处死，收集血液和尿液。血液样本在2400转4℃下离心10分钟，收集血清。分别测定血清尿酸水平、尿液尿酸水平、血尿素氮水平和血清肌酐水平。实验7天后，摘除小鼠脏器官，包括肝脏、肾脏和脾脏。所有的器官在生理盐溶液清洗，并用普通过滤器滤干，然后称重。器官系数(肝脏系数、肾脏系数和脾脏系数)为器官与体重比。收集肝、肾、脾内脏组织，称重后在冷生理盐水(0.9％)中匀浆并离心，收集上清液，使用ELISA试剂盒测定XOD(黄嘌呤氧化酶)和URAT1(尿酸转运蛋白1)活性。

统计分析是使用专业的数据处理软件SPSS。所有数据被表示为平均值±平均值标准误差(S.D)。使用单因素方差分析进行分析，组间差异性用双尾测验比较，在P<0.05或P<0.01水平认为是有显著差异。

如图2所示，模型对照组小鼠血液尿酸水平(240μmol/L，P＜0.01)小鼠与正常对照组小鼠血液尿酸水平(160μmol/L)相比显著提高，说明造模成功。别嘌呤醇对照组(5mg/kg)和苯溴马隆(7.8mg/kg)组(阳性对照)小鼠血液尿酸水平分别为137和151μmol/L，显著低于模型对照组小鼠(240μmol/L，P＜0.01)，也比正常对照组小鼠血清尿酸水平低。另外，核黄素低、中、高剂量(5、10和20mg/kg剂量)组小鼠，血清尿酸水平分别为172，163和146μmol/L，显著低于模型对照组(P＜0.01)，接近正常对照组水平；维生素B1低、中、高剂量(11、22和44mg/kg剂量)组小鼠，血清尿酸水平分别为167，154和142μmol/L，显著低于模型对照组(P＜0.01)，接近正常对照组水平；虫草酸低、中、高剂量(10、20和40mg/kg剂量)组小鼠，血清尿酸水平分别为178，166和164μmol/L，显著低于模型对照组(P＜0.01)，接近正常对照组水平。

由于尿酸排泄通过肾脏与血尿酸水平直接相关，本实施例检测了不同剂量的维生素B₁、虫草酸、核黄素对高尿酸血症小鼠尿酸排泄(尿液尿酸水平)的影响，结果如图3所示。由于氧嗪酸钾是肝脏尿酸酶的竞争性抑制剂和一种电致尿酸转运/通道阻断剂，次黄嘌呤是尿酸黄嘌呤氧化酶氧化成尿酸的嘌呤分解代谢途径的前体，故与正常对照组相比(146μmol/L)，氧嗪酸钾和次黄嘌呤使小鼠的尿酸排泄明显增加，模型对照组小鼠的尿液尿酸含量为295μmol/L，(P＜0.01)。由于别嘌呤醇抑制肝脏XOD活性而导致尿酸生成降低，因此别嘌呤醇使小鼠尿液尿酸水平显著降低(112μmol/L，P＜0.01)。苯溴马隆本身抑制肾中URAT1活性，从而降低尿酸的重吸收，使小鼠尿液尿酸水平显著增加(204μmol/L，P＜0.01)。不同剂量的核黄素分别将小鼠尿液尿酸水平提高至261，326和202μmol/L(P＜0.01)；不同剂量的维生素B₁分别将小鼠尿液尿酸水平提高至182，194和160μmol/L(P＜0.01)；不同剂量的虫草酸分别将小鼠尿液尿酸水平提高至200，195和229160μmol/L(P＜0.01)。表明维生素B₁、虫草酸、核黄素主要作用在于抑制尿酸重吸收，进而促进肾脏尿酸排泄。

由于黄嘌呤氧化酶是尿酸的嘌呤核苷酸代谢的关键酶，黄嘌呤氧化酶水平的变化可能会明显改变血清尿酸水平。因此，本实施例检测了维生素B₁、虫草酸、核黄素对肝脏XOD活性的影响，结果如图4所示。在模型对照组小鼠(206pg/ml)中，XOD活性是正常对照组小鼠(185pg/ml)的112％(P＜0.05)。与模型对照组小鼠相比，别嘌呤醇显著降低肝脏XOD活性至153pg/ml(P＜0.05)，低于正常水平。然而，维生素B₁、虫草酸、核黄素在不同剂量均未显示对黄嘌呤氧化酶有显著的抑制作用，表明这三种化合物不是通过抑制XOD活性而实现降尿酸作用的。

肾小管的URAT1对肾脏的尿酸重吸收起到重要作用，是高尿酸血症和痛风病的重要指标之一。本实施例检测了维生素B₁、虫草酸、核黄素对肾器官URAT1水平的影响，结果如图5所示。与正常对照组比较(72.84pg/ml)，模型对照组小鼠的肾脏URAT1水平(95.26pg/ml)显著升高(P＜0.01)，与氧嗪酸钾提高URAT1蛋白水平的事实一致。别嘌醇对照组(55.36pg/ml)组和苯溴马隆对照组(52.94pg/ml)低于模型对照组(P＜0.01)。不同剂量的核黄素分别将小鼠URAT1水平降至64.17、60.10和49.04pg/mL(P＜0.01)；不同剂量的维生素B₁分别将小鼠URAT1水平降至57.85、52.67和50.78pg/mL(P＜0.01)；不同剂量的虫草酸分别将小鼠URAT1水平降至57.39、52.20和53.28pg/mL(P＜0.01)。呈剂量依赖关系，表明维生素B₁、虫草酸、核黄素这三种化合物的降尿酸作用机理可能归因于对URAT1蛋白的抑制作用。

血尿素氮是肾健康关键指标，肾损伤往往伴有血尿素氮水平的增加。如图6所示，正常对照组及模型对照组小鼠的血尿素氮分别为7.56和8.40mmol/L，无显著差异。别嘌醇对照组小鼠的血尿素氮(22.57mmol/L，P＜0.01)为正常对照组的298％，表明别嘌呤醇使小鼠的肾功能受损。苯溴马隆组小鼠的血尿素氮是8.31mmol/L，与对照组无显著差异。核黄素低、中、高剂量组小鼠的血尿素氮水平分别为10.50、6.98和8.02mmol/L；维生素B₁低、中、高剂量组小鼠的血尿素氮水平分别为7.99、8.02和9.87mmol/L；虫草酸低、中、高剂量组小鼠的血尿素氮水平分别为8.98、9.02和8.35mmol/L，远低于别嘌呤醇组(P<0.01)，和正常对照相近，表明这三种化合物几乎不会对肾功能产生影响。

血清肌酐水平是肾功能的关键指标，各组小鼠血清肌酐水平如图7所示。由于次黄嘌呤部分替代了氧嗪酸钾，模型对照组小鼠血清肌酐水平为57.3μmol/L，与正常组(57.1μmol/L)无显著性差异。别嘌呤醇对照组小鼠血清肌酐水平为97.4μmol/L，较正常对照组(P＜0.01)和模型对照组显著升高(P＜0.01)，表明别嘌呤醇可能伤肾。苯溴马隆组小鼠的血清肌酐水平为56.1μmol/L，与对照组无显著差异。核黄素低、中、高剂量组小鼠的血清肌酐水平分别为58.0、60.4和64.4μmol/L；维生素B₁低、中、高剂量组小鼠的血清肌酐水平分别为53.8、54.7和55.4μmol/L；虫草酸低、中、高剂量组小鼠的血清肌酐水平分别为56.6、56.5和56.2μmol/L，远低于别嘌呤醇组(P<0.01)，和正常对照相近，进一步表明这三种化合物可能不损害肾功能。

内脏器官重量的变化是一个敏感的指标，在毒理学实验中，给药组和未给药的动物之间的器官重量的比较，通常被用来评估的药物毒性作用的大小。因此，本实施例通过检测小鼠肝脏、肾脏和脾脏系数，评估核黄素、维生素B₁和虫草酸的毒性，结果如图8-10所示。

如图8所示，正常对照组和模型对照组小鼠之间肝脏系数差异显著，这与氧嗪酸钾的肝脏毒性有关，此外，肝脏毒性也在苯溴马隆组观察到。但是不同剂量的核黄素、维生素B₁和虫草酸对肝脏系数均无显著影响，表明核黄素、维生素B₁和虫草酸具有一定的缓解氧嗪酸钾肝脏毒性的作用。

如图9所示，别嘌醇对照组小鼠的肾脏系数(2.09％)明显高于正常对照组(1.45％)和模型对照组(1.47％，P＜0.01)小鼠，此外，别嘌呤醇对照组还观测到水肿性肾炎，说明别嘌呤醇对肾功能产生负面影响。苯溴马隆组小鼠的肾脏系数为1.49，与对照组无显著差异。核黄素低、中、高剂量组小鼠的肾脏系数分别为1.37、1.38和1.43％；维生素B₁低、中、高剂量组小鼠的肾脏系数分别为1.47、1.30和1.42％；虫草酸低、中、高剂量组小鼠的血清肾脏系数分别为1.37、1.42和1.37％，均与正常组无显著性差异，并低于所有的别嘌呤醇组(P＜0.01)，进一步说明这三种化合物对肾功能无影响。

脾是动物的重要免疫器官，它们的体重系数可以相对反映机体的免疫功能。本实施例中，如图10所示，观察到各处理组小鼠之间肝脏系数无显著性差异。说明核黄素、维生素B₁和虫草酸几乎不影响脾功能，不会引起炎症。

综上所述，核黄素、维生素B₁和虫草酸均可降低血清中尿酸的含量，其中，核黄素的降尿酸作用最为显著，这三种化合物具有协同作用，且对肝、肾、脾无毒。实验结果表明，其降尿酸活性可能是由于对URAT1蛋白的抑制作用。

以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.维生素B₁在降尿酸药物中的应用。

2.虫草酸在降尿酸药物中的应用。

3.核黄素在降尿酸药物中的应用。

4.一种具有降尿酸活性的组合物，其特征在于，包括以下至少一种化合物或其药学上可接受的盐、其N-氧化物类衍生物、其单一异构体或异构体混合物、其螯合物及其其非共价复合物：维生素B₁、虫草酸、核黄素。

5.根据权利要求4所述的具有降尿酸活性的组合物，其特征在于，包括维生素B₁、虫草酸、核黄素，且其比例为1:1:1。

6.一种降尿酸药物，其特征在于，所述降尿酸药物至少包括维生素B₁、虫草酸、核黄素这三种化合物中的一种。