CN106645482A - 一种二十七味定坤丸中四种人参皂苷类成分的含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种二十七味定坤丸中人参皂苷类成分的含量测定方法。二十七味定坤丸是一种中药丸剂，由27味中药制成，在临床上多用于治疗妇科顽症月经不调疾病。二十七味定坤丸中含有西洋参，本发明采用超高效液相色谱‑质谱联用法同时测定二十七味定坤丸中人参皂苷Re、人参皂苷Rg₁、拟人参皂苷F₁₁、人参皂苷Rb₁四种皂苷类成分含量，方法灵敏度高，准确可行，可用于二十七味定坤丸的质量控制。

Description

一种二十七味定坤丸中四种人参皂苷类成分的含量测定方法

技术领域

本发明涉及到一种二十七味定坤丸中人参皂苷类成分的含量测定方法，属中药技术领域，具体的，涉及一种二十七味定坤丸中人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、拟人参皂苷F₁₁、人参皂苷Rb₁四种成分同时测定的含量测定方法。

背景技术

二十七味定坤丸原收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂(第一册)，现收载于《中国药典》2015年版一部，由西洋参、白术、茯苓、熟地黄、当归、白芍、川芎、黄芪、阿胶、五味子(醋炙)、鹿茸(去毛)、肉桂、艾叶(炒炭)、杜仲(炒炭)、续断、佛手、陈皮、厚朴(姜炙)、柴胡、香附(醋炙)、延胡索(醋炙)、牡丹皮、琥珀、龟板(沙烫醋淬)、地黄、麦冬、黄芩共计二十七味药材制成，又称定坤丸，具有补气养血，舒郁调经，用于冲任虚损，气血两亏，身体瘦弱，月经不调，经期紊乱，行经腹痛，崩漏不止，腰酸腿软的功能。《中国药典》2015年版中二十七味定坤丸的标准中仅对人参皂苷Re进行了测定，众所周知，人参皂苷Re并非西洋参中的特有成分，因此，有必要增加二十七味定坤丸中其它人参皂苷类成分的测定，特别是西洋参的特征成分拟人参皂苷F11，有利于控制产品质量，保障药品安全有效，质量可控。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种二十七味定坤丸中四种人参皂苷类成分的含量测定方法，四种人参类皂苷成分为人参皂苷Re、人参皂苷Rg₁、拟人参皂苷F₁₁、人参皂苷Rb₁；

本发明测定方法采用超高效液相色谱法-质谱联用法，其色谱条件如下：

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为乙腈，流动相B为水，进行梯度洗脱，洗脱梯度为：0～2分钟，流动相A：20％→50％，流动相B：80％→50％；流速：0.5ml/min；质谱条件，离子源：电喷雾离子源(ESI源)；监测模式：负离子多反应监测模式；脱溶剂气温度：500℃；毛细管电压：3.00kV；锥孔电压：60V；监测离子对及相关电压参数设定如下表：

标准储备溶液：分别称取人参皂苷Re、人参皂苷Rg₁、拟人参皂苷F₁₁、人参皂苷Rb₁标准品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，摇匀，即得标准储备溶液；

系列标准溶液：按照人参皂苷Re系列标准溶液浓度为0.01μg/ml～1.00μg/ml、人参皂苷Rg₁系列标准溶液浓度为0.01μg/ml～1.00μg/ml、拟人参皂苷F₁₁系列标准溶液浓度为0.005μg/ml～1.00μg/ml、人参皂苷Rb₁系列标准溶液浓度为0.01μg/ml～1.00μg/ml，分别精密量取一定体积的标准储备溶液置10mL量瓶中，以20％乙腈水溶液稀释并定容至刻度，得不同浓度的系列标准溶液；

供试品溶液的制备：取样品适量，研细，取1.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25mL，密塞，称定重量，加热回流60～90分钟，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液；再精密量取续滤液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀释并定容至刻度，0.2μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液；

测定法分别精密吸取系列标准溶液与供试品溶液各2～5μl，注入超高效液相色谱-质谱联用仪，测定，以标准曲线法计算含量，即得。

本发明含量测定方法中，供试品溶液制备中加热回流提取时间优选为75min；测定法中分别精密吸取系列标准溶液与供试品溶液的量优选为5μl，注入超高效液相色谱-质谱联用仪。

本发明含量测定方法最优的技术方案为：

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为乙腈，流动相B为水，进行梯度洗脱，洗脱梯度为：0～2分钟，流动相A：20％→50％，流动相B：80％→50％；流速：0.5ml/min；质谱条件，离子源：电喷雾离子源(ESI源)；监测模式：负离子多反应监测模式；脱溶剂气温度：500℃；毛细管电压：3.00kV；锥孔电压：60V；监测离子对及相关电压参数设定如下表：

标准储备溶液：分别称取人参皂苷Re、人参皂苷Rg₁、拟人参皂苷F₁₁、人参皂苷Rb₁标准品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，摇匀，即得标准储备溶液；

系列标准溶液：按照人参皂苷Re系列标准溶液浓度为0.01μg/ml～1.00μg/ml、人参皂苷Rg₁系列标准溶液浓度为0.01μg/ml～1.00μg/ml、拟人参皂苷F₁₁系列标准溶液浓度为0.005μg/ml～1.00μg/ml、人参皂苷Rb₁系列标准溶液浓度为0.01μg/ml～1.00μg/ml，分别精密量取一定体积的标准储备溶液置10mL量瓶中，以20％乙腈水溶液稀释并定容至刻度，得不同浓度的系列标准溶液；

供试品溶液的制备：取样品适量，研细，取1.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25mL，密塞，称定重量，加热回流75分钟，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液；再精密量取续滤液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀释并定容至刻度，0.2μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液；

测定法 分别精密吸取系列标准溶液与供试品溶液各5μl，注入超高效液相色谱-质谱联用仪，测定，以标准曲线法计算含量，即得。

为了验证测定含量方法的稳定性、准确性、专属性及系统适应性，对方法进行了以下方法学验证实验，以确保该含量测定方法可以用于二十七味定坤丸的质量控制。

1仪器与试药

1.1仪器：Waters Acquity UPLC/XEVO TQ-S超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪；分析天平：Mettler AE240(感量0.0001g)；精密移液器；超纯水仪：Integral 10(MILLIPORE)；色谱柱：Waters BEH C₁₈(1.7μm，2.1×100mm)。

1.2试药与试剂

对照品：人参皂苷Re(中检院提供，批号：110754-201525，标示量92.3％)

人参皂苷Rg₁(中检院提供，批号：110703-201530，标示量91.7％)

人参皂苷Rb₁(中检院提供，批号：110704-201424，标示量93.7％)

拟人参皂苷F₁₁(中检院提供，批号：110841-201406)

试剂：甲醇、乙腈均为为色谱纯，水为超纯水。

2方法确定

2.1色谱条件

色谱柱：Waters BEH C18(1.7μm，2.1×100mm)

色谱条件：流动相A为乙腈，流动相B为水，梯度洗脱程序(见表1)。

柱温：40℃；进样量：5μL。

表1梯度洗脱程序

2.2质谱参考条件

离子源：电喷雾离子源(ESI源)；

监测模式：负离子，多反应监测模式；监测离子对及相关电压参数设定(见表2)；

脱溶剂气温度：500℃；

毛细管电压：3.00kV；

锥孔电压：60V；

表2西洋参中4种成分定性和定量离子及质谱条件

2.3流动相的优化

经反复试验，最终选定正文方法，能够在2分钟内完成测定，建立的方法能够快速、准确、高效的完成目标成分的检测。

2.4对照品溶液的配制：

标准储备溶液：分别称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、拟人参皂苷F11、人参皂苷Rb1标准品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，摇匀，即得标准储备溶液。

系列标准溶液：分别精密量取一定体积的标准储备溶液置10mL量瓶中，以20％乙腈水溶液稀释并定容至刻度，得不同浓度的系列标准溶液。

2.5供试品溶液的制备

取样品适量，研细，取1.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25mL，密塞，称定重量，置水浴中加热回流75分钟，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液；再精密量取续滤液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀释并定容至刻度，0.2μm微孔滤膜过滤，滤液作为待测液，备用。

3方法学考察

3.1专属性考察

分别取混合对照品溶液、二十七味定坤丸样品，按“2.5”方法项下处理，进样分析。4种成分峰形良好，无干扰物质，色谱峰依次为人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、拟人参皂苷F11、人参皂苷Rb1，见图1-2。

3.2标准曲线

吸取不同浓度的系列标准溶液5μl，分别注入超高效液相串联质谱仪，进行分析，以各成分进样浓度(μg/ml)为横坐标，各成分峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，建立标准曲线，其线性相关系数r均大于0.999。标准曲线见表3，图3-6。

表3各成分线性关系考察结果

3.4重复性

同一批样品，研细，取低、中、高称样量各3份，取样量分别为0.9、1.2、1.5g，按“2.5”项下方法处理，进样分析，计算含量与相对标准偏差。结果各成分RSD值均小于6％，表明方法重复性良好。

3.5回收率

取重复性项下样品粉末，取9份，取样量为0.6g，精密称定，每3份为1组，分别加入用80％甲醇溶液配制的低、中、高3个浓度的混合对照品溶液25ml，按“2.5”项下方法处理，进样分析。结果4种成分的3个浓度水平的9份溶液平均回收率在95-100％，并且RSD小于5％。表明方法回收率良好，结果见表4。

表4各组分标准曲线结果

3.6稳定性

取同一份供试品溶液，于0小时开始测定，在0、0.5、1、4、8、24小时进样测定，记录峰面积。结果人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷F₁₁峰面积RSD分别为3.9％、2.6％、3.3％、4.2％，表明供试品溶液在24小时内稳定。

4样品测定

用超高效液相色谱-质谱法对5批样品进行测定，结果见表5。

表5样品测定结果

附图说明

图1混合对照色谱图；

图2二十七味定坤丸样品色谱图；

图3人参皂苷Rg₁标准曲线；

图4人参皂苷Re标准曲线；

图5人参皂苷Rb₁标准曲线；

图6拟人参皂苷F₁₁标准曲线。

具体实施方式

实施例1

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为乙腈，流动相B为水，进行梯度洗脱，洗脱梯度为：0～2分钟，流动相A：20％→50％，流动相B：80％→50％；流速：0.5ml/min；质谱条件，离子源：电喷雾离子源(ESI源)；监测模式：负离子多反应监测模式；脱溶剂气温度：500℃；毛细管电压：3.00kV；锥孔电压：60V；监测离子对及相关电压参数设定如下表：

标准储备溶液：分别称取人参皂苷Re、人参皂苷Rg₁、拟人参皂苷F₁₁、人参皂苷Rb₁标准品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，摇匀，即得标准储备溶液；

系列标准溶液：按照人参皂苷Re系列标准溶液浓度为0.01μg/ml～1.00μg/ml、人参皂苷Rg₁系列标准溶液浓度为0.01μg/ml～1.00μg/ml、拟人参皂苷F₁₁系列标准溶液浓度为0.005μg/ml～1.00μg/ml、人参皂苷Rb₁系列标准溶液浓度为0.01μg/ml～1.00μg/ml，分别精密量取一定体积的标准储备溶液置10mL量瓶中，以20％乙腈水溶液稀释并定容至刻度，得不同浓度的系列标准溶液；

供试品溶液的制备：取样品适量，研细，取1.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25mL，密塞，称定重量，加热回流75分钟，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液；再精密量取续滤液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀释并定容至刻度，0.2μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液；

测定法 分别精密吸取系列标准溶液与供试品溶液各5μl，注入超高效液相色谱-质谱联用仪，测定，以标准曲线法计算含量，即得。

实施例2

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为乙腈，流动相B为水，进行梯度洗脱，洗脱梯度为：0～2分钟，流动相A：20％→50％，流动相B：80％→50％；流速：0.5ml/min；质谱条件，离子源：电喷雾离子源(ESI源)；监测模式：负离子多反应监测模式；脱溶剂气温度：500℃；毛细管电压：3.00kV；锥孔电压：60V；监测离子对及相关电压参数设定如下表：

标准储备溶液：分别称取人参皂苷Re、人参皂苷Rg₁、拟人参皂苷F₁₁、人参皂苷Rb₁标准品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，摇匀，即得标准储备溶液；

系列标准溶液：按照人参皂苷Re系列标准溶液浓度为0.01μg/ml～1.00μg/ml、人参皂苷Rg₁系列标准溶液浓度为0.01μg/ml～1.00μg/ml、拟人参皂苷F₁₁系列标准溶液浓度为0.005μg/ml～1.00μg/ml、人参皂苷Rb₁系列标准溶液浓度为0.01μg/ml～1.00μg/ml，分别精密量取一定体积的标准储备溶液置10mL量瓶中，以20％乙腈水溶液稀释并定容至刻度，得不同浓度的系列标准溶液；

供试品溶液的制备：取样品适量，研细，取1.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25mL，密塞，称定重量，加热回流60分钟，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液；再精密量取续滤液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀释并定容至刻度，0.2μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液；

测定法 分别精密吸取系列标准溶液与供试品溶液各5μl，注入超高效液相色谱-质谱联用仪，测定，以标准曲线法计算含量，即得。

实施例3

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为乙腈，流动相B为水，进行梯度洗脱，洗脱梯度为：0～2分钟，流动相A：20％→50％，流动相B：80％→50％；流速：0.5ml/min；质谱条件，离子源：电喷雾离子源(ESI源)；监测模式：负离子多反应监测模式；脱溶剂气温度：500℃；毛细管电压：3.00kV；锥孔电压：60V；监测离子对及相关电压参数设定如下表：

标准储备溶液：分别称取人参皂苷Re、人参皂苷Rg₁、拟人参皂苷F₁₁、人参皂苷Rb₁标准品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，摇匀，即得标准储备溶液；

系列标准溶液：按照人参皂苷Re系列标准溶液浓度为0.01μg/ml～1.00μg/ml、人参皂苷Rg₁系列标准溶液浓度为0.01μg/ml～1.00μg/ml、拟人参皂苷F₁₁系列标准溶液浓度为0.005μg/ml～1.00μg/ml、人参皂苷Rb₁系列标准溶液浓度为0.01μg/ml～1.00μg/ml，分别精密量取一定体积的标准储备溶液置10mL量瓶中，以20％乙腈水溶液稀释并定容至刻度，得不同浓度的系列标准溶液；

供试品溶液的制备：取样品适量，研细，取1.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25mL，密塞，称定重量，加热回流90分钟，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液；再精密量取续滤液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀释并定容至刻度，0.2μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液；

测定法 分别精密吸取系列标准溶液与供试品溶液各2μl，注入超高效液相色谱-质谱联用仪，测定，以标准曲线法计算含量，即得。

上述实施例均按照药典进行方法学验证，结果显示方法准确可靠、灵敏、专属，各项指标均符合质量控制的要求。

Claims (3)

1.一种二十七味定坤丸中四种人参皂苷类成分的含量测定方法，四种人参类皂苷成分为人参皂苷Re、人参皂苷Rg₁、拟人参皂苷F₁₁、人参皂苷Rb₁；该方法采用超高效液相色谱法-质谱联用法，其特征在于该含量测定方法如下：

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为乙腈，流动相B为水，进行梯度洗脱，洗脱梯度为：0～2分钟，流动相A：20％→50％，流动相B：80％→50％；流速：0.5ml/min；质谱条件，离子源：电喷雾离子源(ESI源)；监测模式：负离子多反应监测模式；脱溶剂气温度：500℃；毛细管电压：3.00kV；锥孔电压：60V；监测离子对及相关电压参数设定如下表：

标准储备溶液：分别称取人参皂苷Re、人参皂苷Rg₁、拟人参皂苷F₁₁、人参皂苷Rb₁标准品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，摇匀，即得标准储备溶液；

系列标准溶液：按照人参皂苷Re系列标准溶液浓度为0.01μg/ml～1.00μg/ml、人参皂苷Rg₁系列标准溶液浓度为0.01μg/ml～1.00μg/ml、拟人参皂苷F₁₁系列标准溶液浓度为0.005μg/ml～1.00μg/ml、人参皂苷Rb₁系列标准溶液浓度为0.01μg/ml～1.00μg/ml，分别精密量取一定体积的标准储备溶液置10mL量瓶中，以20％乙腈水溶液稀释并定容至刻度，得不同浓度的系列标准溶液；

供试品溶液的制备：取样品适量，研细，取1.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25mL，密塞，称定重量，加热回流60～90分钟，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液；再精密量取续滤液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀释并定容至刻度，0.2μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液；

测定法 分别精密吸取系列标准溶液与供试品溶液各2～5μl，注入超高效液相色谱-质谱联用仪，测定，以标准曲线法计算含量，即得。

2.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于所述供试品溶液制备中加热回流时间为75min。

3.根据权利要求1-2任一项所述的含量测定方法，其特征在于该含量测定方法如下：

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为乙腈，流动相B为水，进行梯度洗脱，洗脱梯度为：0～2分钟，流动相A：20％→50％，流动相B：80％→50％；流速：0.5ml/min；质谱条件，离子源：电喷雾离子源(ESI源)；监测模式：负离子多反应监测模式；脱溶剂气温度：500℃；毛细管电压：3.00kV；锥孔电压：60V；监测离子对及相关电压参数设定如下表：

标准储备溶液：分别称取人参皂苷Re、人参皂苷Rg₁、拟人参皂苷F₁₁、人参皂苷Rb₁标准品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，摇匀，即得标准储备溶液；

系列标准溶液：按照人参皂苷Re系列标准溶液浓度为0.01μg/ml～1.00μg/ml、人参皂苷Rg₁系列标准溶液浓度为0.01μg/ml～1.00μg/ml、拟人参皂苷F₁₁系列标准溶液浓度为0.005μg/ml～1.00μg/ml、人参皂苷Rb₁系列标准溶液浓度为0.01μg/ml～1.00μg/ml，分别精密量取一定体积的标准储备溶液置10mL量瓶中，以20％乙腈水溶液稀释并定容至刻度，得不同浓度的系列标准溶液；

供试品溶液的制备：取样品适量，研细，取1.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25mL，密塞，称定重量，加热回流75分钟，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液；再精密量取续滤液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀释并定容至刻度，0.2μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液；

测定法 分别精密吸取系列标准溶液与供试品溶液各2～5μl，注入超高效液相色谱-质谱联用仪，测定，以标准曲线法计算含量，即得。