CN106645449B

CN106645449B - 一种磁性固相萃取结合同位素二甲基化标记分析磺胺类物质的方法

Info

Publication number: CN106645449B
Application number: CN201610867566.3A
Authority: CN
Inventors: 吴明火; 粟靖云; 占敬敬; 胡玉峰; 龚勋
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2016-09-30
Filing date: 2016-09-30
Publication date: 2018-12-21
Anticipated expiration: 2036-09-30
Also published as: CN106645449A

Abstract

本发明提供一种磁性固相萃取结合同位素二甲基化标记分析磺胺类物质的方法，该方法采用磁性碳纳米颗粒为萃取材料，将该材料分散于含磺胺的样品溶液中，通过固相萃取将样品中的磺胺类化合物富集到磁性碳纳颗粒料表面。对吸附于材料表面的磺胺类化合物原位进行二甲基标记，对标记后的样品进行洗脱收集，并用液相色谱‑质谱法(LC‑MS)进行分析，得到结果。本发明的有益效果为发展了一种磁性纳米球上二甲基化标记结合LC‑MS定量分析水中痕量磺胺类化合物的新方法；且该方法操作简便，分析速度快，能够实现对环境介质中存在的痕量磺胺类物质的准确定量分析。

Description

一种磁性固相萃取结合同位素二甲基化标记分析磺胺类物质的方法

技术领域

本发明涉及对磺胺类化合物的定性及定量分析新方法，该方法主要基于对吸附在磁球表面磺胺类化合物原位进行稳定同位素二甲基化标记，使每一种磺胺化合都有相应的同位素内标物，实现用LC-MS对所有的磺胺类目标物进行准确定性及定量。

背景技术

磺胺类化合物是含有对氨基苯磺酰胺结构的一类化合物的总称，是应用最早的一类人工合成抗菌药物。由于该药物具有抗菌谱广、价格低廉、性质稳定等诸多优点，无论在临床还是兽药领域，该药物均有着极其广泛的应用。但由于磺胺类药物在预防和治疗过程中的不规范使用，许多动物源性食品常存在该类药物的残留。磺胺类药物具有致过敏、抑制体内酶活性、引起肠内菌群失调等副作用，残留于环境介质中具有很大的风险性。

目前在复杂基质中磺胺类药物及其代谢物的检测技术已经取得很大进展，主要借助于灵敏度较高的分析仪器，如液相色谱-质谱联用法(LC-MS)法等。在LC-MS中，用同位素内标对目标物进行定量分析是最简单且准确的方法，但因为同位素内标难以获得且价格较高，通常只适合少数目标物的分析。但磺胺类化合物属一大类物质，用同位素内标法对这些目标物同时进行定量分析难以实现。另外，二甲基化标记法作为一种基于稳定同位素标记的定量方法，已被广泛应用于定量蛋白质组学领域，该方法可对氨基进行衍生，将氨基上的两个氢转化为两个甲基，从而实现标记。本发明首次将二甲基标记法引入到磺胺类化合物的分析中，对该类化合物中苯环上的氨基进行衍生，通过与氢代和氘代的甲醛试剂反应，可对所有磺胺类化合物进行标记，得到其相应的同位素内标物。该法可实现对磺胺类化合物的快速、准确定量分析。

磁性碳纳米粒子作为一种磁性固相萃取材料因分离速度快且吸附性能好，在分析化学样品前处理中日益受到人们的关注。因环境样品复杂且目标物浓度低，本发明中首次将磁性碳纳米材料应用于磺胺类化合物的预富集，通过对吸附在该材料表面的磺胺原位进行二甲基标记，标记完成后进行洗脱收集，用于LC-MS分析。磁性固相萃取结合原位二甲基标记可解决因样品量大、目标分析物浓度低和杂质干扰过多所引起的标记效率过低和标记试剂用量过大的问题，极大提高了二甲基化的标记效率，节省了标记试剂用量，实现了对磺胺类化合物的快速准确分析，同时也扩宽了传统二甲基化标记的应用范围。

综上所述，本发明发展一种磁性纳米球上二甲基化标记结合LC-MS定量分析水中痕量磺胺类化合物的新方法。该方法操作简便，分析速度快，能够实现对环境介质中存在的痕量磺胺类物质的准确定量分析。

发明内容

本发明的目的在于建立一种磁球表面原位对所吸附的磺胺进行二甲基化标记，并结合LC-MS法分析复杂基质中痕量磺胺的新方法。本发明所使用的磁性碳纳米材料对磺胺类物质具有良好的吸附性能。磁球上二甲基化标记方法简单，反应条件温和、可控，通过控制反应条件可以实现对磺胺类物质的高效标记(标记效率>99％)。再结合LC-MS可以实现对环境介质中痕量磺胺类药物的准确定量。

为了达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种磁性固相萃取结合同位素二甲基化标记分析磺胺类物质的方法，采用磁性碳纳米材料为萃取材料，将该材料分散于含磺胺的样品溶液中，通过固相萃取将样品中的磺胺类化合物富集到磁性碳纳米材料表面。对吸附于材料表面的磺胺类化合物原位进行二甲基标记，对标记后的样品进行洗脱收集，并用液相色谱-质谱法(LC-MS)进行分析。具体操作过程可选用两种方法，其具体步骤如下：

第一种方法的具体步骤为:

第一步，取待测样品测其总氮，根据待测样品中的总氮，计算得到所需标记试剂甲醛的用量；所述的甲醛与待测样品总氮的摩尔比为50:1-100:1。

第二步，将20-50mg的磁性纳米材料(经乙腈清洗三次，超纯水平衡一次)加入待测样品溶液中，同时将等量磁性纳米材料加入已知浓度的磺胺混标溶液中，震荡实现磁性碳纳米材料对磺胺类物质的吸附和富集，待测样品溶液震荡后得到样品A，磺胺混标溶液震荡后得到样品B。所述的待测样品溶液的体积通常为1-200mL；所述的磺胺混标溶液B的体积与待测样品溶液A的体积相同；所述的磺胺混标溶液的浓度为0.05-2μg/L。

第三步，将样品A和样品B在外加磁场下磁分离后，倒掉吸附后的残留液，再加入0.5-2mL浓度为50mM的磷酸钠缓冲溶液，震荡分散后，分别得到样品A1和样品B1。在样品A1和样品B1中分别加入CH₂O和CD₂O溶液后，再分别加入0.06M的NaBH₃CN溶液，充分混合后放置于试管混合器上，在20-30℃条件下进行标记反应10-30min后，得到的样品分别为A2和B2。所述的NaBH₃CN溶液的体积为60-100μL；所述的标记反应体系的pH值5-8.5；所述的磷酸钠缓冲溶液的pH为7.5。

第四步，在样品A2和B2中加入15-30μL浓度为1％的氨水溶液，进行终止反应；再加入8-12μL纯甲酸对样品进行酸化，分别得到样品A3和B3。

第五步，标记反应结束后进行磁分离，倒掉标记溶液；先在样品A3、B3中分别加入1-2mL 50％的乙腈溶液进行淋洗，再将二者混合后，磁分离去掉淋洗液得到样品C；在样品C中加入100-500μL 80％乙腈溶液洗脱，磁分离后收集洗脱液用于LC-MS分析。

第六步，通过比较轻重同位素的色谱峰的保留时间和面积，实现对待测样品中的磺胺类化合物的定性及定量分析。

第二种方法的具体步骤为：

第一步与方法一中的第一步相同。

第二步，用CD₂O溶液对已知浓度的磺胺混标溶液进行二甲基化标记，所述的CD₂O与磺胺混标溶液中磺胺的摩尔比为50:1-100:1；具体过程为：

2.1)在15mL离心管中加入10mL浓度为1mg/L的磺胺混标溶液，再加入500μL 0.4％的CD₂O溶液，震荡后充分混合。

2.2)在步骤2.1)得到的溶液中加入80μL浓度为0.6M的NaBH₃CN溶液，震荡充分混合后，将反应体系置于试管混合器上于室温下标记反应1h；

2.3)在步骤2.2)得到的反应体系中加入16μL浓度为1％的氨水溶液，进行终止反应，再加入8μL纯甲酸进行酸化，最后得到经CD₂O标记的磺胺混合标样，并在-20℃冷冻保存备用。

第三步，将20-50mg的磁性纳米材料(经乙腈清洗三次，超纯水平衡一次)加入待测样品溶液中，再将步骤2.3)得到的磺胺混合标样加入到待测样品溶液中，得到混合溶液，震荡实现磁性碳纳米材料对磺胺类物质的吸附和富集，得到样品A4。所述的待测样品溶液的体积通常为1-200mL；所述的混合溶液中磺胺混合标样的浓度为0.05-2μg/L。

第四步，将样品A4在外加磁场下磁分离后，倒掉吸附后的残留液，加入0.5-2mL浓度为50mM的磷酸钠缓冲溶液(pH＝7.5)，震荡分散后得到样品A5。在样品A5中加入CH₂O溶液，再加入60-100μL浓度为0.06M的NaBH₃CN溶液，充分混合后放置于试管混合器上，在20-30℃条件下进行标记反应10-30min，得到样品A6。所述的标记反应体系的pH值5-8.5。

第五步，在样品A6中加入15-30μL浓度为1％的氨水溶液，进行终止反应，再加入8-12μL纯甲酸对样品A6进行酸化，得到样品A7。

第六步，标记反应结束后对样品A7进行磁分离，倒掉标记溶液；在样品A7中加入1-5mL 50％的乙腈溶液淋洗，磁分离后去掉淋洗液后，加入100-500μL80％乙腈溶液洗脱，磁分离后收集洗脱液用于LC-MS分析。

第七步与方法一中的第六步相同。

本发明的原理为：对吸附在磁球表面的磺胺进行标记，结合液相色谱-质谱联用进行分离及检测，实现对磺胺类化合物的定性及定量分析。磁性碳纳米颗粒作为分散磁性固相萃取材料对磺胺类药物具有良好的吸附性能，能够实现对样品中痕量磺胺类化合物的吸附。在吸附完成后，在磁性固相萃取颗粒表面原位进行同位素二甲基标记，通过控制标记条件，可在20分钟内对目标物实现标记。通过控制洗脱条件，可实现磺胺类化合物的选择性富集。标记后的样品，经LC-MS分析，通过比较轻重同位素的色谱峰的保留时间和面积，可对样品中的磺胺类化合物实现快速准确的定性及定量分析。

本发明的有益效果为：在样品前处理和二甲基化标记过程中使用对磺胺具有高效吸附能力的磁性碳纳米材料，可对目标物实现高效的选择性富集。解决了因目标分析物浓度过低和杂质干扰过多难以检测的问题。通过在磁球表面原位对磺胺类化合物进行标记，可显著提高二甲基化的标记效率，并节省标记试剂用量。首次将二甲基化标记引入到磺胺类物质的LC-MS法中，实现了对环境介质中痕量磺胺类物质的快速、准确定量分析。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：自来水中磺胺类化合物的分析

1)取1mL待测水样，无需过滤，直接测其总氮，根据样品总氮计算得到所需标记试剂CD₂O的用量，其用量为总氮的50倍(摩尔比)；

2)取200mL待测水样分别将等量磁性碳纳米材料20mg(乙腈清洗三次，超纯水平衡一次)加入到待测水样A和等体积(0.1μg/L)的磺胺混标溶液B中，震荡以完成对磺胺类物质的吸附和富集；

3)外加磁场下磁分离，倒掉吸附后的残留液，将完成吸附的磁性碳纳米材料各自转移到1.5mL离心管中加入0.5mL 50mM的磷酸钠缓冲溶液(pH＝7.5)并震荡分散，分别得到A1和B1。在A1、B1中分别加入CH₂O和CD₂O溶液后，然后再分别加入NaBH₃CN溶液60μL(0.06M)，充分混合后放置于试管混合器上反应10min(室温)。反应后得到的样品分别为A2和B2；

4)在A2、B2中加入浓度1％的氨水溶液15μL终止反应，再加入8μL纯的甲酸对样品进行酸化，分别得到A3和B3。

5)标记反应结束后磁分离，倒掉标记溶液，在A3、B3中先分别加入50％的乙腈溶液1mL淋洗，并将A3、B3进行混合得到样品C，磁分离后去掉淋洗液。在C中加入200μL 80％乙腈溶液洗脱，磁分离后收集洗脱液用于LC-MS分析；

6)通过比较轻重同位素的色谱峰的保留时间和面积，实现对样品A中的磺胺类化合物的定性及定量分析。

实施例2：河水中磺胺类化合物的分析

1)取不同断面及深度的河水，混合后静置1h，使泥沙与水在重力作用下初步分离，取上层清液(体积大于150mL)过滤后作为待测水样；

2)取1mL经过滤后的待测水样，测其总氮，根据样品总氮计算得到所需标记试剂CH₂O的用量，其用量为总氮的50倍(摩尔比)；

3)取100mL经过滤后的待测水样，分别将等量磁性碳纳米材料50mg(乙腈清洗三次，超纯水平衡一次)加入到待测水样A和等体积(1μg/L)的磺胺混标溶液B中，震荡以完成对磺胺类物质的吸附；

4)外加磁场下磁分离，倒掉吸附后的残留液，将完成吸附的磁性碳纳米材料各自转移到1.5mL离心管中加入50mM的磷酸钠缓冲溶液1mL(pH＝7.5)，并震荡分散，分别得到A1和B1。在A1、B1中分别加入CH₂O和CD₂O溶液后，然后再分别加入NaBH₃CN溶液60μL(0.06M)，充分混合后放置于试管混合器上反应20min(室温)。反应后得到的样品分别记为A2和B2；

5)在A2、B2中加入浓度1％的氨水溶液15μL终止反应，再加入8μL纯的甲酸对样品进行酸化，分别得到A3和B3。

6)标记反应结束后磁分离，倒掉标记溶液，在A3、B3中先分别加入50％的乙腈溶液2mL淋洗及分散，并将A3、B3进行混合得到样品C，磁分离后去掉淋洗液。在C中加入400μL80％乙腈溶液洗脱，磁分离后收集洗脱液用于LC-MS分析；

7)通过比较轻重同位素的色谱峰的保留时间和面积，实现对样品A中的磺胺类化合物的定性及定量分析。

实施例3：牛奶中磺胺类化合物的分析

1)取牛奶样品10mL于50mL离心管中，加入0.5g盐酸羟胺，旋涡混匀，加入25mL乙酸乙酯，盖紧盖后在摇床上摇(100r/min)20min；

2)离心(4000r/min)，将上清液转入旋转蒸发器蒸干(33℃±2℃)；

3)用10mL 1％的磷酸溶液溶解残留物，加入5mL正己烷旋涡混合2min，静置10min，除去正己烷层后转入旋转蒸发器蒸干；

4)用10mL 20％甲醇溶液将蒸干后残留物复溶，作为待测样品A；

5)取样品0.1mL样品A，用水稀释至1mL，测其总氮，进而换算得到样品A中的总氮。根据样品A中的总氮，计算得到所需标记试剂CH₂O的用量，其用量为总氮的80倍(摩尔比)。

6)将20mg的磁性纳米材料(经乙腈清洗三次，超纯水平衡一次)加入样品溶液A中，同时将经CD₂O标记的磺胺混合标样加入到A中得到样品A4，A4中标样的浓度为50ng/L。震荡实现磁性碳纳米材料对磺胺类物质的吸附和富集；

7)样品A4在外加磁场下磁分离后，倒掉吸附后的残留液，加入1mL的磷酸钠缓冲溶液(50mM，pH＝7.5)并震荡分散得到A5。在A5中加入CH₂O溶液，然后再加入NaBH₃CN溶液100μL(0.06M)，充分混合后放置于试管，在30℃下反应30min。反应后得到的样品为A6。

8)在A6中加入浓度1％的氨水溶液30μL终止反应，再加入12μL纯的甲酸对样品进行酸化，得到A7；

9)在A7中先加入50％的乙腈溶液5mL淋洗，磁分离后去掉淋洗液。然后加入100μL80％乙腈溶液洗脱，磁分离后收集洗脱液用于LC-MS分析；

10)通过比较轻重同位素的色谱峰的保留时间和面积，实现对样品A中的磺胺类化合物的定性及定量分析。

实施例4：猪肉中磺胺类化合物的分析

1)取10g切碎的猪肉，加入10g无水硫酸钠和15mL乙腈；

2)用精磨机磨匀后离心(8000rpm，0℃)，取上清液后残留物再用15mL乙腈提取两次，将各提取液混合；

3)将20mL正己烷加入乙腈提取液，充分混合后分离；

4)弃去正己烷层，加入5mL正丙醇，充分混合后用旋转蒸发器蒸发(30℃)至接近干燥；

5)用20mL 20％甲醇溶液将蒸干后残留物复溶，作为待测样品A；

6)取0.1mL待测样品A，用水稀释到1mL，测其总氮，并换算得到样品A的总氮，按总氮的100倍摩尔比，计算得到所需标记试剂CH₂O的用量。

7)将40mg的磁性纳米材料(经乙腈清洗三次，超纯水平衡一次)加入样品A中(15mL)，同时将经CD₂O标记的磺胺混合标样加入到A中得到样品A1，A1中标样的浓度为1μg/L。震荡实现磁性碳纳米材料对磺胺类物质的吸附和富集；

8)样品A1在外加磁场下磁分离后，倒掉吸附后的残留液，加入2mL磷酸钠缓冲溶液(50mM，pH＝7.5)并震荡分散得到A2。在A2中加入CH₂O溶液，然后再分别加入NaBH₃CN溶液100μL(0.06M)，充分混合后放置于试管混合器上，在20℃下反应30min，反应后得到的样品为A3。

9)在A3中加入浓度1％的氨水溶液30μL终止反应，再加入12μL纯的甲酸对样品进行酸化，得到A4；

10)在A4中先加入50％的乙腈溶液5mL淋洗，磁分离后去掉淋洗液。再加入500μL80％乙腈溶液洗脱，磁分离后收集洗脱液用于LC-MS分析；

11)通过比较轻重同位素的色谱峰的保留时间和面积，实现对样品A中的磺胺类化合物的定性及定量分析。

Claims

1.一种磁性固相萃取结合同位素二甲基化标记分析磺胺类物质的方法，其特征在于以下步骤：

第一步，取待测样品测其总氮，根据待测样品中的总氮，计算得到所需标记试剂甲醛的用量；所述的甲醛与待测样品总氮的摩尔比为50:1-100:1；

第二步，将20-50mg的磁性纳米材料加入待测样品溶液中，同时将等量磁性纳米材料加入已知浓度的磺胺混标溶液中，震荡实现磁性碳纳米材料对磺胺类物质的吸附和富集，待测样品溶液震荡后得到样品A，磺胺混标溶液震荡后得到样品B；所述的待测样品溶液的体积为1-200mL；所述的磺胺混标溶液B的体积与待测样品溶液A的体积相同；所述的磺胺混标溶液的浓度为0.05-2μg/L；

第三步，将样品A和样品B在外加磁场下磁分离后，倒掉吸附后的残留液，再加入0.5-2mL浓度为50mM的磷酸钠缓冲溶液，震荡分散后，分别得到样品A1和样品B1；在样品A1和样品B1中分别加入CH₂O和CD₂O溶液后，再分别加入0.06M的NaBH₃CN溶液，充分混合后放置于试管混合器上，在20-30℃条件下进行标记反应10-30min后，得到的样品分别为A2和B2；所述的NaBH₃CN溶液的体积为60-100μL；所述的标记反应体系的pH值5-8.5；所述的磷酸钠缓冲溶液的pH为7.5；

第四步，在样品A2和B2中加入15-30μL浓度为1％的氨水溶液，进行终止反应；再加入纯甲酸对样品进行酸化，分别得到样品A3和B3；

第五步，标记反应结束后进行磁分离，倒掉标记溶液；先在样品A3、B3中分别加入50％的乙腈溶液进行淋洗，再将二者混合后，磁分离去掉淋洗液得到样品C；在样品C中加入80％乙腈溶液洗脱，磁分离后收集洗脱液用于LC-MS分析；

第六步，通过比较轻重同位素的色谱峰的保留时间和面积，实现对样品待测样品中的磺胺类化合物的定性及定量分析。

2.根据权利要求1所述的一种磁性固相萃取结合同位素二甲基化标记分析磺胺类物质的方法，其特征在于，所述的第二步磁性纳米材料进行乙腈清洗、超纯水平衡处理。

3.根据权利要求1或2所述的一种磁性固相萃取结合同位素二甲基化标记分析磺胺类物质的方法，其特征在于，所述的的第四步中纯甲酸的体积为8-12μL。

4.根据权利要求1或2所述的一种磁性固相萃取结合同位素二甲基化标记分析磺胺类物质的方法，其特征在于，所述的第五步中对样品C进行洗脱的乙腈溶液中体积为100-500μL。

5.根据权利要求3所述的一种磁性固相萃取结合同位素二甲基化标记分析磺胺类物质的方法，其特征在于，所述的第五步中对样品C进行洗脱的乙腈溶液中体积为100-500μL。

6.一种磁性固相萃取结合同位素二甲基化标记分析磺胺类物质的方法，其特征在于以下步骤：

第一步，取待测样品测其总氮，根据待测样品中的总氮，计算得到所需标记试剂甲醛的用量，所述的甲醛与待测样品总氮的摩尔比为50:1-100:1；

第二步，用CD₂O溶液对已知浓度的磺胺混标溶液进行二甲基化标记，所述的CD₂O与磺胺混标溶液中磺胺的摩尔比为50:1-100:1；

2.1)在离心管中加入10mL浓度为1mg/L的磺胺混标溶液，再加入500μL0.4％的CD₂O溶液，震荡后充分混合；

2.3)在步骤2.2)得到的反应体系中加入16μL浓度为1％的氨水溶液，进行终止反应，再加入纯甲酸进行酸化，最后得到经CD₂O标记的磺胺混合标样，并冷冻保存备用；

第三步，将20-50mg的磁性纳米材料加入待测样品溶液中，再将步骤2.3)得到的磺胺混合标样加入到待测样品溶液中，得到混合溶液，震荡实现磁性碳纳米材料对磺胺类物质的吸附和富集，得到样品A4；所述的待测样品溶液的体积为1-200mL；所述的混合溶液中磺胺混合标样的浓度为0.05-2μg/L；

第四步，将样品A4在外加磁场下磁分离后，倒掉吸附后的残留液，加入0.5-2mL浓度为50mM的磷酸钠缓冲溶液，震荡分散后得到样品A5；在样品A5中加入CH₂O溶液，再加入60-100μL浓度为0.06M的NaBH₃CN溶液，充分混合后放置于试管混合器上，在20-30℃条件下进行标记反应10-30min，得到样品A6；所述的标记反应体系的pH值5-8.5；所述的磷酸钠缓冲溶液的pH为7.5；

第五步，在样品A6中加入15-30μL浓度为1％的氨水溶液，进行终止反应，再加入纯甲酸对样品A6进行酸化，得到样品A7；

第六步，标记反应结束后对样品A7进行磁分离，倒掉标记溶液；在样品A7中加入50％的乙腈溶液淋洗，磁分离后去掉淋洗液后，加入80％乙腈溶液洗脱，磁分离后收集洗脱液用于LC-MS分析；

第七步，通过比较轻重同位素的色谱峰的保留时间和面积，实现对待测样品中的磺胺类化合物的定性及定量分析。

7.根据权利要求6所述的一种磁性固相萃取结合同位素二甲基化标记分析磺胺类物质的方法，其特征在于，所述的第三步中磁性纳米材料进行乙腈清洗、超纯水平衡处理。

8.根据权利要求6或7所述的一种磁性固相萃取结合同位素二甲基化标记分析磺胺类物质的方法，其特征在于，所述的第二步中步骤2.3)纯甲酸的体积为8-12μL。

9.根据权利要求6或7所述的一种磁性固相萃取结合同位素二甲基化标记分析磺胺类物质的方法，其特征在于，所述的第六步中对样品A7进行洗脱的乙腈溶液中体积为100-500μL。

10.根据权利要求8所述的一种磁性固相萃取结合同位素二甲基化标记分析磺胺类物质的方法，其特征在于，所述的第六步中对样品A7进行洗脱的乙腈溶液中体积为100-500μL。