CN106636292A - (1r,4s)‑(－)‑2‑氮杂双环[2.2.1]庚‑5‑烯‑3‑酮的制备方法 - Google Patents

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Abstract

(1R,4S)‑(－)‑2‑氮杂双环[2.2.1]庚‑5‑烯‑3‑酮的制备方法。本发明公开了一种应用酶处理化合物(I)的外消旋体，制备对映体纯的式(II)中间体及其对映体纯的水解产物(III)的方法。所述方法为将化合物(II)与酶、缓冲液或水‑有机溶剂组成混合物，在15～60℃反应3～168小时，反应式如式(IV)所示。该反应操作简单、产率高、选择性好，对原料利用率高。

Description

(1R,4S)-(－)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制备方法
技术领域
本发明涉及一种对映体纯的(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮以及(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸的制备方法。
背景技术
(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(如式(II)所示，简称为(-)-文斯内酰胺、文斯内酯或(-)-γ-内酰胺)
是一种碳环核苷类化合物合成的重要手性前体。它可以用于合成多种手性药物，例如抗艾滋病药物阿巴卡韦(Abacavir)、抗甲型流感及禽流感药物帕拉米韦(Peramivir)和新型降糖药物美格列汀(Melogliptin)等。但是在该手性化合物的化学合成中，一般获得的都是外消旋的(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，如式(I)所示。
目前，众多制备对映体纯的(-)-文斯内酰胺的方法(包括物理法、化学法和生物法)中，生物法因为具有反应效率高、立体选择性好、反应条件温和、低能耗、环境友好等优点，受到越来越广泛的关注和越来越深入的研究。
目前已有若干研究显示，微生物细胞或来源于生物的酶，可以通过立体选择性水解N-保护的文斯内酰胺衍生物的外消旋体，制备对映体纯的(-)-文斯内酰胺。由于化合物(I)的氮原子被衍生化时，内酰胺 键可以被活化，从而更容易在酶催化反应中被水解，因而较早的研究集中于使用N-保护的文斯内酰胺衍生物作为生物法拆分的原料。专利EP-A-0424064、CN1261405A和CN1133749C分别公开了使用不同生物酶拆分N-保护的文斯内酰胺衍生物获得(-)-文斯内酰胺及其衍生物的方法。但是，这些生物酶不能催化N-未保护的文斯内酰胺的水解，不便于工业生产应用。
近年来，已有研究者发现若干生物细胞或其产生的酶能够直接以(±)-文斯内酰胺外消旋体作为原料，以较高的立体选择性水解(+)-构型，保留大多数所需的(-)-文斯内酰胺。郑国钧等在专利CN101113423A、CN101240257A和CN101285059A中筛选了适用于此目的的菌株Microbacterium hydrocarbonxydans CGMCC 2085，并将该微生物的细胞及其产生的特异性内酰胺酶应用于(-)-文斯内酰胺的制备。倪晔等在专利CN105200076A筛选得到了一种来源于Delftia sp.CGMCC 5755的(+)-γ-内酰胺酶，通过将这种酶的基因重组表达于B.subtilis 168/pMA5-delm宿主菌中，获得了一种高选择性的制备(-)-文斯内酰胺的重组微生物催化剂。
应用上述微生物细胞，均可在较短反应时间内制备得到手性纯度较高的(-)-文斯内酰胺。然而已有报道的研究成果当中，将这些生物催化制备对映体纯(-)-文斯内酰胺的技术，生物细胞的用量大，底物浓度低，收率低，给后续产物分离纯化带来很多麻烦，不易于工业化生产。
此外，上述通过生物催化或酶技术由(±)-文斯内酰胺外消旋体获得(-)-文斯内酰胺的方法中，均没有回收分离作为水解产物的(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸，造成了这种化学原料的浪费。
发明内容
现在，我们已经开发了一种高产率并且高效的由外消旋体制备对映体纯的式(II)中间体，同时获得对映体纯的式(III)中间体的方法， 旨在通过一种新型酶催化技术，实现较高底物浓度(原料占反应混合物的重量百分比超过20％)和较大反应规模(100kg以上)的情况下，实现(±)-文斯内酰胺的选择性水解拆分，从而实现大规模制备对映体纯的(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮以及(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸的目的。
特别是我们已经发现，脂肪酶Amano Lipase A(又名Lipase A"Amano")和酯酶Esterase-53(又名Esterase AR)对此水解拆分(±)-文斯内酰胺有非常好的活性。在此优选使用酯酶Esterase-53，其表现出(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的生物催化转化率适用于工业规模上应用。Esterase-53是一种将来源于分枝节杆菌(Anthrobatcterramosus)的基因重组于大肠杆菌(Escherichia coli)中发酵制备的酯水解酶。
本发明提供了一种通过对映体拆分式(I)的(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的外消旋物，制备式(II)的(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，同时制备式(III)的(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸的方法，
该方法包括使用对映体选择性水解所述外消旋物(I)的内酰胺键的脂肪酶或酯酶与所述外消旋物(I)进行反应，以生成作为未反应物的对映体纯的所述(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(II)和作为水解产物的所述(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸(III)。
上述反应的反应式如式(IV)所示。
在本发明的制备方法中，所述脂肪酶是Amano Lipase A。该脂肪酶来源于黑曲霉(Aspergillus niger)。
在本发明的制备方法中，所述酯酶是Esterase-53。该酯酶来源于分枝节杆菌(Anthrobatcter ramosus)或来源于将所述菌种的基因重组于大肠杆菌(Escherichiacoli)中。
在本发明的制备方法中，还包括以常规方法分离出未反应的式(II)的对映体，以及以常规方法分离出式(III)的水解产物。常规分离方法包括有机溶剂进行萃取、离子交换或层析等。其中，优选使用溶剂萃取法分离未反应的所述式(II)的对映体以及所述式(III)的水解产物。
在本发明的制备方法中，所述反应在有机溶剂和水的混合物，或纯水中进行。在使用有机溶剂和水的混合物的情况下，所述有机溶剂是水不可混溶的。其作用在于进一步增加底物的溶解性同时降低在水相中的底物浓度。优选的水不可混溶的有机溶剂是甲基叔丁基醚或甲基四氢呋喃。
在本发明的制备方法中，所述反应在pH范围为5～9的条件下进行。当pH小于5时，酶的催化活力可能显著降低。当pH大于9时，酶活亦有可能降低，同时底物会无选择性地自发水解。优选的反应pH为8。通过向反应溶剂中加入缓冲液进行pH控制。常用的缓冲液包括但不限于KH2PO4-K2HPO4或NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液。
在本发明的制备方法中，所述反应在温度为15～60℃的条件下进行。当温度低于15℃时，反应速度较慢。但温度高于60℃时，酶会不可逆失活。出于保证反应稳定、高效进行的目的，优选的反应温度为30℃。
在本发明的制备方法中，还包括在分离出未反应的所述式(II)的对映体之后，以重结晶法提纯分离的所述(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(II)的步骤。
在本发明的制备方法中，还包括在分离出未反应的所述式(II)的对映体之后，以常规方法从母液中分离出水解产物(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸(III)的步骤。
以本发明的方法制备的(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(II)，对映体过量值不低于99％，纯度不低于99％。以本发明的方法制备的(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸(III)，对映体过量值不低于99％。
本发明的方法能够在较高底物浓度(原料占反应混合物的重量百分比超过20％)和较大反应规模(100kg以上)的情况下进行，反应操作简单、产率高、选择性好，对原料利用率高。
本发明的积极进步效果在于，成功实现了生物催化技术大规模和高效率制备对映体纯(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，同时实现对水解产物(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸的回收。对于工业化生产这两种化合物具有重要价值。
附图说明
图1是(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的外消旋物的手性HPLC图谱。左侧的峰为(1S,4R)-(+)-构型，右侧的峰为(1R,4S)-(-)-构型。
图2是按照本发明实施例1的方法，转化后的(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的手性HPLC图谱。图中唯一的峰为目标化合物(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，(+)-构型没有检出。
图3是(±)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸的外消旋物的手性HPLC图谱。 左侧的峰为(1S,4R)-(+)-构型，右侧的峰为(1R,4S)-(-)-构型。
图4是按照本发明实施例1的方法，转化后的(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸的手性HPLC图谱。图中唯一的峰为目标化合物(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸，(-)-构型没有检出。
图5是按照本发明实施例2的方法，转化后的(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的手性HPLC图谱。图中左侧的峰为(+)-构型，右侧的峰为目标化合物(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮。
具体实施方式
本发明所述的通过脂肪酶或酯酶催化，对映体拆分式(I)的(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的外消旋物，制备式(II)的(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，同时制备式(III)的(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸的反应方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用Esterase-53或Amano Lipase A，催化外消旋的(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮水解的步骤。
本文中所指的“外消旋的(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮”一般地表示(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮和(1S,4R)-(+)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的混合物，并不特别限定其中(+)-文斯内酰胺和(-)-文斯内酰胺的含量比例。例如，以混合物的总重量计，(-)-异构体可以占其中的0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或上述数值组成的范围内的任意值。
对作为原料的外消旋的(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮在反应体系中的浓度没有特别限定，可以基于反应器设计、反应条件和酶催化剂的选择等具体判定。出于提高反应效率的目的，(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的浓度优选为50～200g/L。
作为原料的(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮可以在反应开始时一次性加入反应介质中，也可以在反应过程中分多次加入反应体系。
对所使用的脂肪酶或酯酶没有特别限定，只要其能够催化(+)-文斯内酰胺的水解即可。优选的脂肪酶是Esterase-53，并且在原料外消旋体的浓度为50～200g/L的情况下，Esterase-53的浓度优选为0.4～5g/L。优选的酯酶是Amano Lipase A，并且在原料外消旋体的浓度为25～200g/L的情况下，Amano Lipase A的浓度为10～200g/L。
在本发明的水解步骤中，考虑到酶催化剂的活性，适合的反应温度为15-60℃。并且出于保证反应稳定、高效进行的目的，最优选的反应温度为30℃。
在本发明的水解步骤中，所使用的反应介质包括但不限于水。具体来说，反应介质可以是纯水，或者有机溶剂和水的混合物。为了进一步增加底物的溶解性同时降低在水相中的底物浓度，其中所使用的有机溶剂能够溶解文斯内酰胺，并且是水不可混溶的。优选的有机溶剂包括甲基叔丁基醚、异丙醚或2-甲基四氢呋喃等。在使用水和水不可混溶的有机溶剂的情况下，反应体系为两相体系。
本发明的水解反应在pH范围为5～9的条件下进行。出于最大化酶活性的目的，最优选的pH为8。为了调整反应体系的pH值，反应介质中可以含有缓冲液。能够使用的缓冲液包括但不限于KH2PO4-K2HPO4或NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液。缓冲液中磷酸盐的浓度在25～500mmol/L的范围内，优选为100mmol/L。
对本发明的水解反应的进行时间没有特别限定，只要达到期望的反应程度即可。为了提高反应产率和生产效率，反应时间可以是2小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、或上述时间组成的范围内的任意时间。
(2)水解反应后，分离未反应的(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5- 烯-3-酮(II)粗产品的步骤。
在本发明的水解步骤之后，可以以常规方法分离出未反应的式(II)的对映体的粗产品。常规分离方法包括有机溶剂萃取、离子交换或层析等。其中，优选使用溶剂萃取法分离未反应的式(II)的对映体。
萃取的具体步骤如下：使用二氯甲烷或甲基叔丁基醚萃取整个反应体系2～6次；以体积计，每次萃取使用二氯甲烷或甲基叔丁基醚的量不少于反应混合物的0.5倍，萃取时间不少于20分钟。每次萃取结束后，萃取混合物经离心机或过滤器处理，分层后，取中间层和水层用于下一次萃取。合并每一次萃取的有机层，即为粗产品的溶液。
保留最后一次萃取之后的水层，用于随后的分离水解产物(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸(III)的步骤。
(3)对分离的(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(II)粗产品进行提纯的步骤。
在分离步骤中获得的包含(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(II)粗产品的有机溶液，可以直接在不高于45℃的条件下减压浓缩蒸干，获得式(II)对映体的固体。
或者，分离步骤获得的粗产品可以通过下面的方法进行结晶提纯：
将粗产品的有机溶液在45℃以下减压浓缩至初始原积的5～20％，再加入所剩溶液体积1～3倍的正庚烷或正己烷。混合均匀后，继续在不高于45℃的温度下减压浓缩，直至体积减小至浓缩前的20～40％。然后过滤或离心，将所得湿物料在不超过30℃、氮气保护的条件下干燥，获得式(II)对映体的固体。
上述两种方式，均能够得到浅黄色或浅灰色至白色的固体或晶体粉末。经手性HPLC检测，为对映体过量值不低于99％、纯度不低于99％的产品(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮。
(4)提取水解产物(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸(III)的步骤。
水解反应之后，作为水解产物的(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸(III)溶解于反应体系的水相中。因此，水解产物的提取可以在水解反应之后，直接从反应体系水相中提取；也可以在从整个反应体系中分离出式(II)的对映体之后，从剩余的水层中提取。
在使用萃取法分离式(II)的对映体的情况下，可以按照下列步骤，从萃取后所剩的水相母液中提取水解产物(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸：
以体积计，向水相母液中加入1～2倍的正丁醇或3～5倍的2-丁酮，在不低于50℃的温度下减压浓缩至原体积的20～50％，直至出现固体析出。向此混合物中加入原体积0.2～0.8倍的甲醇或乙醇，在不高于50℃温度下继续浓缩直至大量固体析出。过滤或离心分离出固体。将分离所得固体用甲醇洗涤数次，在不高于30℃、氮气保护的条件下干燥，获得式(III)的水解产物。
通过以上步骤得到浅黄色或浅灰色至白色的固体或粉末。经手性HPLC检测，为对映体过量值不低于99％的产品(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸(III)。
在本发明的制备方法中，所使用试剂和原料均市售可得。
实施例
以下根据实施例，并且结合附图，详细描述本发明。从下文的详 细描述中，本发明的上述方面和本发明的其他方面将是明显的。下列实施例仅试图阐明本发明，而对本发明保护范围不起任何限定作用。
实施例1
在500mL玻璃夹套反应瓶中，加入100mL水，0.064g NaH2PO4和1.344g Na2HPO4，搅拌直至固体溶清；加入20g(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的外消旋物，搅拌至固体溶清；调整并控制反应液温度30℃；向反应液中加入0.4g Esterase-53酶，搅拌12小时；向反应液加入10g(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的外消旋物，继续搅拌24小时。
用二氯甲烷萃取反应液4次，每次使用150mL二氯甲烷。合并全部萃取有机相，在30℃减压蒸馏浓缩有机相至大约30mL；向浓缩液中加入70mL正庚烷，在50℃减压蒸馏浓缩有机相至大约30mL；过滤；所得固体在30℃、氮气流保护下减压烘干12小时，称重得13.5g白色粉末，分离收率45％。经手性HPLC分析，所得固体即产品(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，对映体过量值100％。HPLC分析条件：岛津LC-20A液相色谱仪和紫外检测器；Chirapak IC(250×4.6mm，0.5μm)手性色谱柱；流动相：正己烷-乙醇(体积比70:30)；柱温40℃、流速1mL/min下平衡；检测波长225nm(以下简称为HPLC条件1)。
向萃取后剩余的水相中，加入100mL正丁醇，在50℃下减压浓缩至20mL；加入20mL甲醇，在50℃下继续减压浓缩至20mL，过滤；将过滤所得固体用甲醇洗涤3次，每次使用20mL；所得固体在30℃、氮气流保护下减压烘干12小时，称重得16.0g浅黄色粉末，分离收率46％。经N-Boc衍生化后用手性HPLC分析，所得固体即副产品(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸，对映体过量值100％。HPLC分析条件：岛津LC-20A液相色谱仪和紫外检测器；Chirapak IC(250×4.6mm，0.5μm)手性色谱柱；流动相：正己烷-乙醇(体积比95:5)；柱温30℃、流速1mL/min下平衡；检测波长210nm(以下简称为HPLC条件2)。
实施例2
在250mL反应瓶中加入70mL水，0.06g KH2PO4·2H2O和1.5g K2HPO4，控制反应温度30℃，搅拌1小时；加入12g(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的外消旋物，加入600mgEsterase-53酶，控制温度30℃，搅拌16小时。
用二氯甲烷萃取反应液4次；萃取后的有机相，在30℃减压蒸馏浓缩直至20mL；加入正庚烷60mL，减压蒸馏浓缩直至40mL；过滤；所得固体在40℃、氮气保护下减压干燥12小时，称重得到5.6g白色晶体状粉末，分离收率46.8％。经手性HPLC分析，所得固体即产品(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，对映体过量值99.9％。HPLC分析条件同HPLC条件1。
向萃取后剩余的水相中，加入50mL正丁醇，在50℃下减压浓缩至15mL；加入15mL甲醇，在50℃下继续减压浓缩至10mL，过滤；将过滤所得固体用甲醇洗涤3次，每次使用3mL；所得固体在30℃、氮气流保护下减压烘干12小时，称重得5.6g浅黄色粉末，分离收率40％。经手性HPLC分析，所得固体即(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸，对映体过量值99.9％。HPLC分析条件同HPLC条件2。
实施例3
在200mL玻璃烧瓶中加入40mL水，20mL甲基叔丁基醚和和10g(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的外消旋物，充分震荡至固体溶清；将0.2g Esterase-53酶溶于10mL纯水，再将所得酶溶液与反应物混合；在室温下搅拌24小时。
用甲基叔丁基醚萃取反应液6次，每次使用50mL甲基叔丁基醚。合并萃取有机相，减压蒸馏浓缩直至溶剂完全蒸干。所得固体在40℃、氮气流保护下减压烘干12小时，称重得4.4g白色晶体状粉末，分离收率44％。经手性HPLC分析，所得固体即产品(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环 [2.2.1]庚-5-烯-3-酮，对映体过量值100％。HPLC分析条件同HPLC条件1。
将萃取后剩余的水相在50℃下减压浓缩至10mL；加入6mL甲醇，过滤；将过滤所得固体用甲醇洗涤3次，每次使用3mL；所得固体在30℃、氮气流保护下减压烘干24小时，称重得3.5g浅黄色粉末，分离收率30％。经手性HPLC分析，所得固体即(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸，对映体过量值99.9％。HPLC分析条件同HPLC条件2。
实施例4
除了将NaH2PO4的量改变为2.244g、Na2HPO4的量改变为0.185g、水浴温度改变为15℃之外，以与实施例1相同的方法，制备及分析(-)-对映体和水解产物。
从萃取的有机相中分离得到8.1g(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，对映体过量值98％，分离收率27％。从水相中分离得到7.0g(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸，对映体过量值99％，分离收率20％。
实施例5
除了将KH2PO4的量改变为0g、水浴温度改变为50℃之外，以与实施例2相同的方法，制备及分析(-)-对映体和水解产物。
从萃取的有机相中分离得到4.7g(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，对映体过量值99％，分离收率39％。从水相中分离得到4.2g(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸，对映体过量值99％，分离收率30％。
实施例6
在1000mL玻璃夹套反应瓶中，加入500mL水，0.064g NaH2PO4和1.344g Na2HPO4，搅拌直至固体溶清；加入10.0g(±)-2-氮杂双环 [2.2.1]庚-5-烯-3-酮的外消旋物，搅拌至固体溶清；通过恒温循环水浴控制反应液温度30℃；加入5g Amano Lipase A酶，搅拌60小时。
用二氯甲烷萃取反应液。合并全部萃取有机相，在30℃减压蒸馏浓缩直至溶剂完全蒸干。所得固体在氮气流保护下减压烘干12小时，称重得4.5g白色晶体状粉末，分离收率45％。经手性HPLC分析，所得固体即产品(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，对映体过量值100％。HPLC分析条件同HPLC条件1。
将萃取后剩余的水相在50℃下减压浓缩至7mL；加入10mL甲醇，过滤；将过滤所得固体用甲醇洗涤3次，每次使用3mL；所得固体在30℃、氮气流保护下减压烘干24小时，称重得4.2g浅黄色粉末，分离收率36％。经手性HPLC分析，所得固体即(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸，对映体过量值99％。HPLC分析条件同HPLC条件2。
本领域的技术人员应当明了，尽管为了举例说明的目的，本文描述了本发明的具体实施方式，但可以对其进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明的具体实施方式和实施例不应当视为限制本发明的范围。本发明仅受所附权利要求的限制。本申请中引用的所有文献均完整地并入本文作为参考。

Claims (15)

1.一种通过对映体拆分式(I)的(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的外消旋物，制备式(II)的(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，同时制备式(III)的(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸的方法，
该方法包括使用对映体选择性水解所述外消旋物(I)的内酰胺键的脂肪酶或酯酶与所述外消旋物(I)进行反应，以生成作为未反应物的基本上对映体纯的所述(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(II)和作为水解产物的所述(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸(III)。
2.如权利要求1所述的方法，还包括以常规方法分离出未反应的所述式(II)的对映体。
3.如权利要求1所述的方法，还包括以常规方法分离出所述式(III)的水解产物。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述反应在有机溶剂和水的混合物，或纯水中进行。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述有机溶剂是水不可混溶的。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述水不可混溶的有机溶剂是甲基叔丁基醚或甲基四氢呋喃。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述反应在pH范围为5～9和温度为15～60℃的条件下进行。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述反应在pH为8和温度为30℃的条件下进行。
9.如权利要求1或2所述的方法，还包括以溶剂萃取法分离未反应的所述式(II)的对映体。
10.如权利要求1～9任一项所述的方法，还包括以重结晶法提纯分离所述(1R,4S)-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(II)。
11.如权利要求1～10任一项所述的方法，还包括以重结晶法提纯分离所述(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸(III)。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述脂肪酶是Amano Lipase A。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述脂肪酶来源于黑曲霉(Aspergillus niger)。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述酯酶是Esterase-53。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述酯酶来源于分枝节杆菌(Anthrobatcterramosus)，或来源于将所述菌种的基因重组于大肠杆菌中。
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