CN106636113A - 一种用于检测妇科慢性盆腔炎的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于妇科的慢性盆腔炎诊断的适配子及其试剂盒，所述的适配子能够高效的特异性的结合SIgA。该适体的获得是应用新的组合化学技术SELEX，以SIgA为靶目标，从随机文库中筛选出了能与SIgA特异性结合的RNA适配子。通过适配子特异性的结合SIgA，从而定量测定阴道分泌物中SIgA的含量，从而能够快速高效的初步筛选慢性盆腔炎。该试剂盒制备简单，成本低廉，适宜于大面积的推广使用，具有极高的社会价值。

Description

一种用于检测妇科慢性盆腔炎的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及医学检测领域，特别涉及一种用于妇科中慢性盆腔炎诊断用的适配子及其试剂盒。

背景技术

慢性盆腔炎是指女性内生殖器及其周围结缔组织、盆腔腹膜的慢性炎症。其主要临床表现为月经紊乱、白带增多、腰腹疼痛及不孕等，如已形成慢性附件炎，则可触及肿块。症状可见：1)慢性盆腔痛：慢性炎症形成的瘢痕粘连以及盆腔充血，常引起下腹部坠胀、疼痛及腰骶部酸痛。常在劳累、性交后及月经前后加剧。2)不孕及异位妊娠：输卵管粘连阻塞可致不孕和异位妊娠。急性盆腔炎后不孕发生率为20％～30％。3)月经异常：子宫内膜炎常有月经不规则；盆腔淤血可致经量增多；卵巢功能损害时可致月经失调。4)全身症状：多不明显，有时仅有低热，易感疲倦。由于病程时间较长，部分患者可出现神经衰弱症状，如精神不振、周身不适、失眠等。当患者抵抗力差时，易有急性或亚急性发作。体征，若为子宫内膜炎，子宫增大、压痛；若为输卵管炎，则在子宫一侧或两侧触到呈索条状的增粗输卵管，并有轻度压痛。若为输卵管积水或输卵管卵巢囊肿，则在盆腔一侧或两侧触及囊性肿物，活动多受限。若为盆腔结缔组织炎时，子宫常呈后倾后屈，活动受限或粘连固定，子宫一侧或两侧有片状增厚、压痛，宫骶韧带常增粗、变硬，有触痛。

盆腔炎的检查主要分为以下三步：第一步检查临床症状。第二步白带常规检查,这项检查主要是检查阴道清洁度、细菌性阴道病包括霉菌、滴虫等。第三步B超检查,利用B超检查可以识别来自输卵管、卵巢及肠管粘连一起形成的包块或脓肿有85％的准确性。但轻度或中等度的盆腔炎很难在B型超声影象中显示出特征。如果进行以上三项检查之后，并未发现明显的盆腔炎特征，还可以做相关的辅助检查以确诊是否患有盆腔炎。临床上，主要有以下三项辅助检查：第一项放射性同位素扫描近年来有人采用67镓或111铟标记的白细胞作扫描以诊断腹腔脓肿，取得较高的准确率，应用111铟作扫描，准确率可高达85～100％。但目前临床上尚少应用，第二项超声检查如果条件允许，还应给患者作超声检查以了解盆腔内有无包块。如有包块，看是否为脓肿。此法为非损伤性检查，简便易行，可靠性可高达90％以上。第三项计算机断层扫描(CT)。但是以上检测，检测比较耗时，初筛复杂，效率低下，因此具有很大的改进空间。

在现有技术中，已知的宫颈分泌物中，分泌型免疫球蛋白A(SIgA)含量对慢性盆腔炎的诊断价值。通过抽取宫颈管内粘液作SIgA定量测定，盆腔炎病人的SIgA平均含量可以达到166.8mg/L，而正常妇女的结果为约9.8mg/L，二者差异显著，因此，通过定量分析宫颈分泌物中SIgA的含量可以初步用来判断时候患有慢性盆腔炎。

虽然可以采用抗体通过酶联免疫反应来定量分析宫颈分泌物中SIgA的含量，但是该方法对抗体的要求比较高，并且检测成本也比较高，因此，对于贫穷落后地区，并不适宜大面积推广。

SELEX技术是20世纪90年代初发展起来的一种新的组合化学技术。利用该技术可以从随机单链寡核苷酸库中筛选到特异性与靶物质高度亲和的核酸适配体。其基本思路是体外化学合成一个单链寡核苷酸库，与靶物质混合，形成靶物质-核酸复合物，洗脱未结合的核酸，分离与靶物质结合的核酸分子，并以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进入下轮的筛选。通过重复的筛选与扩增，一些与靶物质不结合或与靶物质有低亲和力、中亲和力的核酸分子被洗去，而与革G物质有强亲和力的核酸分子从非常大的随机库中分尚出来，且纯度随SELEX过程的进行而增高，最后占据库的大多数(>90％左右)。自Tuerk和Ellington等首先运用此技术筛选到特异性吸附噬菌体T4DNA聚合酶和有机染料分子的特异核酸适配体后，经过十几年的发展，SELEX技术已经成为一种重要的研宄手段和工具。因此，采用selex技术，筛选特定的结合SIgA的适配体，进而将适配体制备成为特异性检测SIgA含量的试剂盒具有较为重要的意义。

发明内容

本发明的技术方案通过以下步骤实现：

本发明的目的是提供一种SIgA的核酸适配体序列。

本发明中，所述的SIgA的核酸适配体(序列1-15)能够特异结合SIgA。

本发明的进一步的目的是提供所述核酸适配体序列的用途。本发明中根据对该序列应用，可进一步用于制备特异性结合SIgA的试剂盒。

从体外合成的随机寡聚DNA文库，(5′-TGACCTAACGGCATGACTTA----N36----GGCACCATGGACCAGTTACC-3′)，其中N36为36个随机寡核苷酸；从中筛选出与SIgA特异结合的核酸适配体；将筛选出的序列用引物P1：TGACCTAACGGCATGACTTA；引物P2：GGTAACTGGTCCATGGTGCC，进行扩增并进行TA克隆入pMD19-T载体(购自上海博光生物公司)，转化DH5a细菌(购自北京天根生物公司)；挑去白色菌落进行PCR确定阳性克隆后，抽提质粒并测序反应，上测序仪测序。

本发明采用核酸适配体的体外筛选(SELEX)技术，以SIgA为正筛靶标，筛选与SIgA特异结合的核酸适配体，制得具有特异结合SIgA的序列，本发明中命名为适配体SIgA ap-1～15。序列如下：

SIgAap-1:UGACCUAACGGCAUGACUUAUCCAAAUCCUCUCAUCUAUGCUACCAAUCUUACAUUGGCACCAUGGACCAGUUACC；

SIgAap-2:UGACCUAACGGCAUGACUUACCUUCCACUCCCUUAUGCAUCUUACAUUCCCCCUCAGGCACCAUGGACCAGUUACC；

SIgAap-3:UGACCUAACGGCAUGACUUAUUUCUACCAACUCCUUGUUCCUUCUUCACACCACUUGGCACCAUGGACCAGUUACC；

SIgAap-4:UGACCUAACGGCAUGACUUACCCUUAUCCCAAUUUUCUGCUUCAACAUAAACAAUCGGCACCAUGGACCAGUUACC；

SIgAap-5:UGACCUAACGGCAUGACUUAUACUAAUCAAACUCUUAGCCCACCCUCUAUCUUAUAGGCACCAUGGACCAGUUACC；

SIgAap-6:UGACCUAACGGCAUGACUUACUCACCAUAACUUUUACGAUCUAAUACCCACACACCGGCACCAUGGACCAGUUACC；

SIgAap-7:UGACCUAACGGCAUGACUUACCACCUAACUUCUUUAAGCUUAAAUACUUCUUCCAAGGCACCAUGGACCAGUUACC；

SIgAap-8:UGACCUAACGGCAUGACUUACCUUCCCCAUUAAAUCAGCACCAUUCACCUCAAUCAGGCACCAUGGACCAGUUACC；

SIgAap-9:UGACCUAACGGCAUGACTTACTCACCCATTCACTCATGACTTCATAATCTTTTCTCGGCACCATGGACCAGTTACC；

SIgAap-10:TGACCUAACGGCAUGACUUAACCUCAAUUCCAUCCAUAUCUUAAUCUCUAUACAUAGGCACCAUGGACCAGUUACC；

SIgAap-11:UGACCUAACGGCAUGACUUAACUCCACAUACACCCCAGACACCCCUAAUAUUAUAUGGCACCAUGGACCAGUUACC；

SIgAap-12:UGACCUAACGGCAUGACUUAUAAUAACUACUUUUACCAGCUUCUAUCAUACCAUAUGGCACCAUGGACCAGUUACC；

SIgAap-13:UGACCUAACGGCAUGACUUACAAUCUAAAACUCUUCUAUUCUAUACCCUUUAAUUCGGCACCAUGGACCAGUUACC；

SIgAap-14:UGACCUAACGGCAUGACUUAAUAACAAAUCCUCCCAUCACACCCACUUAUAAAAAUGGCACCAUGGACCAGUUACC；

SIgAap-15:UGACCUAACGGCAUGACUUAUCCUCUCCCUCCUAUAAUACAAUCCUCAAACUCUACGGCACCAUGGACCAGUUACC；

本发明的适配子可以用于构建试剂盒，该试剂盒可以用于特异性的分离和定量检测SIgA，具有分离效果快，效率高，节省时间，节约成本的功效。具有很广阔的应用前景。

本发明的有益效果：获得了一种能够特异高效结合SIgA的适配子,通过将该适配子制备成为试剂盒即可定量的用于检测SIgA的浓度，即可快速高效的用于慢性盆腔炎的快速筛查。

具体实施方式

实施例1:核酸适配体筛选

从体外合成的随机寡聚DNA文库，5′-TGACCTAACGGCATGACTTA----N36----GGCACCATGGACCAGTTACC-3′。

所用引物:

F：5，-TGACCTAACGGCATGACTTA-3

R：5，-GGTAACTGGTCCATGGTGCC-3

将单链DNA文库扩增为双链DNA,产物经2％琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。80μg RNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与10ug SIgA蛋白37℃孵育40min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(6mol/L尿素，0.7mol/L醋酸铵，l.6mmol/L EDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行16轮。将最后一轮筛选得到的适配子上测序仪测序。测定得到序列如SEQ IDNO：1-15所示。

实施例2特异性高亲和力的SIgA结合适配子的获得

将RNA适配子分别取1.5μg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37℃消化1h，纯化回收去磷酸化的RNA；通过T4多核苷酸激酶标记[γ-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。10nmol放射性标记的RNA适配子分别与不同浓度(1-200nM)的SIgA蛋白37℃孵育30min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与SIgA蛋白的解离常数。结果如下：

名称	解离常数Kd(nM)
		SIgA ap-1	9.7
SIgA ap-2	8.5
		SIgA ap-3	7.6
SIgA ap-4	8.8
		SIgA ap-5	9.0
SIgA ap-6	10.2
		SIgA ap-7	11.3
SIgA ap-8	9.7
		SIgA ap-9	9.4
SIgA ap-10	8.6
		SIgA ap-11	11.3
SIgA ap-12	9.5
		SIgA ap-13	8.8
SIgA ap-14	9.5
		SIgA ap-15	10.5
PBS空白对照	无结合能力

实施例3所述适配子特异性分析以及稳定性分析

从以上结果可以看出，本发明的15个适配子具有非常强的结合特性，现有技术中也没有所述结合特性的适配子能够结合SIgA蛋白。

实施例4降解活性分析

分别采用人血白蛋白，IgA，IgG，血红蛋白与15条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与SIgA蛋白结合保持较高的特异性。

将所述的适配子，取0.5ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置四周。通过RT-PCR检测，发现四周的放置其结构稳定，没有被降解。

实施例5临床试验分析

将15个适配子分别用于检测同样的妇女阴道分泌物的临床样本，包括有慢性盆腔炎组和健康对照组，其中慢性盆腔炎组为60例，健康对照组为10例，以妇女的阴道分泌物作为待检样本。

将70组妇女阴道分泌物加入到无菌离心管中，加入PBS溶液震荡溶解。分别将偶联有磁珠的15组适配子与70组的阴道分泌物溶液混合孵育20分钟，而后磁分离，即可获得相应的分离的SIgA蛋白，通过检测发现，在60例慢性盆腔炎组中，15组适配子均检测到高浓度的SIgA蛋白，平均检测浓度为158.1mg/L，并且分布均匀，而在健康组中SIgA蛋白的浓度平均为10.2mg/L同样分布均匀，由此可见，可以采用本发明的15种适配子可以快速的实现100％的初步筛选的检测效果。具有极高的准确性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

〈110〉杨岭燕

〈120〉一种用于检测妇科慢性盆腔炎的试剂盒及其检测方法

〈210〉1

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉SIgAap-1

UGACCUAACGGCAUGACUUAUCCAAAUCCUCUCAUCUAUGCUACCAAUCUUACAUUGGCACCAUGGACCAGUUACC；

〈210〉2

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉SIgAap-2

UGACCUAACGGCAUGACUUACCUUCCACUCCCUUAUGCAUCUUACAUUCCCCCUCAGGCACCAUGGACCAGUUACC；

〈210〉3

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉SIgAap-3

UGACCUAACGGCAUGACUUAUUUCUACCAACUCCUUGUUCCUUCUUCACACCACUUGGCACCAUGGACCAGUUACC；

〈210〉4

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉SIgAap-4

UGACCUAACGGCAUGACUUACCCUUAUCCCAAUUUUCUGCUUCAACAUAAACAAUCGGCACCAUGGACCAGUUACC；

〈210〉5

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉SIgAap-5

UGACCUAACGGCAUGACUUAUACUAAUCAAACUCUUAGCCCACCCUCUAUCUUAUAGGCACCAUGGACCAGUUACC；

〈210〉6

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉SIgAap-6

UGACCUAACGGCAUGACUUACUCACCAUAACUUUUACGAUCUAAUACCCACACACCGGCACCAUGGACCAGUUACC；

〈210〉7

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉SIgAap-7

UGACCUAACGGCAUGACUUACCACCUAACUUCUUUAAGCUUAAAUACUUCUUCCAAGGCACCAUGGACCAGUUACC；

〈210〉8

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉SIgAap-8

UGACCUAACGGCAUGACUUACCUUCCCCAUUAAAUCAGCACCAUUCACCUCAAUCAGGCACCAUGGACCAGUUACC；

〈210〉9

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉SIgAap-9

UGACCUAACGGCAUGACTTACTCACCCATTCACTCATGACTTCATAATCTTTTCTCGGCACCATGGACCAGTTACC；

〈210〉10

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉SIgAap-10

TGACCUAACGGCAUGACUUAACCUCAAUUCCAUCCAUAUCUUAAUCUCUAUACAUAGGCACCAUGGACCAGUUACC；

〈210〉11

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉SIgAap-11

UGACCUAACGGCAUGACUUAACUCCACAUACACCCCAGACACCCCUAAUAUUAUAUGGCACCAUGGACCAGUUACC；

〈210〉12

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉SIgAap-12

UGACCUAACGGCAUGACUUAUAAUAACUACUUUUACCAGCUUCUAUCAUACCAUAUGGCACCAUGGACCAGUUACC；

〈210〉13

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉SIgAap-13

UGACCUAACGGCAUGACUUACAAUCUAAAACUCUUCUAUUCUAUACCCUUUAAUUCGGCACCAUGGACCAGUUACC；

〈210〉14

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉SIgAap-14

UGACCUAACGGCAUGACUUAAUAACAAAUCCUCCCAUCACACCCACUUAUAAAAAUGGCACCAUGGACCAGUUACC；

〈210〉15

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉SIgAap-15

UGACCUAACGGCAUGACUUAUCCUCUCCCUCCUAUAAUACAAUCCUCAAACUCUACGGCACCAUGGACCAGUUACC；

Claims (3)

1.一种用于检测慢性盆腔炎的试剂盒，其特征在于：含有能特异性结合SIgA的适体。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于为所述适体序列为包括SEQ ID No.4序列所示，或者在该序列的基础上进行的一个或几个核苷酸的替换，并保留其活性。

3. 序列如SEQ ID No.4所示的适体用于制备检测慢性盆腔炎的试剂盒中的应用。