CN106635996A - 体外扩增肿瘤干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种体外扩增肿瘤干细胞的方法，旨在解决传统体外扩增肿瘤干细胞的方法干细胞质量差的难题；其技术方案要点是一种体外扩增肿瘤干细胞的方法，包括有以下步骤：步骤1：取无血清培养基，并向无血清培养基中添加20‑35mg/L的 B27，10‑25mg/L的IFO以及1‑3mg/L 的MPF；步骤2：将培养基升温至37℃，并通过紫外线进行杀菌；步骤3：在无菌条件下将肿瘤组织移入到培养基中并同向搅拌；步骤4：向步骤3中添加0.5mg/L的Accutase，并且每隔四小时添加一次，每次比上次多0.1mg/L，每添加一次Accutase搅拌的方向反向调节；步骤5：培养时间在20‑35h后进行离心分离，得到肿瘤干细胞。本发明体外扩增肿瘤干细胞的方法干细胞质量高。

Description

体外扩增肿瘤干细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，更具体地说，特别涉及体外扩增肿瘤干细胞的方法。
背景技术
肿瘤干细胞是具有“自我复制”(Self-Renewal)以及“具有多细胞分化”(Differentiation)等能力的细胞，通常这类的细胞被认为有形成肿瘤，发展成癌症的潜力，特别是随着癌症转移出去后，产生新型癌症的来源，由于肿瘤干细胞的存在数量极少，因此很难被发现，抗癌药物也很难对其产生效果，因此为了能够尽早攻克肿瘤，需要对肿瘤干细胞进行研究，体外扩增肿瘤干细胞的技术也就应运而生。
目前，公开号为CN103571792A的中国专利公开了一种体外扩增肿瘤干细胞的方法及其加工方法，其首先确定所需体外扩增肿瘤干细胞于生物体内所处环境的基质刚度，然后利用海藻酸盐凝胶支架包埋所需体外扩增肿瘤细胞，使包埋后的凝胶支架的基质刚度为上步中所确定的肿瘤干细胞所处环境的基质刚度的90-110％，最后进行包埋后肿瘤细胞的体外三维培养，以实现肿瘤干细胞的体外扩增，但是由于肿瘤干细胞在培养的过程中发生分化，从而形成干性较小的其他细胞，并且通过肿瘤干细胞分化出来的细胞能够在培养基中进行正常的生长，所以最终所得到的细胞群中就会包括有一定的分化细胞，并使得肿瘤干细胞的质量较差。
因此，需要提出一种新的方案来解决上述问题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供体外扩增肿瘤干细胞的方法，通过除去分化出来的细胞而使得肿瘤干细胞的质量更高。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种体外扩增肿瘤干细胞的方法，包括有以下步骤：
步骤1：取无血清培养基，并向无血清培养基中添加20-35mg/L的B27，10-25mg/L的IFO以及1-3mg/L的MPF；
步骤2：将培养基升温至37℃，并通过紫外线进行杀菌；
步骤3：在无菌条件下将肿瘤组织移入到培养基中并同向搅拌；
步骤4：向步骤3中添加0.5mg/L的Accutase，并且每隔四小时添加一次，每次比上次多0.1mg/L，每添加一次Accutase搅拌的方向反向调节；
步骤5：培养时间在20-35h后进行离心分离，得到肿瘤干细胞。
通过上述技术方案，在培养基中添加的MPF能够对肿瘤干细胞产生生产促进作用，并使得干细胞能够以更快的速度进行有丝分裂，从而首先加大了可用于培养的细胞总数，然后由于在培养基中添加了Accutase，如此就使得细胞间能够相互分离，从而能够首先经已经分化的细胞从干细胞上剥离，并使得每一个细胞都能够充分接触于培养基中，然后由于在培养基中包含有IFO，通过IFO能够对肿瘤细胞产生杀死作用，并使得一部分细胞失活，由于肿瘤干细胞具有较强的抵抗外界有害物质的作用，因而通过IFO对细胞群进行选择之后，就能够使得剩余的细胞中，干细胞的比率大大增加，同时由于培养液是无血清培养基，那么分化出来的细胞就更难以生存，并最后都被消除殆尽，从而大大提高了肿瘤干细胞的质量，同时通过B27以及MPF使得干细胞的生长速度得到了有效的提高，所以同时也加快的干细胞培养的速度，培养效率高。
本发明进一步设置为，所述步骤4中在培养时间8h后添加10-15mg/L的N2。
通过上述技术方案，B27能够提供一部分肿瘤干细胞在生长过程中所需的营养物质，但是当在培养基中存在Accutase并进行反复的搅拌的时候，就会对肿瘤干细胞产生一定的损坏，但是由于N2中具有更多的添加成分，并能够促进损伤的肿瘤干细胞从打击中恢复，从而保证了肿瘤干细胞具有更多的量。
本发明进一步设置为，所述步骤1中还添加有1-3mg/L的ADM。
通过上述技术方案，ADM又称阿霉素，ADM的抗瘤谱较广，能够对肿瘤细胞产生损伤，并杀死一部分肿瘤细胞，如此从肿瘤干细胞中分化出来的细胞就难以生存，加多了分化细胞的死亡的同时，使得干细胞所占有的比率再次升高，调高了培养出的肿瘤干细胞的质量。
本发明进一步设置为，所述步骤1中还添加有0.5-2mg/L的MMC。
通过上述技术方案，MMC又称丝裂霉素，对分化出来的肿瘤细胞产生损坏，并能够提高干细胞的质量。
本发明进一步设置为，向所述步骤2中的培养基中添加20-35mg/L的蜂王浆。
通过上述技术方案，通过蜂王浆使得培养基更具有营养，肿瘤干细胞也能够更加快速的进行增值，同时也使得肿瘤干细胞在IFO环境中能够生长。
本发明的有益效果：通过无血清培养基以及MPF对肿瘤组织进行培养，在这个培养过程中，首先是通过Accutase将组织细胞分散开来，并使得每一个细胞都与培养基之间充分接触，然后通过IFO、ADM以及MMC等成分将组织上已经分化的细胞以及后期培养过程中从肿瘤干细胞中分化出来的细胞进行杀死，同时由于肿瘤干细胞具有较强的抗性，所以能够在恶劣的环境中存活下来，如此在经过一段时间的培养之后，就能够使得培养的细胞中肿瘤干细胞占有非常大的比重，提高了干细胞的数量，同时也提高了干细胞的质量；不仅如此，由于在培养基中还加入有B27，N2以及蜂王浆等，所以还能够为干细胞的生长提供充足的营养成分，并使得干细胞能够健康生长。
具体实施方式
实施例1的体外扩增肿瘤干细胞的方法的加工方法
步骤1：取普通细胞培养基并向培养基中添加肺癌组织细胞，在37℃下无菌条件下培养30h。
实施例2的体外扩增肿瘤干细胞的方法的加工方法
步骤1：取无血清培养基，并向培养基中添加肺癌组织细胞；
步骤2：向培养基中投加20mg/L的IFO，在37℃无菌条件下培养25h。
实施例3的体外扩增肿瘤干细胞的方法的加工方法
步骤1：取无血清培养基，并向培养基中投加10mg/L的IFO以及2mg/L的MPF；
步骤2：将肺癌组织细胞放入到培养基中，同时加入0.5mg/L的Accutase，并进行搅拌，然后每隔四小时进行一次添加，并且改变搅拌的方向；
步骤3：将培养基放入到37℃下的无菌条件下培养28h。
实施例4的体外扩增肿瘤干细胞的方法的加工方法
步骤1：取无血清培养基，并向培养基中投加22mg/L的IFO以及1.3mg/L的MPF；
步骤2：将肺癌组织细胞放入到培养基中，同时加入0.5mg/L的Accutase，并进行搅拌，然后每隔四小时进行一次添加，并且改变搅拌的方向，同时在搅拌八小时之后添加10mg/L的N2；
步骤3：将培养基放入到37℃下的无菌条件下培养26h。
实施例5的体外扩增肿瘤干细胞的方法的加工方法
步骤1：取无血清培养基，并向培养基中投加16mg/L的IFO，2mg/L的ADM以及1.7mg/L的MPF；
步骤2：将肺癌组织细胞放入到培养基中，同时加入0.5mg/L的Accutase，并进行搅拌，然后每隔四小时进行一次添加，并且改变搅拌的方向，同时在搅拌八小时之后添加15mg/L的N2；
步骤3：将培养基放入到37℃下的无菌条件下培养20h。
实施例6的体外扩增肿瘤干细胞的方法的加工方法
步骤1：取无血清培养基，并向培养基中投加23mg/L的IFO，3mg/L的ADM，1mg/L的MMC以及2.7mg/L的MPF；
步骤2：将肺癌组织细胞放入到培养基中，同时加入0.5mg/L的Accutase，并进行搅拌，然后每隔四小时进行一次添加，并且改变搅拌的方向，同时在搅拌八小时之后添加11mg/L的N2；
步骤3：将培养基放入到37℃下的无菌条件下培养33h。
实施例7的体外扩增肿瘤干细胞的方法的加工方法
步骤1：取无血清培养基，并向培养基中投加2mg/L的IFO，1.2mg/L的ADM，0.5mg/L的MMC以及2.4mg/L的MPF；
步骤2：将肺癌组织细胞放入到培养基中，同时加入0.5mg/L的Accutase和30mg/L的蜂王浆，并进行搅拌，然后每隔四小时进行一次添加，并且改变搅拌的方向，同时在搅拌八小时之后添加13mg/L的N2；
步骤3：将培养基放入到37℃下的无菌条件下培养35h。
产物性能表征取70只NOD/SCID小鼠，并且随机的分成十组，在面的每组细胞培养完成之后，消化成但细胞悬液，接种一定数量的细胞至每组小鼠的背部皮下，在第15周后，观察每只小鼠的肿瘤的形成，并记录，所得结果如下：
通过上述这些数据可以看出，当在无血清培养基中，同时通过IFO以及MPF进行处理的时候，能够很好的将肿瘤干细胞从肿瘤组织中提取出来并且进行较好的筛选以及培养，从而得到高质量的肿瘤干细胞，并且在加入了ADM以及MMC之后，使得对肿瘤干细胞的选择更加具有取向性，使得干细胞的选出更为优质，而且通过B27，N2和蜂王浆也为干细胞的生长提供了充分的资源，并使得干细胞能够健康的生长。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种体外扩增肿瘤干细胞的方法，其特征在于：包括有以下步骤：
步骤1：取无血清培养基，并向无血清培养基中添加20-35mg/L的 B27 ，10-25mg/L的IFO以及1-3mg/L 的MPF；
步骤2：将培养基升温至37℃，并通过紫外线进行杀菌；
步骤3：在无菌条件下将肿瘤组织移入到培养基中并同向搅拌；
步骤4：向步骤3中添加0.5mg/L的Accutase，并且每隔四小时添加一次，每次比上次多0.1mg/L，每添加一次Accutase搅拌的方向反向调节；
步骤5：培养时间在20-35h后进行离心分离，得到肿瘤干细胞。
2.根据权利要求1所述的体外扩增肿瘤干细胞的方法，其特征在于：所述步骤4中在培养时间8h后添加10-15mg/L的N2。
3.根据权利要求1所述的体外扩增肿瘤干细胞的方法，其特征在于：所述步骤1中还添加有1-3mg/L的ADM。
4.根据权利要求1所述的体外扩增肿瘤干细胞的方法，其特征在于：所述步骤1中还添加有0.5-2mg/L的MMC。
5.根据权利要求1所述的体外扩增肿瘤干细胞的方法，其特征在于：向所述步骤2中的培养基中添加20-35mg/L的蜂王浆。
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