CN106630194A - 一种适用于海洋环境氟氯氰菊酯污染的微生物修复方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种适用于海洋环境氟氯氰菊酯污染的微生物修复方法，特点是包括以下步骤：（1）筛选、驯化获得一株氟氯氰菊酯高效降解菌，该菌为Nbuzhang1菌株，分类命名为甘瓜发光杆菌；（2）采用反向微乳液聚合方法，获得针对氟氯氢菊酯具有特异识别性能的分子印迹‑量子点纳米结构聚合物；（3）将氟氯氰菊酯高效降解菌加入氟氯氰菊酯分子印迹‑量子点纳米结构聚合物，对微生物进行吸附固定形成固定微生物；（4）向适量污染海水中加入固定微生物，调整污染海水的pH值至7‑8，静止2 h，优点是具有较好的亲水性、生物相容性和较高的吸附容量，可从养殖环境中选择性吸附氟氯氰菊酯。

Description

一种适用于海洋环境氟氯氰菊酯污染的微生物修复方法
技术领域
本发明涉及海洋环境治理技术领域，尤其是涉及一种适用于海洋环境氟氯氰菊酯污染的微生物修复方法。
背景技术
拟除虫菊酯类农药一度被认为具有高效、低毒、使用安全等优点，可作为有机氯和有机磷农药的替代品，但是最近研究表明，该类农药具有蓄积性，长期接触易导致慢性疾病，有致癌、致畸、致突变的危险。同时，由于该类农药具有较强的亲脂性，对鱼类、贝类等水生生物具有很高的毒性。尤其是氟氯氢菊酯等具有内分泌干扰特性的有毒物质，具有类似生物激素的活性，极少量的残留即可对生物体的内分泌系统等产生毒害。但是研究表明，常规水处理技术和工艺无法将此类物质(尤其是微量残留条件下)完全除去，对水产育苗、养殖构成极大威胁，不仅直接导致养殖生物中毒死亡，而且可在水产品中蓄积残留，严重威胁养殖环境及水产品质量安全。因此，如何有效的去除微量具有内分泌干扰特性的拟除虫菊酯类农药(如氟氯氰菊酯等)残留污染具有重要意义。
采用固定化微生物处理技术，可以发挥载体对微量污染物的吸附、富集作用，提高微生物降解所需的底物浓度，但是，常用的固定载体如活性炭、碳纳米管等是非特异性的，尤其是环境中复杂基质的存在降低了微量污染物的吸附效果。而分子印迹材料由于具有较高的选择性、吸附容量和生物相容性，在污染物的消除方面受到了高度重视，在污染物处理过程中具有良好的应用前景。因此，将分子印迹的高效选择性和微生物降解技术相结合，特异性提高微生物降解反应所需的底物浓度，有效提高微生物降解效率，对近岸海域环境保护、水产品安全等具有重要意义，可为从根本上解决近岸海域养殖环境中氟氯氰菊酯残留对养殖环境、水产品安全带来的威胁和危害等提供技术支撑。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可高效富集海水环境中微量氟氯氰菊酯污染并将其快速降解的适用于海洋环境氟氯氰菊酯污染的微生物修复方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种适用于海洋环境氟氯氰菊酯污染的微生物修复方法，包括以下步骤：
(1)氟氯氰菊酯分子印迹-量子点纳米结构聚合物制备
将7.5mL环己烷与1.8mL Triton X-100混合并搅拌15min，加入10μL浓度为50mg/mL量子点(QDs)溶液和390μL的氯仿，然后加入50μL正硅酸乙酯(TEOS)和100μL氨水，反应2h后，加入200μL浓度为25mg/mL的氟氯氰菊酯和22.8μL(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)，反应12h，然后依次用10mL丙酮、10mL水和10mL体积比为8:2的乙醇/已腈溶液洗涤除去模板分子，得到对氟氯氰菊酯具有高效选择性的氟氯氰菊酯分子印迹-量子点纳米结构聚合物；
(2)微生物固定
将步骤(1)制备得到的氟氯氰菊酯分子印迹-量子点纳米结构聚合物按质量体积比25mg：20mL的比例加入到氟氯氰菊酯高效降解菌培养液中，并对氟氯氰菊酯高效降解菌进行吸附固定，形成分子印迹-量子点纳米结构聚合物固定微生物；
(3)海洋污水修复
将步骤(2)得到的分子印迹-量子点纳米结构聚合物固定微生物按1mg/mL的添加量加入到污染海水中，调节污染海水的pH值至7-8，温度为25℃，静止2h，即可降解污染海水中氟氯氰菊酯。
步骤(1)中所述的量子点为CdSe/ZnS，粒径介于2.5nm-6nm之间。
步骤(2)中所述的氟氯氰菊酯高效降解菌为Nbuzhang1菌株，分类命名为甘瓜发光杆菌(Photobacterium ganghwense)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别是CCTCC M 2014580，菌株的16S rRNA的Genbank登陆号为KR150790。
该菌株的生物学特征为：该菌为革兰氏阴性菌，为杆菌，碱性磷酸酶、酯酶C4、类脂酯酶C8、类酯酶C14(Weak)试验阳性，不能利用蔗糖；其可在海水中生长，最适生长温度为25-30℃，最适生长pH为8.0。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种适用于海洋环境氟氯氰菊酯污染的微生物修复方法，包括氟氯氰菊酯降解菌及生物固定化载体，即利用分子印迹-量子点纳米结构聚合物为载体使微生物固化，从而对不同浓度氟氯氰菊酯污染有机废水进行处理，获得最佳的处理参数，有效消除海洋环境中氟氯氰菊酯污染。该发明主要筛选、驯化获得高效氟氯氰菊酯降解菌，获得高选择性分子印迹-量子点纳米结构材料作为生物固定化载体，其具有较好的亲水性、生物相容性和较高的吸附容量，可从养殖环境中选择性吸附氟氯氰菊酯，特异性的提高微生物降解反应所需的底物浓度，有效提高其微生物降解效率。该菌株分别在25℃、pH8.0时对氟氯氰菊酯具有最佳的降解效果；在培养基中培养5d，氟氯氰菊酯浓度为100mg/L条件下，降解率可达74.7％；海洋污水在25-30℃，pH为8.0条件下，加入分子印迹-量子点纳米结构聚合物固定化微生物后，3d后对氟氯氰菊酯的降解率可达95％以上。
氟氯氰菊酯降解菌，该菌为Nbuzhang1菌株，分类命名为甘瓜发光杆菌(Photobacterium ganghwense)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC M2014580，保藏日期为2014年11月19日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例
一种适用于海洋环境氟氯氰菊酯污染的微生物修复方法，包括以下步骤：
1、氟氯氰菊酯高效降解菌的分离筛选、驯化
一种海水环境中氟氯氰菊酯降解菌的分离、驯化：将100mL营养培养液加入300mL三角烧瓶中，然后加入农药储备液，使得底物浓度为100mg/L。然后加入2g沉积物样品或经过海水得到的微生物，于28℃，180rpm恒温振荡培养。每隔7d转接体积百分比10％菌液至90mL新鲜营养培养液。经连续富集培养获得的稳定菌群，取0.1mL培养液进行平板划线分离、纯化，分离获得甘瓜发光杆菌，将其接种到试管斜面培养基上，于4℃低温保存。
该菌为Nbuzhang1菌株，分类命名为甘瓜发光杆菌(Photobacteriumganghwense)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别是CCTCC M 2014580，菌株的16S rRNA的Genbank登陆号为KR150790。
该菌株分别在25℃、pH8.0时对氟氯氰菊酯具有最佳的降解效果；在培养基中培养5d，氟氯氰菊酯浓度为100mg/L条件下，降解率可达74.7％。
该菌株的生物学特征如下：该菌为革兰氏阴性菌，为杆菌，碱性磷酸酶、酯酶C4、类脂酯酶C8、类酯酶C14(Weak)试验阳性，不能利用蔗糖。该菌株可在海水中生长，最适生长温度为25-30℃，最适生长pH为8.0。
2、采用反向微乳液聚合法制备氟氯氰菊酯分子印迹-量子点纳米结构聚合物方法：
将7.5mL环己烷与1.8mL Triton X-100混合并搅拌15min，加入10μL浓度为50mg/mL量子点(该量子点为CdSe/ZnS，粒径介于2.5nm-6nm之间)溶液和390μL的氯仿，然后加入50μL正硅酸乙酯(TEOS)和100μL氨水，反应2h后，加入200μL浓度为25mg/mL的氟氯氰菊酯和22.8μL(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)，反应12h，然后依次用10mL丙酮、10mL水和10mL乙醇/已腈溶液(8:2，v/v)洗涤除去模板分子，得到对氟氯氰菊酯具有高效选择性的氟氯氰菊酯分子印迹-量子点纳米结构聚合物。
3、微生物固定
将制备得到的氟氯氰菊酯分子印迹-量子点纳米结构聚合物按质量体积比25mg：20mL的比例加入到氟氯氰菊酯高效降解菌菌株中对氟氯氰菊酯高效降解菌进行吸附固定，形成分子印迹-量子点纳米结构聚合物固定微生物。
4、海洋污水修复
将分子印迹-量子点纳米结构聚合物固定微生物按1mg/mL的添加量加入到污染海水中，调节污染海水的pH值至7-8，温度为25℃，静止2h，即可降解污染海水中氟氯氰菊酯。海洋污水在25-30℃，pH为8.0条件下，加入分子印迹-量子点纳米结构聚合物固定化微生物后，3d后对氟氯氰菊酯的降解率可达95％以上。
二、对比试验
1、本方法采用固定化技术中的吸附方法，利用分子印迹-量子点纳米结构聚合物为载体使微生物固定化，从而对氟氯氰菊酯污染海水进行处理，最终获得最佳的运行参数，有效去除微量氟氯氰菊酯污染，最终确定了最佳处理参数为温度为：25-30℃，pH为7.0-8.0；停留时间：2h；聚合物添加量为每毫升污染海水中加入1mg分子印迹-量子点纳米结构聚合物固定化微生物。微生物初始浓度：OD600＝0.2。
2、对照组与处理组的对比实验数据
对照组：未添加聚合物载体(自然降解)，结果为3d后对氟氯氰菊酯的降解率为43.4％±6.7％；
处理组为本发明制备的分子印迹-量子点纳米结构聚合物固定微生物用于海洋污水修复，可达95％以上。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (4)

1.一种适用于海洋环境氟氯氰菊酯污染的微生物修复方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）氟氯氰菊酯分子印迹-量子点纳米结构聚合物制备
将7.5 mL环己烷与1.8 mL Triton X-100混合并搅拌15 min，加入10 μL浓度为50mg/mL量子点溶液和390μL的氯仿，然后加入50 μL正硅酸乙酯和100μL氨水，反应2 h后，加入200μL浓度为25mg/mL的氟氯氰菊酯和22.8 μL（3-氨丙基）三乙氧基硅烷，反应12 h，然后依次用10 mL丙酮、10 mL水和10 mL体积比为8:2的乙醇/已腈溶液洗涤除去模板分子，得到对氟氯氰菊酯具有高效选择性的氟氯氰菊酯分子印迹-量子点纳米结构聚合物；
（2）微生物固定
将步骤（1）制备得到的氟氯氰菊酯分子印迹-量子点纳米结构聚合物按质量体积比25mg：20 mL的比例加入到氟氯氰菊酯高效降解菌培养液中，并对氟氯氰菊酯高效降解菌进行吸附固定，形成分子印迹-量子点纳米结构聚合物固定微生物；
（3）海洋污水修复
将步骤（2）得到的分子印迹-量子点纳米结构聚合物固定微生物按1mg/mL的添加量加入到污染海水中，调节污染海水的pH值至7-8，温度为25℃，静止2 h，即可降解污染海水中氟氯氰菊酯。
2.根据权利要求1所述的一种适用于海洋环境氟氯氰菊酯污染的微生物修复方法，其特征在于：步骤（1）中所述的量子点为CdSe/ZnS，粒径介于2.5 nm-6nm之间。
3.根据权利要求1所述的一种适用于海洋环境氟氯氰菊酯污染的微生物修复方法，其特征在于：步骤（2）中所述的氟氯氰菊酯高效降解菌为Nbuzhang1菌株，分类命名为甘瓜发光杆菌（Photobacterium ganghwense），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别是CCTCC M 2014580，菌株的16S rRNA的Genbank登陆号为KR150790。
4.根据权利要求3所述的一种适用于海洋环境氟氯氰菊酯污染的微生物修复方法，其特征在于该菌株的生物学特征为：该菌为革兰氏阴性菌，为杆菌，碱性磷酸酶、酯酶C4、类脂酯酶C8、类酯酶C14（Weak）试验阳性，不能利用蔗糖；其可在海水中生长，最适生长温度为25-30℃，最适生长pH为8.0。
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