CN106620724B - 细胞标记探针及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞标记探针及其制备方法，该细胞标记探针包括纳米粒子或量子点以及包裹或修饰所述纳米粒子或量子点的抗坏血酸棕榈酸酯。通过上述方式，本发明能够具备较好的成像性能以及良好的生物相容性，且其构建也比较简单方便。

Description

细胞标记探针及其制备方法
技术领域
本发明涉及探针技术领域，特别是涉及一种细胞标记探针及其制备方法。
背景技术
细胞治疗是通过将自体或异体功能细胞在体外进行培养，而后回输到病人体内，借助细胞自身治疗和免疫功能达到疾病治疗目的，作为一种有效的临床疾病治疗方案备受关注。然而，回输到体内的细胞，其聚集部位难以判别，对注射部位的准确性难以做出诊断，从而影响其治疗功能发挥。因此在临床实施中，急需非侵入性成像技术对回输细胞监测。
磁共振成像技术，光学成像技术，以及光声成像技术，在活体标记与示踪治疗细胞方面具有较大应用潜能，当结合高灵敏度造影剂探针能够极大地增强成像灵敏度，获得细胞准确的生物学信息。利用纳米探针对细胞进行标记，则可以很好地获得细胞成像并进行示踪分析。
现有细胞标记用探针材料制备技术一般是通过阳离子脂质体或阳离子聚合物包裹或修饰纳米粒子形成复合粒子，通过阳离子与细胞膜表面的磷脂双分子层相互作用，促使细胞内吞，完成标记。但是这种强静电相互作用往往致使细胞膜破损，造成细胞损伤。因此以阳离子脂质体以及阳离子聚合物，构建纳米探针表现出较大的生物毒性。阴离子型纳米探针则具备较高生物安全性，但构建复杂，往往难以形成较好的细胞标记效果。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种细胞标记探针及其制备方法，能够具备较好的成像性能以及良好的生物相容性，且其构建也比较简单方便。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种细胞标记探针，所述探针包括纳米粒子或量子点以及包裹或修饰所述纳米粒子或量子点的抗坏血酸棕榈酸酯。
其中，所述探针还包括荧光染料。
其中，所述纳米粒子为氧化铁纳米粒子。
其中，所述纳米粒子为四氧化三铁纳米粒子，所述荧光染料为IR780染料。
为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种细胞标记探针的制备方法，所述方法包括：提供纳米粒子或量子点、抗坏血酸棕榈酸酯，并使之混合均匀；向混合均匀后的混合物中加入挥发性有机溶剂和水，并使之震荡均匀；将震荡均匀后的混合物中的所述挥发性有机溶剂挥发完全，进而获得所述抗坏血酸棕榈酸酯包裹或修饰所述纳米粒子或量子点的所述细胞标记探针。
其中，所述提供纳米粒子或量子点、抗坏血酸棕榈酸酯，并使之混合均匀的步骤，包括：提供纳米粒子或量子点、抗坏血酸棕榈酸酯以及荧光染料，并使之混合均匀。
其中，所述纳米粒子为四氧化三铁纳米粒子，所述挥发性有机溶剂为四氢呋喃。
其中，所述四氧化三铁纳米粒子为0.001-0.5重量份，所述抗坏血酸棕榈酸酯为0.001-10重量份，所述四氢呋喃为1-10重量份，所述水为5-100重量份。
其中，所述提供纳米粒子或量子点、抗坏血酸棕榈酸酯，并使之混合均匀的步骤，包括：提供四氧化三铁纳米粒子、抗坏血酸棕榈酸酯以及IR780染料，并使之混合均匀，其中，所述IR780染料为0.001-1重量份。
其中，所述提供四氧化三铁纳米粒子的步骤，包括：提供浓度为2-10毫克每毫升、分散在三氯甲烷、正己烷或二氯甲烷中的四氧化三铁纳米胶体溶液；将所述四氧化三铁纳米胶体溶液中的三氯甲烷、正己烷或二氯甲烷挥发完全，进而获得所述四氧化三铁纳米粒子。
其中，所述向混合均匀后的混合物中加入挥发性有机溶剂和水，并使之震荡均匀的步骤，包括：向混合均匀后的混合物中加入1-10重量份的四氢呋喃，在25-30摄氏度下，进行超声处理，并将超声处理后的混合物加入到5-100重量份水中，震荡均匀；所述四氢呋喃是通过减压旋转蒸发方法挥发完全的。
本发明的有益效果是：区别于现有技术的情况，本发明细胞标记探针包括纳米粒子或量子点以及包裹或修饰所述纳米粒子或量子点的抗坏血酸棕榈酸酯，由于该细胞标记探针是一类阴离子型探针，因此具有良好的生物相容性，且具备较好的成像性能。该探针的制备方法包括提供纳米粒子或量子点、抗坏血酸棕榈酸酯，并使之混合均匀；向混合均匀后的混合物中加入挥发性有机溶剂和水，并使之震荡均匀；将震荡均匀后的混合物中的所述挥发性有机溶剂挥发完全，进而获得该探针，相比较现有的阴离子型纳米探针的制备工艺，该探针的制备工艺简单方便，操作步骤少，材料价格也不昂贵。
附图说明
图1是样品1、样品2以及水的磁共振成像检测结果示意图；
图2是样品2和水的光声成像检测结果示意图；
图3是样品1的细胞磁共振成像检测结果示意图；
图4是样品1的细胞毒性检测结果示意图；
图5是本发明细胞标记探针的制备方法一实施方式的流程图；
图6是样品1的动态光散射检测图片示意图；
图7是样品3的动态光散射检测图片示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施方式对本发明进行详细说明。
本发明提供一种细胞标记探针，该探针包括纳米粒子或量子点以及包裹或修饰所述纳米粒子或量子点的抗坏血酸棕榈酸酯。
纳米粒子是指粒度在1-100nm之间的粒子(纳米粒子又称超细微粒)，属于胶体粒子大小的范畴。它们处于原子簇和宏观物体之间的过度区，处于微观体系和宏观体系之间，是由数目不多的原子或分子组成的集团，因此它们既非典型的微观系统亦非典型的宏观系统。
纳米材料在医学和生物工程也有许多应用。已成功开发以纳米磁性材料为药物载体的靶向药物，称为“生物导弹”。即在磁性Fe3O4纳米微粒包敷的蛋白质表面携带药物，注射进入人体血管，通过磁场导航输送到病变部位释放药物，可减少肝、脾、肾等所受由于药物产生的副作用。利用纳米传感器可获取各种生化反应的信息和电化学信息。还可以利用纳米粒子研制成纳米机器人，注入人身的血液，对人体进行全身健康检查，疏通脑血管中血栓，清除心脏动脉脂肪沉积物，甚至还能吞噬病毒，杀死癌细胞等，可以预言，随着制备纳米材料技术的发展和功能开发，会有越来越多的新型纳米材料在众多的高科技领域中得到广泛的应用。
量子点(quantum dot)是准零维的纳米材料，由少量的原子所构成。粗略地说，量子点三个维度的尺寸都在100nm以下，外观恰似一极小的点状物。量子点一般为球形或类球形，是由半导体材料(通常由IIB～ⅥA或IIIA～VA元素组成)制成的、稳定直径在2-20nm的纳米粒子，在光学生物标记等领域具有广泛的应用情景。
抗坏血酸棕榈酸酯为棕榈酸与L-抗坏血酸等天然成分酯化而成，其分子式为C22H38O7，是一种高效的氧清除剂和增效剂，被世界卫生组织(WHO)食品添加剂委员会评定为具有营养性、无毒、高效、使用安全的食品添加剂，是我国唯一可用于婴幼儿食品的抗氧化剂，本品用于食品可起到抗氧化、食品(油脂)护色、营养强化等功效。
因此，采用抗坏血酸棕榈酸酯包裹或修饰纳米粒子或量子点，构建而成的探针具有良好的生物相容性，该探针标记细胞之后可以用于细胞治疗，不会对细胞造成损伤。
其中，该探针还包括荧光染料。荧光染料泛指吸收某一波长的光波后能发射出另一波长大于吸收光的光波的物质。标记上荧光染料，还可以进一步进行荧光检测。
其中，该纳米粒子为氧化铁纳米粒子。氧化铁纳米粒子是一种多功能材料。当氧化铁颗粒尺寸小到纳米级(1～100nm)时，其表面原子数、比表面积和表面能等均随着粒径的减小而急剧增加，从而表现出小尺寸效应、量子尺寸效应、表面效应和宏观量子隧道效应等特点，具有良好的光学性质、磁性、催化性能等。
进一步，该纳米粒子为四氧化三铁纳米粒子，该荧光染料为IR780染料。当然，该纳米粒子还可以是四氧化三铁纳米粒子之外的其他纳米粒子，例如纳米金等；该荧光染料可以是IR780染料之外的其他荧光染料，例如吲哚菁绿等。
下面以样品1的探针和样品2的探针为例来说明本发明的探针的成像性能以及生物相容性。其中，样品1和样品2中，纳米粒子均是四氧化三铁纳米粒子，样品1没有标记荧光染料，样品2标记有IR780染料。
参见图1，图1是样品1、样品2以及水的磁共振成像检测结果示意图。从图1可以看出，样品1与样品2纳米探针，其横向弛豫成像性能与对照组的水相比，呈现出明显的信号差异。当该探针标记细胞的时候，根据这种信号差异，可以判断出标记细胞所在的位置，或者哪里有标记细胞，哪里没有标记细胞。
参见图2，图2是样品2和水的光声成像检测结果示意图(原始图片是彩色的图片)。光声成像(Photoacoustic Imaging，PAI)是近年来发展起来的一种非入侵式和非电离式的新型生物医学成像方法。当脉冲激光照射到生物组织中时，组织的光吸收域将产生超声信号，称这种由光激发产生的超声信号为光声信号。
从图2可以看出，样品2纳米探针其光声成像性能与对照组的水相比，呈现出明显的信号差异。当该探针标记细胞的时候，根据这种信号差异，可以判断出标记细胞所在的位置，或者哪里有标记细胞，哪里没有标记细胞。
参见图3，图3是样品1的细胞磁共振成像检测结果示意图。从图3可以看出，样品1纳米探针标记细胞后，细胞呈现明显的信号差异。
参见图4，图4是样品1的细胞毒性检测结果示意图。图4中，横坐标是铁在细胞培养基中的浓度，反应的是环境中探针的量对细胞的影响；第一个柱形图对应的是控制组。纵坐标是细胞生存能力。从图4可以看出，铁的浓度从1-25微克每毫升培养基情况下(ug/ml)，细胞的生存能力均大于100％，这说明样品1纳米探针不会对细胞造成损伤，其具有较好的生物相容性。
参见图5，图5是本发明细胞标记探针的制备方法一实施方式的流程图，该方法包括：
步骤S101：提供纳米粒子或量子点、抗坏血酸棕榈酸酯，并使之混合均匀。
步骤S102：向混合均匀后的混合物中加入挥发性有机溶剂和水，并使之震荡均匀。
抗坏血酸棕榈酸酯是非水溶性的，只能溶解在有机溶剂中，例如乙醇、油脂等。挥发性有机溶剂是为了溶解抗坏血酸棕榈酸酯，以便于溶解状态的抗坏血酸棕榈酸酯更好地包裹或修饰纳米粒子或量子点。后续抗坏血酸棕榈酸酯包裹或修饰纳米粒子或量子点的探针需要用于细胞标记，必须去掉有机溶剂，以免对细胞产生损伤，因此需要加入水，有机溶剂需要是挥发性的有机溶剂，以便于去掉。
步骤S103：将震荡均匀后的混合物中的挥发性有机溶剂挥发完全，进而获得抗坏血酸棕榈酸酯包裹或修饰纳米粒子或量子点的细胞标记探针。
本发明实施方式提供纳米粒子或量子点、抗坏血酸棕榈酸酯，并使之混合均匀；向混合均匀后的混合物中加入挥发性有机溶剂和水，并使之震荡均匀；将震荡均匀后的混合物中的所述挥发性有机溶剂挥发完全，进而获得该探针，相比较现有的阴离子型纳米探针的制备工艺，该探针的制备工艺简单方便，操作步骤少，材料价格也不昂贵。
其中，步骤S101还可以包括：提供纳米粒子或量子点、抗坏血酸棕榈酸酯以及荧光染料，并使之混合均匀。也就是说，在制备探针的时候，也标记上荧光染料。以备后续需要利用荧光染料进行检测的情况。
其中，纳米粒子为四氧化三铁纳米粒子，挥发性有机溶剂为四氢呋喃。
其中，四氧化三铁纳米粒子为0.001-0.5重量份，例如：0.001、0.01、0.05、0.1、0.3、0.5重量份等等；抗坏血酸棕榈酸酯为0.001-10重量份，例如：0.001、0.01、0.1、1、5、10重量份等等；四氢呋喃为1-10重量份，例如：1、3、5、7、10重量份等等；水为5-100重量份，例如：5、25、50、75、100重量份等等。
在实际应用中，通过调节四氧化三铁纳米粒子和抗坏血酸棕榈酸酯的重量份的比例，可以调节探针颗粒粒径的大小。抗坏血酸棕榈酸酯的比例越大，探针颗粒粒径越小，抗坏血酸棕榈酸酯的比例越小，探针颗粒粒径越大。在调节探针颗粒粒径的大小时，还可以微调节四氢呋喃和水的量份的比例，一般来说，四氢呋喃和水的量份的比例可以是1：5-1：20。
其中，在一具体的实施方式中，步骤S101具体包括：提供四氧化三铁纳米粒子、抗坏血酸棕榈酸酯以及IR780染料，并使之混合均匀，其中，IR780染料为0.001-1重量份。
具体地，提供四氧化三铁纳米粒子的步骤，包括：
提供浓度为2-10毫克每毫升、分散在三氯甲烷、正己烷或二氯甲烷中的四氧化三铁纳米胶体溶液；将四氧化三铁纳米胶体溶液中的三氯甲烷、正己烷或二氯甲烷挥发完全，进而获得四氧化三铁纳米粒子。
进一步，步骤S102可以包括：向混合均匀后的混合物中加入1-10重量份的四氢呋喃，在25-30摄氏度下，进行超声处理，并将超声处理后的混合物加入到5-100重量份水中，震荡均匀；此时，四氢呋喃是通过减压旋转蒸发方法挥发完全的。
下面以三个具体的实施例来说明上述的方法。
实施例1，构建抗坏血酸棕榈酸酯包裹或修饰的四氧化三铁纳米探针：
(1)将浓度为10mg/ml分散在三氯甲烷、正己烷或二氯甲烷中的四氧化三铁纳米晶体，加入试剂瓶中，通过真空干燥或使用惰性气体吹干的方式去除有机溶剂，然后称量纳米晶体0.005重量份；
(2)将0.010重量份的抗坏血酸棕榈酸酯与上述干燥的0.005重量份的四氧化三铁纳米晶体于温度25-30摄氏度振荡混合。混合后加入四氢呋喃溶液1重量份；
(3)将上述有机混合溶液在温度25-30摄氏度下进行超声，超声功率130W，振幅65％，然后将超声后的混合物加入到5重量份的水溶液中，震荡均匀。
(4)通过减压旋转蒸发方法去除上述水相溶液中残留的四氢呋喃溶剂，制得抗坏血酸棕榈酸酯构建的四氧化三铁纳米探针，记录为样品1。
实施例2，构建抗坏血酸棕榈酸酯包裹或修饰的四氧化三铁/IR780纳米探针：
(1)将浓度为10mg/ml分散在三氯甲烷、正己烷或二氯甲烷中的四氧化三铁纳米晶体，加入试剂瓶中，通过真空干燥或使用惰性气体吹干的方式去除有机溶剂，然后称量纳米晶体0.005重量份；
(2)将0.001重量份IR780与0.025重量份抗坏血酸棕榈酸酯与上述干燥的0.005重量份的四氧化三铁纳米晶体于温度25-30摄氏度振荡混合。混合后加入四氢呋喃溶液1重量份；
(3)将上述有机混合溶液在温度25-30摄氏度下进行超声，超声功率130W，振幅65％，然后将超声后的混合物加入到5重量份的水溶液中，震荡均匀。
(4)通过减压旋转蒸发方法去除上述水相溶液中残留的四氢呋喃溶剂，制得抗坏血酸棕榈酸酯构建的四氧化三铁/IR780纳米探针，记录为样品2。
应用实施例1的样品1探针进行细胞标记：
将所选取的小鼠腹腔巨噬细胞(RAW264.7)或骨髓间充质干细胞在2cm2细胞培养皿上进行常规细胞铺板(5*105个细胞/ml)，24小时后加入0.02mg-2mg按照实施例1制备的样品1探针，标记2-6小时后弃掉标记液，加入完全培养基后继续常规培养24-48小时后制得由样品1探针标记的小鼠腹腔巨噬细胞(RAW264.7)或骨髓间充质干细胞。样品1的动态光散射监测数据如图6所示，该样品1的探针粒径分布区间在60nm范围内。其成像效果如图1所示，与对照组相比，样品1及样品1标记的细胞的磁共振成像效果好，如图3所示。CCK-8实验验证其细胞毒性，如图4所示，样品1未见显著细胞毒性。
应用实施例2的样品2探针进行细胞标记：
将所选取的小鼠骨髓基质干细胞在2cm2细胞培养皿上进行常规细胞铺板(5*105个细胞/ml)，24小时后加入0.02mg-2mg按照实施例2制备的样品2探针，标记2-6小时后弃掉标记液，加入完全培养基后继续常规培养24-48小时后制得由四氧化三铁/IR780纳米探针标记的小鼠骨髓基质干细胞。其成像效果如图1-2所示，与对照组相比，样品2的磁共振成像及光声成像效果好。
实施例3，构建抗坏血酸棕榈酸酯包裹或修饰的四氧化三铁纳米探针：
(1)将浓度为10mg/ml分散在三氯甲烷、正己烷或二氯甲烷中的四氧化三铁纳米晶体，加入试剂瓶中，通过真空干燥或使用惰性气体吹干的方式去除有机溶剂，然后称量纳米晶体0.005重量份；
(2)将0.025重量份的抗坏血酸棕榈酸酯与上述干燥的0.005重量份的四氧化三铁纳米晶体于温度25-30摄氏度振荡混合。混合后加入四氢呋喃溶液1重量份；
(3)将上述有机混合溶液在温度25-30摄氏度下进行超声，超声功率130W，振幅65％，然后将超声后的混合物加入到5重量份的水溶液中，震荡均匀。
(4)通过减压旋转蒸发方法去除上述水相溶液中残留的四氢呋喃溶剂，制得抗坏血酸棕榈酸酯构建的四氧化三铁纳米探针，记录为样品3。
样品3的动态光散射监测数据如图7所示，该样品3的探针粒径分布区间在40nm范围内。
通过实施例1和实施例3可知，调整四氧化三铁纳米晶体与抗坏血酸棕榈酸酯之间的重量份比例，可以调整探针粒径的大小。当加大抗坏血酸棕榈酸酯的重量份时，在包裹或修饰的过程中，由于有更多的抗坏血酸棕榈酸酯围绕在四氧化三铁纳米晶体的周围，因此可以得到更小粒径的探针。当减少抗坏血酸棕榈酸酯的重量份时，在包裹或修饰的过程中，由于有更少的抗坏血酸棕榈酸酯围绕在四氧化三铁纳米晶体的周围，四氧化三铁纳米晶体便已自动聚集，形成大颗粒的四氧化三铁纳米晶体，抗坏血酸棕榈酸酯包裹或修饰大颗粒的四氧化三铁纳米晶体，因此可以得到更大粒径的探针。
以上所述仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种细胞标记探针，其特征在于，所述探针包括纳米粒子或量子点以及包裹或修饰所述纳米粒子或量子点的抗坏血酸棕榈酸酯；
所述纳米粒子为氧化铁纳米粒子或四氧化三铁纳米粒子,当所述纳米粒子为四氧化三铁纳米粒子时，所述四氧化三铁纳米粒子为0.001-0.5重量份，所述抗坏血酸棕榈酸酯为0.001-10重量份，使得可以在其相应的重量份范围之内调整四氧化三铁与抗坏血酸棕榈酸酯的重量份进而调整细胞标记探针的大小。
2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述探针还包括荧光染料。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述荧光染料为IR780染料。
4.一种细胞标记探针的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
提供纳米粒子或量子点、抗坏血酸棕榈酸酯，并使之混合均匀；
向混合均匀后的混合物中加入挥发性有机溶剂和水，并使之震荡均匀；
将震荡均匀后的混合物中的所述挥发性有机溶剂挥发完全，进而获得所述抗坏血酸棕榈酸酯包裹或修饰所述纳米粒子或量子点的所述细胞标记探针；
其中，所述纳米粒子为氧化铁纳米粒子或四氧化三铁纳米粒子,当所述纳米粒子为四氧化三铁纳米粒子时，所述四氧化三铁纳米粒子为0.001-0.5重量份，所述抗坏血酸棕榈酸酯为0.001-10重量份，使得可以在其相应的重量份范围之内调整四氧化三铁与抗坏血酸棕榈酸酯的重量份进而调整细胞标记探针的大小。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述提供纳米粒子或量子点、抗坏血酸棕榈酸酯，并使之混合均匀的步骤，包括：提供纳米粒子或量子点、抗坏血酸棕榈酸酯以及荧光染料，并使之混合均匀。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述挥发性有机溶剂为四氢呋喃。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述四氢呋喃为1-10重量份，所述水为5-100重量份。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述提供纳米粒子或量子点、抗坏血酸棕榈酸酯，并使之混合均匀的步骤，包括：提供四氧化三铁纳米粒子、抗坏血酸棕榈酸酯以及IR780染料，并使之混合均匀，其中，所述IR780染料为0.001-1重量份。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述提供四氧化三铁纳米粒子的步骤，包括：
提供浓度为2-10毫克每毫升、分散在三氯甲烷、正己烷或二氯甲烷中的四氧化三铁纳米胶体溶液；
将所述四氧化三铁纳米胶体溶液中的三氯甲烷、正己烷或二氯甲烷挥发完全，进而获得所述四氧化三铁纳米粒子。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述向混合均匀后的混合物中加入挥发性有机溶剂和水，并使之震荡均匀的步骤，包括：
向混合均匀后的混合物中加入1-10重量份的四氢呋喃，在25-30摄氏度下，进行超声处理，并将超声处理后的混合物加入到5-100重量份水中，震荡均匀；
所述四氢呋喃是通过减压旋转蒸发方法挥发完全的。
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