CN105056253A

CN105056253A - 用于脂肪干细胞标记、活体示踪和治疗的多功能纳米探针

Info

Publication number: CN105056253A
Application number: CN201510429145.8A
Authority: CN
Inventors: 刘小龙; 刘景丰; 曾永毅; 廖乃顺; 吴名
Original assignee: FUZHOU INFECTIOUS DISEASES HOSPITAL
Current assignee: FUZHOU INFECTIOUS DISEASES HOSPITAL
Priority date: 2015-07-21
Filing date: 2015-07-21
Publication date: 2015-11-18

Abstract

本发明提供一种可用于脂肪干细胞标记、活体示踪和治疗的SPIONs？clusterPDA多功能纳米探针及其制备方法。该纳米探针由核和外壳构成；所述的核为纳米四氧化三铁聚集体，所述的外壳为聚多巴胺。本发明所述SPIONs？clusterPDA多功能纳米探针可用于脂肪干细胞标记，且不影响脂肪干细胞的生物学特性，SPIONs？clusterPDA的标记浓度为0.25mM；同时可用于核磁共振成像(MRI)活体示踪脂肪干细胞在宿主活体内的生物分布和生存情况，评价脂肪干细胞治疗的疗效；而且由于该纳米探针具有较好的弛豫效率，可用于磁场引导下，加速脂肪干细胞归巢至病损区域，加快脂肪干细胞对损伤组织的修复进程；因此该纳米探针不仅可以用于活体示踪脂肪干细胞，而且可用于提高脂肪干细胞治疗效果。

Description

用于脂肪干细胞标记、活体示踪和治疗的多功能纳米探针

(一)技术领域

本发明涉及一种可用于脂肪干细胞标记、活体示踪和治疗的SPIONsclusterPDA多功能纳米探针及其应用。

(二)背景技术

脂肪干细胞(adiposetissuederivedstemcells，ADSCs)是从肝组织中分离的一种间充质干细胞，具有来源充足、体内储备量大、免疫调节功能、适合自体移植等优点，在再生治疗中被当作重要的“种子细胞”；同时，ADSCs具有多向分化性，可定向分化为心肌细胞、肝细胞、软骨细胞、成骨细胞、神经细胞等。因此，ADSCs治疗已经成为一种用于心血管疾病、肝病、骨病、神经系统疾病等重大疾病的新型治疗手段。然而ADSCs治疗多处于临床前研究阶段，其质量可控性、治疗的作用机理等尚待进一步阐述。利用细胞活体示踪技术，研究ADSCs在体内的命运，包括其归巢情况与基本活性(如增殖、分化、凋亡等)等将有助于解决脂肪干细胞治疗的上述难题。

分子影像学是细胞活体示踪的基本手段，主要包括光学成像、核磁共振成像、核医学成像。其中光学成像的穿透深度较低、无法进行人体或较大动物的成像，无临床应用价值；核医学成像技术需对细胞特异性标志物进行放射性核素标记，但ADSCs特异性标志物的缺乏及其潜在的生物安全性问题决定了该技术无法应用于脂肪干细胞的活体示踪。核磁共振成像(MRI)是目前最常用的细胞活体示踪技术，具有有效成像时间长、可用于临床等优点，可用于动态观察细胞的迁徙过程。

目前常见的MRI造影剂主要有顺磁性造影剂(T₁造影剂)和超顺性造影剂(T₂造影剂)。T₁造影剂在临床上应用最为广泛的是金属钆配合物，如钆特酸葡胺(Gd-DOTA)，但它在体内清除太快、无特异性分布并且肾毒性较大，导致MRI对比效果不能明显改善。以超顺磁性氧化铁(SPIONs)为主的T₂造影剂以其较长的体内血液循环、优异的体内安全性、成本较低及高灵敏度的特点，已经成为构建新型细胞示踪-MRI造影剂的首选材料。但是目前商业化的T₂造影剂多用于临床诊疗，其设计的初衷并不是用于细胞标记与示踪，且这些商业化造影剂仍存在着灵敏度差、磁靶向不强等缺点。

磁靶向是近年来发展起来的一种新型靶向作用，与基于受体介导的特异性靶向作用相比，这种靶向对具有磁性的纳米粒子靶向性更强，通过外加磁场的引导，可以使纳米粒子快速进入目的区域，操作更加方便。因此，应用具有磁性的纳米粒子标记脂肪干细胞，并通过磁靶向的介导，将有助于增加脂肪干细胞对病损组织的归巢效率，加速疾病的修复进程。

综上所述，开发一种具有较高灵敏度、磁靶向的T₂-MRI造影性能，同时可用于脂肪干细胞的标记、活体示踪与治疗的新型MRI造影剂具有极大的应用前景。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种适用于脂肪干细胞标记、活体示踪和治疗的SPIONsclusterPDA多功能纳米探针及其应用。

本发明采用的技术方案是：

一种用于脂肪干细胞标记、活体示踪和治疗的SPIONsclusterPDA多功能纳米探针，直径为50～100nm，由核和包覆在核表面的外壳构成，所述的核为表面包覆有油胺的疏水性纳米四氧化三铁颗粒(SPIONs)的球形聚集体(SPIONscluster)，所述的外壳为聚多巴胺。

为了提高MRI的灵敏性及T₂加权成像功能，本发明利用微乳液法在甲苯/SDS水溶液中将SPIONs组装成球形聚集体，该种纳米颗粒具有磁靶向功能和高灵敏MRI成像功能。

为了提高SPIONscluster的生物相容性，本发明在SPIONscluster表面包覆一层聚多巴胺(PDA)，从而提高了SPIONscluster的生物稳定性，同时降低其毒副作用。

因此，本发明构建的SPIONsclusterPDA纳米颗粒具有磁靶向功能和高灵敏MRI成像功能。

所述多功能纳米探针由如下方法制得：

(1)以乙酰丙酮铁为铁源，油胺为还原剂，苯醚作为溶剂，通过高分热解法获得表面包覆有油胺的疏水性纳米四氧化三铁颗粒(SPIONs)；具体步骤参考如下：将乙酰丙酮铁溶解于油胺和苯醚的混合溶液中，加热至110℃，保温1小时，除去水分。继续升温至300℃，保温2小时，晶化成核，形成四氧化三铁纳米颗粒，加入乙醇作沉淀剂，在2000g离心10分钟后，重复洗涤两次，收集得到SPIONs，其直径约为10～20nm；

(2)将表面包覆有油胺的超顺磁性纳米四氧化三铁颗粒分散在甲苯中，置于超声破碎仪中，逐步滴加SDS水溶液，超声2～3分钟，加热蒸去甲苯，得到所述球形聚集体(SPIONscluster)；具体步骤参考如下：将表面包覆有油胺的超顺磁性纳米四氧化三铁颗粒(SPIONs)分散在1.2mL甲苯中，置于超声破碎仪中逐步滴加0.8mLSDS(0.1M)水溶液，超声3分钟，90℃下加热蒸去甲苯，得到纳米聚集体(SPIONscluster)。

(3)将步骤(2)所述球形聚集体分散在多巴胺溶液中，调节pH至8～9，搅拌24～36h后，离心并洗涤2～3次，得到所述多功能纳米探针；其中所述球形聚集体和多巴胺的质量用量之比为：1～3：0.5～1(优选为2:1)。利用多巴胺结构中的邻苯二羟基与铁离子易形成稳定的五元环配合物这一特点，将多巴胺包覆在SPIONscluster表面，同时多巴胺在碱性溶液中易氧化聚合形成聚多巴胺，利用这种原理可在碱性溶液中在SPIONscluster表面包覆聚多巴胺。具体步骤参考如下：配制pH为8.5的Tris缓冲液，将多巴胺盐酸盐溶解于其中，超声下缓慢滴入SPIONscluster水溶液，磁力搅拌24小时，后经10000g离心分离，超纯水重复洗涤两次，收集得到SPIONsclusterPDA。SPIONscluster水溶液中可事先加入SDS，经调整使得反应混合液中SDS终浓度为3～5mmol/L。

本发明还涉及所述的多功能纳米探针在脂肪干细胞标记与活体示踪的中的应用。具体的，所述多功能纳米探针用于制备脂肪干细胞标记与MRI磁共振活体成像的造影剂。

本发明还涉及所述的多功能纳米探针在制备磁靶向的脂肪干细胞治疗剂中的应用。

本发明以具有超顺磁性的纳米四氧化三铁聚集体(SPIONscluster)为内核，以独特的设计方案，在SPIONscluster表面包覆一层具有生物相容性的聚多巴胺作为外壳，构建得到一种具有高灵敏度，且可用于细胞标记的MRI造影剂。

本发明所构建的SPIONsclusterPDA多功能纳米探针在不影响脂肪干细胞生物学特性的情况下，用于脂肪干细胞的标记，并进一步利用MRI成像对标记后的脂肪干细胞进行活体示踪，所述的SPIONsclusterPDA标记浓度为0.25mM。

本发明所构建的SPIONsclusterPDA多功能纳米探针可用于MRI成像活体示踪脂肪干细胞在宿主活体内的生物分布和生存情况，评价脂肪干细胞治疗的疗效；而且由于该纳米探针具有较好的弛豫效率，在磁场的引导下，可用于加速脂肪干细胞归巢至病损区域，加快脂肪干细胞对损伤组织的修复进程；因此该纳米探针不仅可以用于活体示踪脂肪干细胞，而且可用于提高脂肪干细胞治疗效果。

(四)附图说明

图1为纳米四氧化三铁颗粒(SPIONs)、纳米四氧化三铁聚集体(SPIONscluster)以及表面包覆有PDA的纳米四氧化三铁聚集体(SPIONsclusterPDA)的透射电镜图像及晶体衍射图像。A为SPIONs的透射电镜图像；B为SPIONscluster。C表示SPIONsclusterPDA多功能纳米探针透射电镜图像；D表示SPIONsclusterPDA多功能纳米探针的晶体衍射图。

图2为SPIONscluster(-■-)和SPIONsclusterPDA(…Δ…)的可见近红外吸收光谱。

图3为SPIONscluster(●)和SPIONsclusterPDA(▲)的磁化曲线和磁滞回线。

图4为SPIONscluster(-■-)和SPIONsclusterPDA(…Δ…)水溶液的温度随光照时间的变化图。

图5为SPIONsclusterPDA多功能纳米探针对脂肪干细胞的细胞毒性。图6为SPIONsclusterPDA多功能纳米探针标记脂肪干细胞后的干细胞功能考察实验。A为SPIONsclusterPDA多功能纳米探针标记脂肪干细胞的表征实验；B为SPIONsclusterPDA多功能纳米探针标记脂肪干细胞向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞的分化实验。

图7为脂肪干细胞对SPIONsclusterPDA多功能纳米探针的摄取实验。A为脂肪干细胞对SPIONsclusterPDA多功能纳米探针摄取的普鲁士蓝染色；B为不同时间下脂肪干细胞对SPIONsclusterPDA多功能纳米探针的摄取量；C为标记SPIONsclusterPDA的脂肪干细胞的体外MRI成像。

图8为MRI对标记SPIONsclusterPDA的脂肪干细胞移植到四氯化碳急性肝损伤小鼠前后的肝脏造影。

图9为在有无外加磁场引导下的标记SPIONsclusterPDA的脂肪干细胞移植到表皮损伤小鼠前后的MRI成像。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

称取1.059g乙酰丙酮铁溶解于15mL油胺和15mL苯醚的混合溶液中，加热至110℃，保温1小时，除去水分。继续升温至300℃，保温2小时，晶化成核，形成四氧化三铁纳米颗粒，加入乙醇作沉淀剂，在2000g离心10分钟后，重复洗涤两次，离心收集沉淀物，真空干燥后得到SPIONs，其直径约为10～20nm。

实施例2：

SPIONs分散在1.2mL甲苯中，配置成100mg/mL的分散液。置于超声破碎仪中逐步滴加0.8mLSDS(0.1M)水溶液，超声3分钟，90℃下加热蒸去甲苯，10000g离心10分钟，超纯水重复洗涤两次，离心收集沉淀物，真空干燥后得到纳米聚集体(SPIONscluster)。

实施例3：

称取20mg多巴胺盐酸盐溶解在18mL(pH8.5)的Tris缓冲溶液中，超声下缓慢滴入2mLSPIONscluster(10mg/mL)水溶液，磁力搅拌24小时，后经10000g离心分离，超纯水重复洗涤两次，收集得到SPIONsclusterPDA。

使用透射电子显微镜(TEM)、紫外－可见分光光度计(UV-Vis)、光热转化曲线，超导量子干涉磁强计等方法表征上述制备的SPIONsclusterPDA多功能纳米探针，具体测试结果如下：

(1)透射电子显微镜(TEM)

透射电镜图像表示SPIONs，SPIONscluster以及SPIONsclusterPDA多功能纳米探针的精细结构及晶体衍射条纹。结果参照图1，图A表示在50nm的标尺下，检测SPIONs的分布及形貌，其说明高温热解法合成的SPIONs尺寸均一，形貌一致，呈单分散分布。图B表示SPIONscluster在50nm标尺下的透射电镜图像，表明它是由SPIONs团聚而成的球状纳米聚集体。C图为SPIONsclusterPDA多功能纳米探针的形貌，其外缘的具有较低衬度的膜层，为聚多巴胺包被膜。D图为SPIONsclusterPDA多功能纳米探针的晶体衍射图。其衍射圈清晰，说明SPIONsclusterPDA多功能纳米探针具有良好的晶体结构和具有较高的结晶度。

(2)可见-近红外区域吸收(Vis-NIR)

可见-近红外吸收光谱，表示SPIONsclusterPDA多功能纳米探针合成的特征光谱。结果参照图2，(-■-)表示SPIONscluster的吸收光谱，(…Δ…)表示SPIONsclusterPDA的吸收光谱。从图中可看到，在350-900nm的波长范围内，SPIONsclusterPDA的吸收比SPIONscluster更强。

(3)光热转化性能

光热曲线表示SPIONsclusterPDA多功能纳米探针将光转换成热的性能。结果参照图3，所示在相同的功率2W/cm²600s的激光照射下，0.5mMSPIONsclusterPDA多功能纳米探针水溶液相对于SPIONscluster，有明显的升温性能，并且SPIONsclusterPDA多功能纳米探针可在较短的时间内由28℃激增到67℃，并未出现平台，说明还可继续光热转化高温；而SPIONscluster在同等浓度、相同的功率及时间照射下，温度仅从28℃升温到43℃。因此，SPIONsclusterPDA多功能纳米探针相对于SPIONscluster，高出24℃，并远高于人体正常体温，因此可以用于癌细胞的热杀伤。

(4)磁性能测试

超导量子干涉磁强计用来测量SPIONs、SPIONscluster和SPIONsclusterPDA的磁化性。结果参照图4，所示在同等浓度下，SPIONs、SPIONscluster和SPIONsclusterPDA均显示出超顺磁性能。但是SPIONsclusterPDA的磁饱和强度较SPIONs、SPIONscluster低，这是由于在相同质量下，SPIONsclusterPDA中四氧化三铁的含量更少。

(5)细胞毒性

利用不同浓度SPIONsclusterPDA多功能纳米探针如0.015625，0.03125，0.0625，0.125，0.25，0.5mM与脂肪干细胞孵育24，48h，利用细胞增殖与活性检测试剂盒(CCK8)(日本同仁化学研究所(上海))检测。结果参考图5，SPIONsclusterPDA多功能纳米探针与脂肪干细胞孵育24h或48h后，并未对细胞造成损伤或凋亡，说明SPIONsclusterPDA多功能纳米探针不具有细胞毒性。

(6)细胞表征与多向分化性实验

细胞表征与多向分化性实验，表明SPIONsclusterPDA多功能纳米探针并不影响脂肪干细胞的表征及其多向分化功能。结果参考图6，图A为SPIONsclusterPDA多功能纳米探针与脂肪干细胞孵育24h后，脂肪干细胞的表征情况；图B为SPIONsclusterPDA多功能纳米探针与脂肪干细胞孵育24h后，脂肪干细胞向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞分化的特殊染色结果；表明标记SPIONsclusterPDA多功能纳米探针不影响脂肪干细胞的表征与多向分化功能。

(7)细胞摄取能力

利用相同浓度SPIONsclusterPDA多功能纳米探针(0.25mM)与脂肪干细胞孵育后，在不同时间点观察并检测脂肪干细胞对材料的摄取效果。结果参考图7，图A为普鲁士蓝染色，a为正常对照，b、c、d、e分别表示SPIONsclusterPDA多功能纳米探针与脂肪干细胞孵育3、6、12、24h后，材料的摄取情况；图B表示SPIONsclusterPDA多功能纳米探针与脂肪干细胞孵育3、6、12、24h后，脂肪干细胞对材料的摄取量；图C表示SPIONsclusterPDA多功能纳米探针与脂肪干细胞孵育3、6、12、24h后，脂肪干细胞的MRI成像；表明SPIONsclusterPDA多功能纳米探针可用于脂肪干细胞的标记，并可用于MRI成像。

(8)体内MRI活体示踪成像

收集经SPIONsclusterPDA多功能纳米探针标记的脂肪干细胞，并经尾静脉植入到四氯化碳急性肝损伤小鼠体内，并利用MRI对移植后的脂肪干细胞进行活体示踪。结果参考图8，体内移植1h后，大量的脂肪干细胞归巢至受损的肝脏，表明SPIONsclusterPDA多功能纳米探针可用于活体示踪脂肪干细胞。

(9)磁靶向治疗

收集经SPIONsclusterPDA多功能纳米探针标记的脂肪干细胞，并经尾静脉植入到表皮损伤小鼠体内，并利用MRI对移植后的脂肪干细胞进行活体示踪，同时观察其疗效。结果参考图9，体内移植4h或24h后，大量的脂肪干细胞归巢至受损的表皮，进一步说明SPIONsclusterPDA多功能纳米探针可用于活体示踪脂肪干细胞。与无磁场引导相比，在有磁场引导下，会有更多的脂肪干细胞归巢至表皮，同时表皮的水肿情况明细减少，说明SPIONsclusterPDA多功能纳米探针还可用于脂肪干细胞的磁靶向治疗。

Claims

1.一种用于脂肪干细胞标记、活体示踪和治疗的SPIONsclusterPDA多功能纳米探针，直径为50～100nm，由核和包覆在核表面的外壳构成，所述的核为表面包覆有油胺的疏水性纳米四氧化三铁颗粒的球形聚集体，所述的外壳为聚多巴胺。

2.如权利要求1所述的多功能纳米探针，其特征在于所述多功能纳米探针由如下方法制得：

（1）以乙酰丙酮铁为铁源，油胺为还原剂，苯醚作为溶剂，通过高分热解法获得表面包覆有油胺的疏水性纳米四氧化三铁颗粒；

（2）将表面包覆有油胺的超顺磁性纳米四氧化三铁颗粒分散在甲苯中，置于超声破碎仪中，逐步滴加SDS水溶液，超声2～3分钟，加热蒸去甲苯，得到所述球形聚集体；

（3）将步骤（2）所述球形聚集体分散在多巴胺溶液中，调节pH至8～9，搅拌24～36h后，离心并洗涤2～3次，得到所述多功能纳米探针；其中所述球形聚集体和多巴胺的质量用量之比为：1～3：0.5～1。

3.如权利要求1所述的多功能纳米探针在脂肪干细胞标记与活体示踪的中的应用。

4.如权利要求3所示的应用，其特征在于所述多功能纳米探针用于制备脂肪干细胞标记与MRI磁共振活体成像的造影剂。

5.如权利要求1所述的多功能纳米探针在制备磁靶向的脂肪干细胞治疗剂中的应用。