CN106613376A - 一种盐芥的无菌嫁接方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种盐芥的无菌嫁接方法，它解决了现有技术中盐芥嫁接方法的技术空白。其技术方案为：将萌发后7‑10天的盐芥无菌苗作为砧木和接穗。在无菌条件下进行嫁接，将嫁接体置于含有琼脂粉、蔗糖和铁离子的1/2MS培养基上，18‑22℃下短日照光照下竖直培养，再将嫁接苗移至1/2hogland营养液中水培或营养土培养。本发明的嫁接方法简单易行、操作方便、减少污染、成活率高、伤害小、成本低，为小型植株嫁接提供了新思路、新方法及新途径，同时为植物嫁接在农艺性状、分子机理等现在分子及生理方面的相关理论研究提供了基础。

Description

一种盐芥的无菌嫁接方法

技术领域

本发明涉及植物嫁接技术领域，特别是涉及一种体型较小的耐盐模式植物盐芥的无菌嫁接方法。

背景技术

植物之间的嫁接是一种古老的农艺技术，时至今日，在园艺生产上，嫁接仍旧是园艺领域常用的技艺。其作为一种农业生产技术，已广泛用于农业、林业和园艺植物的栽培及科研开发。尽管嫁接技术历史悠久，但真正大量的研究始于上世纪七八十年代，特别是近十年来，随着生物技术的迅速发展，嫁接的研究逐渐从过去传统的农艺性状的研究过渡到分子机理的研究。

影响嫁接成活的因子有多种，如砧木与接穗的亲和力，砧木与接穗的质量，以及温度、湿度及光照等方面的差异等。而且，不同物种的不同时期的嫁接成活率也不同，即使是同一物种在不同时期，其嫁接体的成活率也相差很大。

盐芥属于十字花科盐芥属的一种耐盐植物，在营养土中其生长特点为：萌发后的前三周生长缓慢，然后进入迅速生长期。以盐芥作为耐盐模式植物来研究植物耐盐机理，越来越受到科学家们的重视，但盐芥作为一种小型草本植物，常规的嫁接技术难以实现，因此有关盐芥嫁接方法的研究至今未见报道。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种盐芥的无菌嫁接方法。该方法简单易行、操作方便、污染小、成活率高、伤害小、成本低，解决了由于盐芥植株小带来的嫁接操作难度大，切口不平整，嫁接成活率低等问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种盐芥的无菌嫁接方法，步骤如下：

(1)砧木和接穗准备：将盐芥种子经消毒处理后，种植于固体培养基上，层积5-7天后转入短日照或长日照条件下竖直培养，萌发后7-10天作为砧木苗或接穗苗，用于嫁接；

(2)无菌条件下进行盐芥的嫁接；

(3)嫁接体培养：将嫁接好的盐芥/盐芥复合体转入短日照培养10-15天；

(4)嫁接苗的移栽：将嫁接成功的嫁接苗移栽至水培营养液或营养土中继续培养。

优选的，步骤(1)中，盐芥种子消毒处理的方法为：用质量浓度为0.5％的NaClO消毒6-8分钟，然后用无菌水清洗4-6次。

优选的，步骤(1)中，所述固体培养基为含有琼脂粉、蔗糖和铁离子的1/2MS培养基；进一步优选的，培养基中琼脂的质量百分含量为1-1.5％；更优选为1.2％。培养基中蔗糖的质量百分含量为1％；Fe²⁺浓度为0.15mmol/L。

优选的，步骤(1)中，长日照培养的条件为：16h光照/8h黑暗，光照条件下的温度为21-23℃，黑暗条件下的温度为18-20℃，光强为8000lux，相对湿度大于70％。

优选的，步骤(2)中，所述嫁接的方法为：将长势一致的盐芥下胚轴1/2偏上端处切下，然后将作为砧木的部分移至另一含有琼脂粉的1/2MS培养基中，并套上长3-6mm，内径/外径为0.3mm/1.5mm的无菌塑料管，在解剖镜下将接穗的下胚轴与砧木在套管内对接形成嫁接体，最后将培养皿迅速封口。

优选的，步骤(1)和(3)中，短日照培养的条件为：8h光照/16h黑暗，光照条件下的温度为21-23℃，黑暗条件下的温度为18-20℃，光强为8000lux，相对湿度大于70％。

优选的，步骤(4)中，所述水培营养液为1/2Hogland营养液；所述营养土是由土、蛭石和珍珠岩按质量比3:2:1制成。

上述嫁接方法中，所述的种子消毒、播种和嫁接过程均是在无菌超净台中操作。

上述嫁接方法中，步骤(3)中，采用双面刀片切去盐芥的真叶及生长点。

本发明的有益效果：

本发明系首次提供了一种盐芥的无菌嫁接方法，本发明以萌发生长到特定时期，即萌发后7-10天的盐芥为砧木和接穗，本发明通过直接用NaClO单一灭菌减少污染，有利于种子正常萌发；通过选用1.2％的琼脂和双面刀片的使用，有利于得到切口平整，光滑且伤害最小的切面；通过在解剖镜下操作嫁接，有利于砧木与接穗形成层的更好的吻合，提高嫁接成功率。

采用本发明的嫁接方法可以解决由于盐芥植株小带来的操作困难、切口不平整、嫁接成活率低及成本高等等问题。本发明的方法简便易行，成本低，效率高，为小型植株嫁接提供了新思路，新方法及新途径，同时为植物嫁接在农艺性状、分子机理等现在分子及生理方面的相关理论研究提供了基础。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1：嫁接成功的盐芥/盐芥嫁接苗；图中，B为A的嫁接部位放大图。

图2：自制的持刀器。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

术语说明：

1/2MS培养基：指将MS培养基中的大量元素成分减半后的MS培养基。MS培养基为现有技术中常规的培养基，该培养基的配方组成是现有技术中已知的(如专利CN104604539A中公开的MS培养基)，该培养基可以购买得到，也可以自行配制。

本申请中所采用固体培养基是以1/2MS培养基为基础，并对1/2MS培养基中的琼脂粉、蔗糖和铁离子的含量进行了优化，固体培养基中琼脂的质量百分含量为1-1.5％；更优选为1.2％。培养基中蔗糖的质量百分含量为1％；Fe²⁺浓度为0.15mmol/L。

正如背景技术所介绍的，现有技术中还未有关于盐芥嫁接方法的报道，为了解决如上的技术问题，本申请提出了一种盐芥的无菌嫁接方法，具体如下：

(1)砧木和接穗材料的准备：首先是将籽粒饱满的盐芥种子用0.5％的次氯酸钠消毒并种在固体培养基(含1.2％的琼脂粉、1％的蔗糖、0.15mmol/L Fe²⁺的1/2MS培养基)中，4℃层积1周后置于长日照或短日照光照培养箱内竖直培养萌发备用。

(2)无菌条件下嫁接：首先用双面刀片将长势一致的盐芥下胚轴1/2偏上端处切下，然后将作为砧木的部分用镊子轻轻夹起移至一新的固体培养基中的培养皿中，并套上事先准备好的长约3-6mm，内径/外径为0.3mm/1.5mm的无菌塑料管中，其次在解剖镜下将接穗的下胚轴与砧木在套管内对接形成嫁接体，最后将培养皿迅速封口。

(3)嫁接体的培养：将嫁接好的盐芥/盐芥复合体置于短日照光照培养箱中竖直培养10-15天。

(4)嫁接苗的移栽：将嫁接后培养10-15天的嫁接复合体在解剖镜下观察嫁接口是否连接好，将嫁接成功的嫁接苗根据实验需要移栽至水培或营养土中继续培养。在此期间嫁接苗接穗下胚轴若有侧根出现，及时剪去。

上述嫁接方法中，用于种子消毒的方法是直接用浓度为0.5％的NaClO消毒6-8分钟，然后用无菌水清洗4-6次。此种方法避免了先用酒精消毒，再用NaClO进行二次消毒，操作步骤简化从而减少了二次污染而且种子不会灭过而影响种子萌发及后期实验。

上述嫁接方法中，采用含1.2％的琼脂粉、1％的蔗糖、0.15mmol/L Fe²⁺的1/2MS培养基，既保证足够的水分利于种子正常萌发生长，又有利于后续的取材嫁接。

上述嫁接方法中，选用萌发7-10天的略大的盐芥幼苗，其侧根已长出，且细胞分生能力强，能大大提高嫁接成活率及保证嫁接苗后期生长旺盛。由于盐芥在萌发初期生长缓慢，在营养土中萌发后的前三周为其生长缓慢期，三周后会迅速生长，在培养皿中其生长缓慢期有所缩短，但仍存在，在萌发一周后会迅速生长，因此用较小苗嫁接一方面不易成活，另一方面很容易导致嫁接后的嫁接苗生长缓慢侧根较多且长势较差，选用萌发7-10天的幼苗既利于提高嫁接苗的成活率，还能进一步保证嫁接苗后期生长的旺盛强壮。

上述嫁接方法中，所用的刀片为双面刀片。刀口锋利且薄，有利于切面平整，尽可能少的伤害形成层细胞以提高嫁接苗的成活率，为了减少污染，我们用竹签自制了简易持刀器(见图2)；而且本发明用的1.2％的琼脂浓度硬度不仅能保证足够的水分同时也足以满足切割面的平整光滑。

上述嫁接方法中，嫁接后的嫁接体置于短日照下培养，不仅有利于提高嫁接体的成活率，而且还有利于嫁接苗后期生长强壮。这是因为拟南芥生长周期短，在其受到伤害后，其生长周期就更进一步大大缩短，如果在长日照条件下，就会导致嫁接苗弱小而过早的开花结果完成其生活史。而短日照可以延长其营养生长，从而弥补长日照下的不足。

上述嫁接方法中，种子消毒接种均在无菌超净台中操作，嫁接过程也在无菌超净台中操作，而且嫁接伤口的对接是在解剖镜下操作，更有利于接穗和砧木形成层的对接，可以提高嫁接苗的成功率。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：盐芥的无菌嫁接方法

具体步骤如下：

(1)砧木和接穗材料的准备：将籽粒饱满的盐芥种子用0.5％的次氯酸钠消毒并种在固体培养基(含1.2％的琼脂粉、1％的蔗糖、0.15mmol/L Fe²⁺的1/2MS培养基)上，此过程在无菌超净台上操作。4℃层积1周后置于短日照或长日照光照培养箱内竖直培养萌发备用。用于种子消毒的方法是直接用浓度为0.5％的NaClO消毒6-8分钟，然后用无菌水清洗4-6次。此种方法避免了先用酒精消毒，再用NaClO进行二次消毒，操作步骤简化从而减少了二次污染而且不会出现因种子灭过而影响其萌发及后期实验。同时选用含1.2％的琼脂粉、1％的蔗糖、0.15mmol/L Fe²⁺的1/2MS培养基，既保证足够的水分利于种子正常萌发生长，又有利于后续的取材嫁接。其次选用萌发7-10天的略大的盐芥幼苗，其侧根已长出，且其生长缓慢期已过，细胞分裂生长的速度都在加快，这样可以满足其嫁接部位快速愈合，能大大提高嫁接成活率及保证嫁接苗后期生长旺盛。

(2)切割及无菌条件下嫁接：将萌发后7-10天长势一致的无菌苗盐芥用镊子移至新的固体培养基上，用双面刀片将盐芥的下胚轴距上端约小于1/2处平切，切开的地上部分为接穗，切下的地下部分作为砧木备用。并在解剖镜下将二者切口在内径/外径为0.3mm/1.5mm的无菌塑料管中对接好，每个直径9cm培养皿中可以嫁接7-14株，嫁接完后及时将培养皿封口以保湿。此过程在无菌超净台上操作。由于砧木和接穗均为无菌苗，比较娇嫩，打开培养皿很快就会萎蔫，且切口也易失水萎蔫，因此嫁接过程中技术人员动作要快，超净台的风速开到最小，嫁接完毕迅速封口，但动作要轻，防止嫁接体错位。其中用于嫁接的培养基中的蔗糖含量多少也影响着嫁接苗的成活率，根据筛选我们发现培养基的差别不大，而不同浓度的蔗糖对嫁接苗的成活率影响存在较大差异，其中以1％的蔗糖更有利于嫁接苗的成活，且其它条件不变的情况下污染大大降低。

(3)嫁接体的培养：将嫁接好的盐芥/盐芥复合体置于短日照光照培养箱中竖直培养10-15天。

(4)嫁接苗的移栽：将嫁接后培养10-15天的嫁接复合体在解剖镜下观察嫁接口是否连接好，将嫁接成功的嫁接苗根据实验需要移栽至水培或营养土中继续培养。在此期间嫁接苗接穗下胚轴若有侧根出现，及时剪去。

上述嫁接方法中，长日照条件为16h光照/8h黑暗，光照条件下的温度为21-23℃，黑暗条件下的温度为18-20℃，光强为8000lux，相对湿度大于70％。而上述步骤3和4中的短日照条件为8h光照/16h黑暗，温度、光强及湿度同长日照条件。嫁接后的嫁接体置于短日照下培养，不仅有利于提高嫁接体的成活率，而且还有利于嫁接苗后期生长强壮。这是因为拟南芥生长周期短，在其受到伤害后，其生长周期就更进一步大大缩短，如果在长日照条件下，就会导致嫁接苗弱小而过早的开花结果完成其生活史。而短日照可以延长其营养生长，从而弥补长日照下的不足。

对比例1：

将实施例1中对于砧木苗和接穗苗选择调整为：萌发后3-5天的盐芥苗，其他操作同实施例1。

对比例2：

将实施例1中对砧木苗和接穗苗选择调整为：萌发后13-17天的盐芥苗；其他操作同实施例1。

考察实施例1、对比例1和对比例2嫁接后嫁接苗的成活率以及后期长势，结果如表1所示。

表1：萌发时间长短对嫁接苗的影响

由表1可以看出，作为砧木和接穗的盐芥幼苗，其萌发时间的选择会影响嫁接的成活率以及嫁接苗后期的长势。与对比例1和对比例2相比，本发明实施例1选用萌发7-10天的略大的盐芥幼苗，其侧根已长出，且细胞分生能力强，能大大提高嫁接成活率及保证嫁接苗后期生长旺盛。由于盐芥在萌发初期生长缓慢，在营养土中萌发后的前三周为其生长缓慢期，三周后会迅速生长，在培养皿中其生长缓慢期有所缩短，但仍存在，在萌发一周后会迅速生长，因此用较小苗嫁接一方面不易成活，另一方面很容易导致嫁接后的嫁接苗生长缓慢侧根较多且长势较差，选用萌发7-10天的幼苗既利于提高嫁接苗的成活率，还能进一步保证嫁接苗后期生长的旺盛强壮。

对比例3：

将实施例1中固体培养基中蔗糖的浓度进行调整，其余操作同实施例1。

考察实施例1和对比例3嫁接后嫁接苗的成活率，结果如表2所示。

表2：蔗糖含量对嫁接苗的影响

由表2可以看出，蔗糖的浓度也影响着嫁接苗的成活率，不同浓度的蔗糖对嫁接苗的成活率影响存在较大差异，其中浓度1％的蔗糖有利于嫁接苗的成活且污染最小。

对比例4：

将实施例1中固体培养基中铁离子的含量进行调整，其余操作同实施例1。

考察实施例1和对比例4嫁接后嫁接苗的成活率，结果如表3所示。

表3：铁离子含量对嫁接苗的影响

由表3可以看出，用于嫁接的铁离子的浓度也影响着嫁接苗的成活率，根据筛选我们发现不同浓度的铁离子对嫁接苗的成活率影响存在较大差异，其中浓度为0.15mmol/L的铁盐更有利于嫁接苗的正常生长。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种盐芥的无菌嫁接方法，其特征在于，步骤如下：

(1)砧木和接穗准备：将盐芥种子经消毒处理后，种植于固体培养基上，层积5-7天后转入短日照或长日照条件下竖直培养，萌发后7-10天作为砧木苗或接穗苗，用于嫁接；

(2)无菌条件下进行盐芥的嫁接；

(3)嫁接体培养：将嫁接好的盐芥/盐芥复合体转入短日照培养10-15天；

(4)嫁接苗的移栽：将嫁接成功的嫁接苗移栽至水培营养液或营养土中继续培养。

2.根据权利要求1所述的无菌嫁接方法，其特征在于，步骤(1)中，盐芥种子消毒处理的方法为：用质量浓度为0.5％的NaClO消毒6-8分钟，然后用无菌水清洗4-6次。

3.根据权利要求1所述的无菌嫁接方法，其特征在于，步骤(1)中，所述固体培养基为含有琼脂粉、蔗糖和铁离子的1/2MS培养基。

4.根据权利要求3所述的无菌嫁接方法，其特征在于，培养基中琼脂的含量为1-1.5％，优选为1.2％；培养基中蔗糖的含量为1％；Fe²⁺浓度为0.15mmol/L。

5.根据权利要求1所述的无菌嫁接方法，其特征在于，步骤(1)中，长日照培养的条件为：16h光照/8h黑暗，光照条件下的温度为21-23℃，黑暗条件下的温度为18-20℃，光强为8000lux，相对湿度大于70％。

6.根据权利要求1所述的无菌嫁接方法，其特征在于，步骤(2)中，所述嫁接的方法为：将长势一致的盐芥下胚轴1/2偏上端处切下，然后将作为砧木的部分移至另一含有琼脂粉的1/2MS培养基中，并套上长3-6mm，内径/外径为0.3mm/1.5mm的无菌塑料管，在解剖镜下将接穗的下胚轴与砧木在套管内对接形成嫁接体，最后将培养皿迅速封口。

7.根据权利要求1所述的无菌嫁接方法，其特征在于，步骤(1)和(3)中，短日照培养的条件为：8h光照/16h黑暗，光照条件下的温度为21-23℃，黑暗条件下的温度为18-20℃，光强为8000lux，相对湿度大于70％。

8.根据权利要求1所述的无菌嫁接方法，其特征在于，步骤(4)中，所述水培营养液为1/2Hogland营养液；所述营养土是由土、蛭石和珍珠岩按质量比3:2:1制成。

9.根据权利要求1所述的无菌嫁接方法，其特征在于，所述的种子消毒、播种和嫁接过程均是在无菌超净台中操作。

10.根据权利要求1所述的无菌嫁接方法，其特征在于，步骤(2)中，采用双面刀片切去盐芥的真叶及生长点。