CN106596788B - 一种心脑血管药物替罗非班s构型的分离检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种心脑血管药物替罗非班S构型的分离检测方法的分离检测方法，包括如下步骤：(1)称取盐酸替罗非班消旋体，并用流动相溶液提取，制备得到进样样品；(2)采用高效液相色谱法进行手性分离。本发明提供的心脑血管药物替罗非班S构型的分离检测方法对替罗非班具有优异的分离度，由于壳聚糖廉价易得，大大降低了手性分离的成本，适于工业大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及异构体的分离方法，更具体地，本发明涉及一种心脑血管药物替罗非班S构型的分离检测方法。
背景技术
盐酸替罗非班(tirofihan hydrochloride)，化学名为N-(丁基磺酰基)-O-[4-(4-吡啶基)丁基]-L-酪氨酸盐酸盐，由Merck公司开发，是第一个上市的非肽类血小板表面糖蛋白(GP)IIb/IIIa受体拮抗剂，具有高效、高选择性、可逆等优点。1998年5月首次在美国上市，2004年8月在国内上市，是目前国内唯一的血小板模GP IIb/IIIa受体拮抗剂，临床用于治疗急性冠脉综合症，包括不稳定性心绞痛或无Q波心肌梗死患者，以及行经皮腔内冠状动脉成形术或动脉粥样斑块切除术的患者，该药物作用机制独特、临床疗效确切，安全性好，是一种极有发展前途的治疗药物受体拮抗剂，具有高效"高选择性"可逆等优点。
由于替罗非班具有一个手性C原子，合成出的替罗非班具有两种构型，其中只有S构型的替罗非班才是治疗有效成分，而R构型的替罗非班则必须作为杂质严格控制其含量。但传统的手性分离方法对替罗非班的手性分离多选用卵粘蛋白的手性色谱柱，但卵粘蛋白手性色谱柱成本过高，使用寿命短，大大增加了替罗非班的分离成本，因此亟待开发出一种新的高效，低成本的分离检测方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种心脑血管药物替罗非班S构型的分离检测方法的分离检测方法。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种心脑血管药物替罗非班S构型的分离检测方法，包括如下步骤：
(1)称取盐酸替罗非班消旋体，并用流动相溶液提取，制备得到进样样品；
(2)采用高效液相色谱法进行手性分离。
作为一种优选的技术方案，所述高效液相色谱法的固定相填料为硅胶类
填料。
作为一种优选的技术方案，所述高效液相色谱法所用色谱柱的固定相填
料为壳聚糖改性硅胶手性色谱柱。
作为一种优选的技术方案，所述高效液相色谱的流动相包括由水相和有机相。
作为一种优选的技术方案，所述有机相选自乙腈或甲醇中的一种或两种的组合。
作为一种优选的技术方案，所述水相选自三氟乙酸水溶液或醋酸铵缓冲溶液。
作为一种优选的技术方案，所述有机相与水相的体积比为30：70～22：78。
作为一种优选的技术方案，所述三氟乙酸水溶液摩尔浓度为5％～8％。
作为一种优选的技术方案，所述醋酸铵缓冲溶液摩尔浓度为6％～7％。
作为一种优选的技术方案，所述心脑血管药物替罗非班S构型的分离检测方法中检测波长为200～245nm。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1本发明检查分析方法对分离S构型替罗非班的高效液相谱图
具体实施方式
参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
一种心脑血管药物替罗非班S构型的分离检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)称取盐酸替罗非班消旋体，并用流动相溶液提取，制备得到进样样品；
(2)采用高效液相色谱法进行手性分离。
替罗非班：
盐酸替罗非班化学名为N-(丁基磺酞基)-O-(4-4吡啶基)丁基]-L-酪氨酸盐酸盐，由Merck公司开发，是第一个上市的非肽类血小板表面糖蛋白(GP)IIb/IIIa受体拮抗剂，具有高效、高选择性、可逆等优点。2004年8月在国内上市，是目前国内惟一的血小板GP IIb/IIIa受体拮抗剂，作用机制独特、治疗急性冠脉综合征疗效确切，安全性好，是一种极有发展前途的抗血小板新药。目前临床上使用的盐酸替罗非班是S型，根据我国药品注册的有关技术要求，应控制其R构体杂质的含量。药品注册标准中采用卵黏蛋白手性柱测定盐酸替罗非班中异构体的含量，但卵黏蛋白手性柱国内供应商少且价格昂贵，因此本发明提出改进替罗非班手性柱中的固定相，在提高分离效率的同时，降低成本。
替罗非班(S型)化学结构：
高效液相色谱
高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography\HPLC)又称"高压液相色谱"、"高速液相色谱"、"高分离度液相色谱"、"近代柱色谱"等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
固定相
分离载体是实现分离分析过程的核心。硅胶基质载体具有强度好，多孔结构，比表面积易于人为控制，良好的物理化学稳定性、生物相容性，具有足够的具有反应活性的硅羟基等优点，因而是各种分离载体的理想基质材料，同时也是众多复合材料分离介质的重要组成部分。基于硅胶基质的分离载体己经被广泛应用于催化、环境科学和色谱等领域，对其进行功能化修饰是至关重要的。众多分离难题的解决都与硅胶基质分离载体的功能化发展有着密不可分的联系。
硅胶的化学成分是二氧化硅，物理化学性质极其稳定。用作分离载体基质的硅胶都是人工合成的。随着合成方法的逐渐改进和对硅胶基本性质研究的深入，目前所合成的硅胶具有机械强度高、比表面积大及表面易于修饰与控制的特点，其优异的物理、化学和机械特性使其成为功能化分离载体的一种不可替代的基质。
硅胶颗粒可以分为球型和无定型两种。一般而言，球型硅胶由于其可渗透性强，比无定型硅胶更有利于传质，且可减小操作压力，因而更适合用作高相液相色谱填料。较之硅胶颗粒的外形，粒径分布显得更为重要，它将直接影响硅胶基质填充柱的压力。在高效液相色谱中，色谱柱所用填料的粒径分布对其柱效影响很大。考虑到柱效的问题，硅胶颗粒的孔结构是非常重要的参数。因为孔结构不仅影响到孔径的计算，而且影响到孔径分布、孔容及表面积等重要参数，正是这些参数决定着其作为正、反相乃至其它高效液相色谱用填料的性能，且对其作为基质进行化学键合反应以及分离过程与机理等均有不可忽视的影响。孔结构有几个重要表征参数:平均孔径，比表面积，比孔容和孔径分布等。多孔硅胶可以分为微孔、中孔和大孔硅胶。一般将小于2nm的称为微孔硅胶，对于大于2nm而小于50nm的称为中孔硅胶，超过50nm的称为大孔硅胶。作为一种优选的技术方案，本发明选用的硅胶为中孔硅胶。
以硅胶为基质制备的液相色谱固定相具有机械强度高、化学性质和热稳定性好等优点，现己广泛应用于化学、工业和催化等领域。其在化学方面主要应用于含量的测定和化合物的分离分析。硅胶表面含有丰富的硅羟基(Si-OH)，这些硅羟基是硅胶表面的主要吸附位点和最具反应活性的官能基团，是进行表面化学键合和改性的基础。可通过3种途径对硅胶表面进行修饰，即涂层法、整体修饰和表面硅羟基的化学修饰。其中表面硅羟基的化学修饰简单易行，且所得到的固定相能稳定，本发明选择此种方法制备得到具有优异分离性能的固定相。在这类方法中，采用各类有机试剂与硅羟基进行反应，从而在硅胶的表面共价键合不同的官能基团，可得到满足不同分离需求的色谱固定相。
作为一种优选的技术方案，所述高效液相色谱法的固定相填料为硅胶类填料。
作为一种优选的技术方案，所述高效液相色谱法所用色谱柱的固定相填料为壳聚糖改性硅胶手性色谱柱。
壳聚糖改性硅胶色谱柱固定相的制备
将酸浸泡硅胶，并回流，然后用二次蒸馏水洗至中性，用丙酮洗三次，烘烤除水活化，冷却后保存于干燥器中备用。取经活化的干燥硅胶，加入无水干燥甲苯，搅拌下加入KH-560和三乙胺催化剂。在N2保护下加热回流，冷却，用甲苯抽提，依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤，下真空干燥，得到偶联剂键合硅胶物质，制备得到硅胶前体。
称取硅胶前体，加热搅拌下，向其中加入壳聚糖，乙酸、甲苯。滴加高氯酸用作催化剂，在N2保护下加热回流，冷却，调节PH至中性，析出固体，即得壳聚糖改性硅胶色谱柱固定相。
作为一种优选的实施方式，所述高效液相色谱法所用色谱柱的固定相填料为壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱。
壳聚糖衍生物的制备
向装有搅拌器的三口烧瓶中，加入一定量体积比为的石蜡和水、乳化剂司盘80以及乙酸，乳化加入壳聚糖，搅拌均匀，升温至，同时将溶液pH调至9～10之间，加入一定量的环氧氯丙烷，升温，加入足量对甲苯酰胺，至反应完全，重结晶分离，即得壳聚糖衍生物。
壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相的制备
将盐酸浸泡硅胶，并回流，然后用二次蒸馏水洗至中性，用丙酮洗三次，烘烤除水活化，冷却后保存于干燥器中备用。取经活化的干燥硅胶，加入无水干燥甲苯，搅拌下加入KH-560和三乙胺催化剂。在N2保护下加热回流，冷却，用甲苯抽提，依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤，真空干燥，得到偶联剂键合硅胶物质，制备得到硅胶前体。
称取硅胶前体，加热搅拌下，向其中加入上述壳聚糖衍生物，乙酸、甲苯。滴加高氯酸用作催化剂，在N2保护下加热回流，冷却，调节PH至中性，析出固体，即得壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相。
色谱柱的填充
将空柱子仔细以乙醇或丙酮清洗干净，用表面活性剂和去离子水依次清洗，并以长竹签或塑料棒扎上棉纱或纱布往复抽擦，以除去污垢。但应注意不要伤及内壁表面的光洁度，尤其不能造成轴向的划痕。将清洁的柱管的一端装配上带滤板的柱头，另一端则连接至匀浆罐上。配置四氢呋喃：异丙醇＝95％：5％的溶液20mL，称取2.50g上述自制填料倒入上述溶液中摇动或搅拌均匀后，超声处理，以中强的超声波令填料粒子均匀而稳定地悬浮起来。最后，再以强超声波短时间强化一下。超声处理的时间不宜过长，不超过3min，过长则可能造成颗粒的破碎。使用RPL-ZD 10装柱机。首先以2Hz排除气泡。色谱柱为4.6mm×150mm的柱子，取20ml丙酮装入匀浆罐中打底，接着快速倒入准备好的匀浆液，如匀浆罐不满用丙酮填满，装满后，将匀浆罐盖好、旋紧，迅速加压到40MPa，直至流出液体为80mL左右，缓慢减小压力直至停泵，停泵30min后再卸柱。拆下己填装好的柱子并装配上带有筛板的柱头，即得。
本发明提供的手性色谱柱固定相解决了传统高效液相色谱柱对替罗非班手性分离效果差，检查不灵敏，手性柱成本高的问题，采用壳聚糖改性硅胶基体制备得到新型固定相壳聚糖分子链的糖残基上含有羟基和氨基，因此壳聚糖的化学改性即可以在羟基上反应，又可以在氨基上反应。壳聚糖上有两种羟基，一种是C6—OH，这是一级羟基；另一种是C3—OH，这是二级羟基，C6—OH既是一级羟基，在空间构象上来说，又可以较为自由地旋转，位阻也小，而C3—OH既是二级羟基，又不能自由旋转，空间位阻大些，所以一般情况下C6—OH的反应活性大于C3—OH。壳聚糖的糖残基在C2上有一个氨基，在C3上有一个羟基，从构象上来看，它们都是平伏键，这种特殊的结构，使得在分离替罗非班的时候，具有高的分离准确性。
壳聚糖不同于其他天然多糖类，由于其分子结构中存在大量的游离氨基，游离氨基活性较高，替罗非班的化学结构中含有羧基，对于壳聚糖作为手性分离的固定相存在一定的技术阻力，虽然分离由于氨基与羧基在高效液相色谱中加之压力的作用，使得吸附有所减少，分离准确高，但分离效果并不理想，在对壳聚糖进行改性，后引入对甲苯酰胺基团克服了这个难题，使得用价格低廉的壳聚糖衍生物改性硅胶作为固定相对替罗非班具有高的分离效率以及高的分离度。
作为一种优选的技术方案，所述高效液相色谱法的流动相包括由水相和有机相。
作为一种进一步优选的技术方案，所述有机相选自乙腈或甲醇中的一种或两种的组合，所述水相选自三氟乙酸水溶液或醋酸铵缓冲溶液。对于替罗非班的分离，采用醋酸铵水溶液作为流动相，分离效果并不理想，但在本发明中，发明人经过多次大量实验证明，采用壳聚糖衍生物固定相，对于醋酸铵水溶液做流动相有良好的包容度，可得到将替罗非班完全分离的效果。
更为优选地，所述有机相与水相的体积比为30：70～22：78。
作为一种更进一步优选的技术方案，所述三氟乙酸水溶液摩尔浓度为5％～8％，所述醋酸铵缓冲溶液摩尔浓度为6％～7％，所述进样样品的摩尔浓度为0.5％～1％。
高效液相色谱条件：检测流速为每分钟1ml；柱温常温；检测波长为200～245nm。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明所述的原料没有特殊说明均为市售。
实施例1
将3mo1/L盐酸中浸泡10g硅胶，并加热回流10h，然后用二次蒸馏水洗至中性，用丙酮洗三次，在150℃下烘烤除水活化8h，冷却后保存于干燥器中备用。取6.0g经活化的干燥硅胶，加入100mL无水干燥甲苯，搅拌下加入4.0mL KH-560和3滴三乙胺催化剂。在N2保护下加热回流24h，冷却，用甲苯抽提24h，依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤，80℃下真空干燥8h，得到偶联剂键合硅胶物质，制备得到硅胶前体。
称取硅胶前体10g，加热搅拌下，向其中加入壳聚糖，乙酸、甲苯。滴加2滴高氯酸用作催化剂，在N2保护下加热回流24h，冷却，调节PH至中性，析出固体，即得壳聚糖改性硅胶色谱柱固定相。
流动相为三氟乙酸水溶液，摩尔浓度为5％，且与甲醇的体积比为70：30，流速为每分钟1ml；检测波长为220nm。
实施例2
将3mo1/L盐酸中浸泡10g硅胶，并加热回流10h，然后用二次蒸馏水洗至中性，用丙酮洗三次，在150℃下烘烤除水活化8h，冷却后保存于干燥器中备用。取6.0g经活化的干燥硅胶，加入100mL无水干燥甲苯，搅拌下加入4.0mL KH-560和3滴三乙胺催化剂。在N2保护下加热回流24h，冷却，用甲苯抽提24h，依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤，80℃下真空干燥8h，得到偶联剂键合硅胶物质，制备得到硅胶前体。
称取硅胶前体10g，加热搅拌下，向其中加入壳聚糖，乙酸、甲苯。滴加2滴高氯酸用作催化剂，在N2保护下加热回流24h，冷却，调节PH至中性，析出固体，即得壳聚糖改性硅胶色谱柱固定相。
流动相为三氟乙酸水溶液，摩尔浓度为6％，且与甲醇的体积比为78：22，流速为每分钟1ml；检测波长为225nm。
实施例3
将3mo1/L盐酸中浸泡10g硅胶，并加热回流10h，然后用二次蒸馏水洗至中性，用丙酮洗三次，在150℃下烘烤除水活化8h，冷却后保存于干燥器中备用。取6.0g经活化的干燥硅胶，加入100mL无水干燥甲苯，搅拌下加入4.0mL KH-560和3滴三乙胺催化剂。在N2保护下加热回流24h，冷却，用甲苯抽提24h，依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤，80℃下真空干燥8h，得到偶联剂键合硅胶物质，制备得到硅胶前体。
称取硅胶前体10g，加热搅拌下，向其中加入壳聚糖，乙酸、甲苯。滴加2滴高氯酸用作催化剂，在N2保护下加热回流24h，冷却，调节PH至中性，析出固体，即得壳聚糖改性硅胶色谱柱固定相。
流动相为三氟乙酸水溶液，摩尔浓度为6％，且与乙腈的体积比为75：25，流速为每分钟1ml；检测波长为225nm。
实施例4
壳聚糖衍生物的制备
向装有搅拌器的500mL三口烧瓶中，加入100ml体积比为1:1的石蜡和水、3g司盘80以及1mL乙酸，在30℃下乳化30min加入2g壳聚糖，搅拌均匀，升温至60℃，同时将溶液pH调至9～10之间，加入2.3g环氧氯丙烷，反应2h，继续升温至70℃，加入4g对甲苯酰胺，至反应完全，重结晶分离，即得壳聚糖衍生物。
壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相的制备
将3mo1/L盐酸浸泡硅胶，并回流10h，然后用二次蒸馏水洗至中性，用丙酮洗三次，在160℃下烘烤除水活化8h，冷却后保存于干燥器中备用。取6.0g经活化的干燥硅胶，加入100mL无水干燥甲苯，搅拌下加入4.0mL KH-560和3滴三乙胺催化剂。在N2保护下加热回流24h，冷却，用甲苯抽提24h，依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤，80℃下真空干燥8h，得到偶联剂键合硅胶物质，制备得到硅胶前体。
称取硅胶前体5g，加热搅拌下，向其中加入上述1.5g壳聚糖衍生物，乙酸、甲苯。滴加2滴高氯酸用作催化剂，在N2保护下加热回流24h，冷却，调节PH至中性，析出固体，即得壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相。
流动相为三氟乙酸水溶液，摩尔浓度为5％，且与甲醇的体积比为70：30，流速为每分钟1ml；检测波长为220nm。
实施例5
壳聚糖衍生物的制备
向装有搅拌器的500mL三口烧瓶中，加入100ml体积比为1:1的石蜡和水、3g司盘80以及1mL乙酸，在30℃下乳化30min加入2g壳聚糖，搅拌均匀，升温至60℃，同时将溶液pH调至9～10之间，加入2.3g环氧氯丙烷，反应2h，继续升温至70℃，加入4g对甲苯酰胺，至反应完全，重结晶分离，即得壳聚糖衍生物。
壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相的制备
将3mo1/L盐酸浸泡硅胶，并回流10h，然后用二次蒸馏水洗至中性，用丙酮洗三次，在160℃下烘烤除水活化8h，冷却后保存于干燥器中备用。取6.0g经活化的干燥硅胶，加入100mL无水干燥甲苯，搅拌下加入4.0mL KH-560和3滴三乙胺催化剂。在N2保护下加热回流24h，冷却，用甲苯抽提24h，依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤，80℃下真空干燥8h，得到偶联剂键合硅胶物质，制备得到硅胶前体。
称取硅胶前体5g，加热搅拌下，向其中加入上述1.5g壳聚糖衍生物，乙酸、甲苯。滴加2滴高氯酸用作催化剂，在N2保护下加热回流24h，冷却，调节PH至中性，析出固体，即得壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相。
流动相为三氟乙酸水溶液，摩尔浓度为6％，且与甲醇的体积比为78：22，流速为每分钟1ml；检测波长为225nm。
实施例6
壳聚糖衍生物的制备
向装有搅拌器的500mL三口烧瓶中，加入100ml体积比为1:1的石蜡和水、3g司盘80以及1mL乙酸，在30℃下乳化30min加入2g壳聚糖，搅拌均匀，升温至60℃，同时将溶液pH调至9～10之间，加入2.3g环氧氯丙烷，反应2h，继续升温至70℃，加入4g对甲苯酰胺，至反应完全，重结晶分离，即得壳聚糖衍生物。
壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相的制备
将3mo1/L盐酸浸泡硅胶，并回流10h，然后用二次蒸馏水洗至中性，用丙酮洗三次，在160℃下烘烤除水活化8h，冷却后保存于干燥器中备用。取6.0g经活化的干燥硅胶，加入100mL无水干燥甲苯，搅拌下加入4.0mL KH-560和3滴三乙胺催化剂。在N2保护下加热回流24h，冷却，用甲苯抽提24h，依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤，80℃下真空干燥8h，得到偶联剂键合硅胶物质，制备得到硅胶前体。
称取硅胶前体5g，加热搅拌下，向其中加入上述1.5g壳聚糖衍生物，乙酸、甲苯。滴加2滴高氯酸用作催化剂，在N2保护下加热回流24h，冷却，调节PH至中性，析出固体，即得壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相。
流动相为三氟乙酸水溶液，摩尔浓度为6％，且与乙腈的体积比为75：25，流速为每分钟1ml；检测波长为225nm。
实施例7
壳聚糖衍生物的制备
向装有搅拌器的500mL三口烧瓶中，加入100ml体积比为1:1的石蜡和水、3g司盘80以及1mL乙酸，在30℃下乳化30min加入2g壳聚糖，搅拌均匀，升温至60℃，同时将溶液pH调至9～10之间，加入2.3g环氧氯丙烷，反应2h，继续升温至70℃，加入4g对甲苯酰胺，至反应完全，重结晶分离，即得壳聚糖衍生物。
壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相的制备
将3mo1/L盐酸浸泡硅胶，并回流10h，然后用二次蒸馏水洗至中性，用丙酮洗三次，在160℃下烘烤除水活化8h，冷却后保存于干燥器中备用。取6.0g经活化的干燥硅胶，加入100mL无水干燥甲苯，搅拌下加入4.0mL KH-560和3滴三乙胺催化剂。在N2保护下加热回流24h，冷却，用甲苯抽提24h，依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤，80℃下真空干燥8h，得到偶联剂键合硅胶物质，制备得到硅胶前体。
称取硅胶前体5g，加热搅拌下，向其中加入上述1.5g壳聚糖衍生物，乙酸、甲苯。滴加2滴高氯酸用作催化剂，在N2保护下加热回流24h，冷却，调节PH至中性，析出固体，即得壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相。
流动相为三氟乙酸水溶液，摩尔浓度为6％，且与甲醇的体积比为78：22，流速为每分钟1ml；检测波长为230nm。
实施例8
壳聚糖衍生物的制备
向装有搅拌器的500mL三口烧瓶中，加入100ml体积比为1:1的石蜡和水、3g司盘80以及1mL乙酸，在30℃下乳化30min加入2g壳聚糖，搅拌均匀，升温至60℃，同时将溶液pH调至9～10之间，加入2.3g环氧氯丙烷，反应2h，继续升温至70℃，加入4g对甲苯酰胺，至反应完全，重结晶分离，即得壳聚糖衍生物。
壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相的制备
将3mo1/L盐酸浸泡硅胶，并回流10h，然后用二次蒸馏水洗至中性，用丙酮洗三次，在160℃下烘烤除水活化8h，冷却后保存于干燥器中备用。取6.0g经活化的干燥硅胶，加入100mL无水干燥甲苯，搅拌下加入4.0mL KH-560和3滴三乙胺催化剂。在N2保护下加热回流24h，冷却，用甲苯抽提24h，依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤，80℃下真空干燥8h，得到偶联剂键合硅胶物质，制备得到硅胶前体。
称取硅胶前体5g，加热搅拌下，向其中加入上述1.5g壳聚糖衍生物，乙酸、甲苯。滴加2滴高氯酸用作催化剂，在N2保护下加热回流24h，冷却，调节PH至中性，析出固体，即得壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相。
流动相为三氟乙酸水溶液，摩尔浓度为7％，且与甲醇的体积比为78：22，流速为每分钟1ml；检测波长为235nm。
实施例9
壳聚糖衍生物的制备
向装有搅拌器的500mL三口烧瓶中，加入100ml体积比为1:1的石蜡和水、3g司盘80以及1mL乙酸，在30℃下乳化30min加入2g壳聚糖，搅拌均匀，升温至60℃，同时将溶液pH调至9～10之间，加入2.3g环氧氯丙烷，反应2h，继续升温至70℃，加入4g对甲苯酰胺，至反应完全，重结晶分离，即得壳聚糖衍生物。
壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相的制备
将3mo1/L盐酸浸泡硅胶，并回流10h，然后用二次蒸馏水洗至中性，用丙酮洗三次，在160℃下烘烤除水活化8h，冷却后保存于干燥器中备用。取6.0g经活化的干燥硅胶，加入100mL无水干燥甲苯，搅拌下加入4.0mL KH-560和3滴三乙胺催化剂。在N2保护下加热回流24h，冷却，用甲苯抽提24h，依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤，80℃下真空干燥8h，得到偶联剂键合硅胶物质，制备得到硅胶前体。
称取硅胶前体5g，加热搅拌下，向其中加入上述1.5g壳聚糖衍生物，乙酸、甲苯。滴加2滴高氯酸用作催化剂，在N2保护下加热回流24h，冷却，调节PH至中性，析出固体，即得壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相。
流动相为三氟乙酸水溶液，摩尔浓度为8％，且与甲醇的体积比为78：22，流速为每分钟1ml；检测波长为247nm。
实施例10
壳聚糖衍生物的制备
向装有搅拌器的500mL三口烧瓶中，加入100ml体积比为1:1的石蜡和水、3g司盘80以及1mL乙酸，在30℃下乳化30min加入2g壳聚糖，搅拌均匀，升温至60℃，同时将溶液pH调至9～10之间，加入2.3g环氧氯丙烷，反应2h，继续升温至70℃，加入4g对甲苯酰胺，至反应完全，重结晶分离，即得壳聚糖衍生物。
壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相的制备
将3mo1/L盐酸浸泡硅胶，并回流10h，然后用二次蒸馏水洗至中性，用丙酮洗三次，在160℃下烘烤除水活化8h，冷却后保存于干燥器中备用。取6.0g经活化的干燥硅胶，加入100mL无水干燥甲苯，搅拌下加入4.0mL KH-560和3滴三乙胺催化剂。在N2保护下加热回流24h，冷却，用甲苯抽提24h，依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤，80℃下真空干燥8h，得到偶联剂键合硅胶物质，制备得到硅胶前体。
称取硅胶前体5g，加热搅拌下，向其中加入上述1.5g壳聚糖衍生物，乙酸、甲苯。滴加2滴高氯酸用作催化剂，在N2保护下加热回流24h，冷却，调节PH至中性，析出固体，即得壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相。
流动相为三氟乙酸水溶液，摩尔浓度为8％，且与甲醇的体积比为70：30，流速为每分钟1ml；检测波长为247nm。
实施例11
壳聚糖衍生物的制备
向装有搅拌器的500mL三口烧瓶中，加入100ml体积比为1:1的石蜡和水、3g司盘80以及1mL乙酸，在30℃下乳化30min加入2g壳聚糖，搅拌均匀，升温至60℃，同时将溶液pH调至9～10之间，加入2.3g环氧氯丙烷，反应2h，继续升温至70℃，加入4g对甲苯酰胺，至反应完全，重结晶分离，即得壳聚糖衍生物。
壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相的制备
将3mo1/L盐酸浸泡硅胶，并回流10h，然后用二次蒸馏水洗至中性，用丙酮洗三次，在160℃下烘烤除水活化8h，冷却后保存于干燥器中备用。取6.0g经活化的干燥硅胶，加入100mL无水干燥甲苯，搅拌下加入4.0mL KH-560和3滴三乙胺催化剂。在N2保护下加热回流24h，冷却，用甲苯抽提24h，依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤，80℃下真空干燥8h，得到偶联剂键合硅胶物质，制备得到硅胶前体。
称取硅胶前体5g，加热搅拌下，向其中加入上述1.5g壳聚糖衍生物，乙酸、甲苯。滴加2滴高氯酸用作催化剂，在N2保护下加热回流24h，冷却，调节PH至中性，析出固体，即得壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相。
流动相为醋酸铵水溶液，摩尔浓度为8％，且与甲醇的体积比为75：25，流速为每分钟1ml；检测波长为240nm。
对比例1
固定相为卵粘蛋白的手性柱，购买自北京绿百草科技发展有限公司。型号150×4.6mm。
流动相为三氟乙酸水溶液，摩尔浓度为8％，且与甲醇的体积比为75：25，流速为每分钟1ml；检测波长为240nm。
对比例2
固定相为纤维素涂敷型手性柱，购买自大赛璐药物手性技术(上海)有限公司。
流动相为三氟乙酸水溶液，摩尔浓度为8％，且与甲醇的体积比为75：25，流速为每分钟1ml；检测波长为240nm。
性能测试
将实施例中手性柱的制备参照说明书中具体实施方式中的制备方法。按实施例与对比例中的手性分离条件对替罗非班消旋体进行手性分离，进样量为10μL。
表1分离测试结果
通过表1的实施例与对比例的分离测试结果得到如下结论：
本发明提供的心脑血管药物替罗非班S构型的分离检测方法对替罗非班具有优异的分离度，由于壳聚糖廉价易得，大大降低了手性分离的成本，适于工业大规模生产。
Claims (2)
1.一种心脑血管药物替罗非班S构型的分离检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)称取盐酸替罗非班消旋体，并用流动相溶液提取，制备得到进样样品；
(2)采用高效液相色谱法进行手性分离；
所述高效液相色谱法的固定相填料为壳聚糖改性硅胶填料；
所述高效液相色谱法的流动相包括由水相和有机相；
所述有机相选自乙腈或甲醇中的一种或两种的组合；
所述水相选自三氟乙酸水溶液或醋酸铵缓冲溶液；
所述有机相与水相的体积比为30:70～22:78；
所述三氟乙酸水溶液摩尔浓度为5％～8％；
所述醋酸铵缓冲溶液摩尔浓度为6％～7％。
2.根据权利要求1所述的心脑血管药物替罗非班S构型的分离检测方法，其特征在于，所述心脑血管药物替罗非班S构型的分离检测方法中检测波长为200～245nm。
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