CN106596753A - 一种铜绿微囊藻毒素粗提液的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种铜绿微囊藻毒素粗提液的制备方法，先离心富集藻细胞，然后再进行超声破胞。取处于对数生长期的M.aeruginosa藻液，分装于多个离心管中，使用冷冻离心机在4℃，3000‑8000rpm下离心分离；倒出上清液，使藻细胞聚集物留于离心管底部及壁上；继续向离心管中倒入相同体积的藻液，使用冷冻离心机离心并重复上述操作；然后使用超声细胞破碎仪在300‑800W的条件下超声破碎，得到藻毒素粗提液。本方法将传统藻毒素提取方法中的“先破胞、再离心”两步骤进行了对调。与传统提取方法相比，提取单一样品工作时间由1小时下降到30分钟，效率提升非常明显。

Description

一种铜绿微囊藻毒素粗提液的制备方法
技术领域
本发明公开了一种铜绿微囊藻毒素(Microcystin)粗提液的制备方法。
背景技术
微囊藻毒素(Microcystin，MC)是一类具有生物活性的环状七肽化合物，为分布最广泛的肝毒素。主要由淡水藻类铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)产生。水体中的微囊藻毒素多达70余种，其中在水体中，存在较普遍而且毒性较大的微囊藻毒素有三种，它们分别是MC‐LR、MC‐RR、MC‐YR，其中L、R、Y分别代表亮氨酸、精氨酸、酪氨酸三种氨基酸。
近年来，由于自然水体水华频发，严重影响到人民群众的正常生产生活，伴随着水华而产生的微囊藻毒素的生态威胁也引起了研究人员的广泛关注。在这种情况下，选择哪种含有藻毒素成分作为实验材料，如何尽可能真实地模拟实际水体中藻毒素对其他生物以及生态的影响，直接决定了实验结果的客观准确性和学术价值。目前，大多数研究人员选择购买高纯度的藻毒素标准品来模拟自然条件的水环境状态。
市面上所售藻毒素标准品虽然能够满足藻毒素研究人员对纯度的要求，但普遍价格昂贵。另外，藻毒素并不是铜绿微囊藻细胞破胞后释放到水体中的唯一物质，藻毒素的存在往往伴随着其他多种胞内容物。因此如果想要模拟自然条件下藻毒素对其他生物和生态的影响，或者考虑藻毒素和其他胞内容物的协同作用，仅使用微囊藻毒素标准品并不能满足研究要求。
藻毒素粗提液作为高浓度微囊藻细胞破胞后的产物，相比于藻毒素标准品有很大区别。首先，藻毒素粗提液中不仅含有较高浓度的藻毒素成分，同时还包含了藻细胞破胞后释放到水体的其他内容物。其次，藻毒素标准品中可能含有甲醇等有机溶剂，在应用到实验中时，将会对实验结果造成干扰。因此，藻毒素粗提液相比藻毒素标准品能够更好地还原实际的水环境状态，实验结果也能够更真实地突出反映在其他胞内容物存在的情况下，铜绿微囊藻毒素对水生生物的影响。
本发明旨在获取一条便捷、快速有效的铜绿微囊藻毒素粗提液制备方法，即在富集了藻毒素的同时，保留伴随藻细胞破胞而产生的所有物质，在最大程度上还原自然状态下藻毒素与其他物质的存在状态。
发明内容
传统藻毒素提取技术路线主要是超声破胞‐离心‐固相萃取法。这种方法虽然能较好地去除其他杂质，但步骤繁琐、操作比较复杂，单一样品的处理时间较长，效率比较低，且最终得到的产物以甲醇等物质为溶剂，对后续实验可能造成干扰。而市售藻毒素标准品虽然纯度很高，但价格也相当昂贵，造成实验成本极高。另外，无论是传统技术提取的藻毒素，还是市售藻毒素标准品，都不能模拟自然状态下藻毒素与其他胞内容物的协同作用，因此给想要研究自然条件下藻毒素对其他生物和生态影响的科研人员增加了难度。本发明简化了传统方法的步骤，并对其进行有针对性的改良，杜绝了有机溶剂的引入。另外，本方法在富集了藻毒素的同时，将藻细胞破胞后的其他物质最大程度地保留下来，基本可以满足实验的要求。
本发明的技术方案如下：
一种铜绿微囊藻毒素粗提液的制备方法，先离心富集藻细胞，然后再进行超声破胞。取处于对数生长期的M.aeruginosa藻液，分装于多个离心管中，使用冷冻离心机在4℃，3000‐8000rpm下离心分离；倒出上清液，使藻细胞聚集物留于离心管底部及壁上；继续向离心管中倒入相同体积的藻液，使用冷冻离心机离心并重复上述操作；然后使用超声细胞破碎仪在300‐800W的条件下超声破碎，得到藻毒素粗提液。
所述冷冻离心机转速在3000‐8000rpm，时间在10‐30min。
所述超声细胞破碎装置功率在300‐900W，时间10‐30min。
优选3000‐8000rpm下离心分离15‐30min。
优选300‐800W的条件下超声破碎15‐30min。
本方法将传统藻毒素提取方法中的“先破胞、再离心”两步骤进行了对调。利用适宜条件下培养到对数期的铜绿微囊藻液，通过离心的方法，在保证细胞形态和胞内藻毒素和其他内容物不释放的前提下，使藻细胞沉淀富集。通过去除上清液，添加新藻液进行多次离心的方式，藻液中的藻细胞不断富集，极大地减少了后续超声破胞的工作量。然后将获得的藻细胞富集液在一定功率下进行超声破胞，使胞内藻毒素和其他内容物尽可能地释放出来，最终得到藻毒素粗提液。另外，获得藻毒素粗提液以后，可以通过固相萃取‐高效液相色谱法(HPLC)确定藻毒素粗提液中所含MC‐LR的成分浓度。在具体超声破胞的过程中，可根据实际待破胞藻液的量来调整超声细胞破碎装置的作业条件。在效率方面，与传统提取方法相比，提取单一样品工作时间由1小时下降到30分钟，效率提升非常明显。
具体实施方式
所需材料和仪器：MC‐LR标准品(Express公司购买，纯度≥95％)、Microcystisaeruginosa藻种(中科院水生所购买)、色谱甲醇(安普公司购买)、三氟乙酸(TFA)(国产)、恒温光照培养箱、BG11培养基、电子显微镜、血球计数板、冷冻离心机、大功率超声细胞破碎仪、固相萃取装置、CNWBOND LC‐C18反相固相萃取小柱(500mg，6mL)(安普公司购买)、HPLC(Waters‐e2695)、UV‐Vis检测器、氮吹仪、旋转蒸发仪等。铜绿微囊藻毒素(Microcystin)粗提液的制备方法
(1)藻液的准备
将M.aeruginosa藻种用BG11培养基扩大培养，接种取处于对数期铜绿微囊藻以1:5‐1:10的比例接种于BG11培养基，于恒温光照培养箱适宜条件下培养，保证每天充足的光照时间。另外及时进行人工摇晃，防止藻群落聚集生长甚至沉淀。接种后培养15‐30天后，取少量藻液在显微镜下观察，用血球计数板计数的方法测定藻细胞生物量。当藻细胞浓度超过107的数量级并处于对数期时，藻液的培养达到要求，可以进行下一步的操作。
(2)藻细胞的富集
取一定体积(200mL‐500mL)的处于对数生长期的M.aeruginosa藻液，均等分装于6个50mL的带盖离心管中，使用冷冻离心机在4℃，3000‐8000rpm下离心15‐30min，倒出上清液，使藻细胞聚集物留于离心管底部及壁上；继续向离心管中倒入相同体积的藻液，使用冷冻离心机离心并重复上述操作；
每次倒出上清液时，注意离心管底部是否已被藻细胞的聚集物完全覆盖，或观察聚集物是否已经不能与上清液明显分离；满足上述情况之一者，不再进行下一步离心操作，向离心管中倒入少量蒸馏水，将粘在管底及壁上的藻细胞聚集物洗脱后全部收集，作为藻细胞富集液，留待下一步操作。
(3)藻细胞的破碎
将收集到的M.aeruginosa藻细胞富集液放入超声细胞破碎仪，破碎杆伸入液面以下，使用超声细胞破碎仪在300‐800W的条件下超声破碎15‐30min，得到藻毒素粗提液。
实施例1
本发明的技术路线，处理恒温光照培养箱(温度：28℃，光强：40μE·m‐2·s‐1)培养25天的共计6L的铜绿微囊藻液，使用低温高速离心机在4℃，8000rpm条件下离心，去除上清液后补充藻液继续离心，收集到550ml藻细胞富集液。然后在800W功率下破胞15min，最终实际得到藻毒素粗提液500mL。
实施例2
本发明的技术路线，处理恒温光照培养箱(温度：28℃，光强：40μE·m‐2·s‐1)培养28天的共计3L的铜绿微囊藻液，使用低温高速离心机在4℃，3000rpm条件下离心，去除上清液后补充藻液继续离心，收集到400ml藻细胞富集液。然后在600W功率下破胞30min，最终实际得到藻毒素粗提液360mL。
实施例3
本发明的技术路线，处理恒温光照培养箱(温度：28℃，光强：40μE·m‐2·s‐1)培养30天的共计6L的铜绿微囊藻液，使用低温高速离心机在4℃，6000rpm条件下离心，去除上清液后补充藻液继续离心，收集到560ml藻细胞富集液。然后在300W功率下破胞20min，最终实际得到藻毒素粗提液500mL。
按照如下步骤萃取藻毒素，进而检测所制得的粗提液中所含有的藻毒素浓度：
(1)固相萃取(SPE)
取10‐20ml已制得的藻毒素粗提液，加蒸馏水稀释至200ml，作为进行下一步固相萃取操作的样品。
SPE操作条件：用CNWBOND LC‐C18反相固相萃取小柱(500mg，6mL)。在进样前，先用10mL无水甲醇对固相萃取小柱进行活化，再用15mL去离子水对小柱进行清洗。然后将实际样品以小于10mL·min‐1的流速经过固相萃取柱，之后使用20％甲醇水溶液对柱上杂质进行洗脱。之后将固相萃取柱在真空中放置2‐3min以除去柱中水分。分别用10mL无水甲醇(0.1％v/v TFA)洗脱吸附在固相萃取柱上的目标藻毒素，进而分别用旋转蒸发仪和氮吹仪将甲醇蒸干，按照一定浓缩比例加入一定量的60％甲醇水溶液(0.05％v/v TFA)溶解得到的目标藻毒素，并通过最终提取结果确定最优浓缩条件，之后‐20℃保存，准备进行HPLC测定。
(2)HPLC的操作条件
HPLC色谱柱：Symmetry C18Column,5μm,250×4.6mm色谱柱。
流动相：选用60％甲醇(0.05％v/v TFA)作为流动相。
流动相速度：1mL/min；
柱温：40℃；
UV检测器波长：238nm；
进样量：10μL。
(3)MC‐LR HPLC测定标准曲线的确定
将MC‐LR标准品配制成浓度为0.1、0.5、1、2、5、10、20、50mg·L‐1的MC‐LR标准溶液，在已确定的HPLC操作条件下，测定MC‐LR所出色谱峰的峰高，绘制标准曲线。MC‐LR标准溶液的进样量为10μL。
根据藻毒素粗提液样品出峰的实际情况，结合已得的标准曲线和稀释倍数，计算出藻毒素粗提液中藻毒素的真实浓度位于300‐400μg/L的区间，完全可以满足模拟实际水体中藻毒素存在水平的要求。
将制备的已知浓度的藻毒素粗提液经过加水稀释后应用于水培实验，模拟水生植物在藻毒素存在条件下的生长状况，实际结果表明藻毒素粗提液完全可以满足实验对浓度的要求。另外，与藻毒素标准品相比，排除了有机溶剂存在对实验结果的干扰，且整个制备过程简便经济。

Claims (6)

1.一种铜绿微囊藻毒素粗提液的制备方法，其特征是先离心富集藻细胞，然后再进行超声破胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是取处于对数生长期的M.aeruginosa藻液，分装于多个离心管中，使用冷冻离心机在4℃，3000-8000rpm下离心分离；倒出上清液，使藻细胞聚集物留于离心管底部及壁上；继续向离心管中倒入相同体积的藻液，使用冷冻离心机离心并重复上述操作；然后使用超声细胞破碎仪在300-800W的条件下超声破碎，得到藻毒素粗提液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是冷冻离心机转速在3000-8000rpm，时间在10-30min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是超声细胞破碎装置功率在300-900W，时间10-30min。
5.如权利要求1所述的方法，其特征是3000-8000rpm下离心分离15-30min。
6.如权利要求1所述的方法，其特征是300-800W的条件下超声破碎15-30min。
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王爱杰等: "HPLC测定铜绿微囊藻毒素的富集提取方法改进研究", 《持久性有机污染物论坛2008暨第三届持久性有机污染物全国学术研讨会论文集》 *
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