CN106588857B - 克拉霉素衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种克拉霉素衍生物及其制备方法与应用,旨在提供既能最大程度保留了克拉霉素的特征结构,又具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团的克拉霉素衍生物,并且以该克拉霉素衍生物制备人工抗原和抗体,用来检测检测大环内酯类化合物中,其技术方案,所述克拉霉素衍生物,所述结构如下式所示:所述克拉霉素人工抗原为所述克拉霉素衍生物与载体蛋白偶联制得的;属于生物技术领域;
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种克拉霉素衍生物,以及克拉霉素衍生物作为半抗原在制备克拉霉素包被原、免疫原中的应用。
背景技术
克拉霉素属于大环内酯类抗生素,对大多数革兰阳性菌、部分革兰阴性菌及一些非典型致病菌(支原体、衣原体等)均有效。是红霉素的第二代衍生物之一。红霉素的第二代衍生物主要成员有罗红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素等。由于其第二代衍生物避免了被胃酸破坏,提高了吸收率,抗菌活性更强,因而广泛用于治疗呼吸道感染的一线药物。
但近来有报道,红霉素第二代衍生物长期、持续的给药,对肝脏有毒害;对前庭系统有影响,能引起耳鸣、听觉障碍等;还能引起药热、药疹、荨麻疹等过敏反应以及部分药物可引起腹痛、腹泻、恶心等胃肠道反应;其中,克拉霉素、阿奇霉素等可能发生幻觉、失眠、意识模糊等中枢神经系统副作用,以及易透过胎盘屏障。因此,国际上有关大环内酯类抗生素的最高残留限量有着非常严格的规定,我国也出台了相应的法规来规范大环内酯类抗生素的使用。我国出台的蜂蜜产品中大环内酯类药物残留定量限为1.0μg/kg以下。为了打击非法用药,保护消费者的健康与安全,迫切需要健全相关的检测方法。
目前,兽药残留检测常用的方法有气相色谱、高效液相色谱以及气质联用等理化分析方法。虽然这些方法特异性强、灵敏度高,但是样品前处理操作步骤繁琐,成本较高,也不适用于大批量样品的筛选检测。免疫化学分析鉴于在抗原抗体的定性定量方面独特的优势和操作简便快捷、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优点弥补了理化分析的不足。因此,建立免疫化学分析法检测克拉霉素的残留具有重要的经济意义和社会意义。
发明内容
针对上述问题,本发明的第一个目的是提供一种既能最大程度保留了克拉霉素的特征结构,又具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团的克拉霉素衍生物及其制备方法。
本发明的第二个目的是提供含克拉霉素衍生物的的在制备克拉霉素免疫和克拉霉素包被原中的应用。
本发明的第三个目的是提供上述克拉霉素免疫和克拉霉素包被原的制备方法。
为此,本发明的第一个技术方案是这样的:
一种克拉霉素衍生物,所述结构如式I所示:
上述克拉霉素衍生物的方法,依次包括如下步骤:
3)将克拉霉加入反应瓶中,每1mmol加入10ml稀盐酸,在室温下磁力搅拌1.5-2.5小时,补加水,并调调节溶液pH为8.0-9.0,析出白色固体,加固体氯化钠使溶液饱和,缓慢搅拌25-35分钟,抽滤,取滤饼溶于乙酸乙酯中,用饱和氯化钠水溶液洗涤,取乙酸乙酯层,用无水硫酸钠干燥2小时,过滤,减压旋蒸乙酸乙酯,得到白色固体,为中间体;
4)取步骤1)制备的中间体加入反应瓶中,再加溶剂和γ-氨基丁酸,在60℃,磁力搅拌10-14小时,冷却后减压旋蒸溶剂,再加入水使之析出淡黄色固体,过滤,滤饼用混合溶剂淋洗,鼓风烘干,得到克拉霉素衍生物;
其中:所述的中间体和所述γ-氨基丁酸摩尔比1:1.2~1.8。
进一步的,上述的克拉霉素衍生物的制备方法,所述的混合溶剂为体积比1:1的异丙醇和水。
本发明提供的第二个技术方案是上述的克拉霉素衍生物在制备克拉霉素包被原中的应用。
一种克拉霉素包被原,所述的克拉霉素包被原由克拉霉素衍生物与牛血清
白蛋白偶联制得的,结构式如式(Ⅱ)所示:
本发明提供的第三个技术方案是上述的克拉霉素衍生物在制备的克拉霉素免疫原中的应用。
一种克拉霉素免疫原,所述的克拉霉素免疫原由克拉霉素衍生物与鲎血蓝蛋白偶联制得的,结构式所述结构如式Ⅲ所示:
本发明提供的第四个技术方案是这样的:
1)动物免疫
用上述的克拉霉素免疫原免疫新西兰大白兔;
2)兔血清的收集与保存
取冲击免疫后第七天的耳缘静脉采血检测血清效价及抑制,免疫八次后,心脏采全血,离心收集血清即为多克隆抗体。
本发明提供的最后一个技术方案是上述克拉霉素多克隆抗体在检测克拉霉素中的应用或者在检测大环内酯类化合物中的应用。
与现有技术相比,本发明提供的技术方案具有如下优点:
1、本发明提供的克拉霉衍生物既能最大程度保留了克拉霉素的特征结构,又具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团;
2、本发明提供的克拉霉衍生物所制备人工抗原和抗体定性定量准备,操作简便快捷、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优点。
3、本发明提供的克拉霉素人工抗原可以检测克拉霉素药物残留,也可以检测红霉素药物残留,用途广泛。
附图说明
图1是克拉霉素包被原紫外光谱扫描结果;
图2是克拉霉素免疫原紫外光谱扫描结果;
图3是多克隆抗体在不同浓度标准品溶液的吸光值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的实验材料,如无特殊说明,均为常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验,均设置三次重复实验,结果取平均值。克拉霉素购自湖北威得利化学科技有限公司。实施例中所用的PBS缓冲液均为pH为7.4、0.01M的PBS缓冲液。鲎血蓝蛋白,简称LPH。牛血清白蛋白,简称BSA。
实施例1
1)将克拉霉素750.6mg(1mmol)加入50ml反应瓶中,加入10ml稀盐酸,室温,磁力搅拌2小时,补加20ml水,用浓氨水调pH为8.0-9.0,析出白色固体,加固体氯化钠使溶液饱和,缓慢搅拌30分钟,抽滤,取滤饼溶于50ml乙酸乙酯中,用饱和氯化钠水溶液洗涤3次,取乙酸乙酯层,用无水硫酸钠干燥2小时,过滤,减压旋蒸乙酸乙酯,得到白色固体,为克拉霉素衍生物中间体432.7mg。
2)将步骤1)制备的中间体300.6mg(0.51mmol)加入10ml反应瓶中,加入5ml甲醇,加入γ-氨基丁酸78.8mg(1.5N),60℃,磁力搅拌12小时,冷却,减压旋蒸溶剂,加入10ml水,析出淡黄色固体。过滤,滤饼用10ml混合溶剂(V异丙醇:V水=1:1)淋洗,鼓风烘干,得到克拉霉素衍生物(式I),216.8mg。
实施例2、制备克拉霉素人工抗原
一、克拉霉素包被原的合成
(1)将27.7mg实施例1制备的式(I)所示化合物溶于2mlN,N-二甲基甲酰胺中,加入10mg N-羟基琥珀酰亚胺和10mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐,室温下磁力搅拌2h,得到溶液a。
(2)将66mg牛血清白蛋白加入8ml去离子水中,室温下磁力搅拌,充分溶解,即为溶液b。
(3)将溶液a滴加至溶液b中,室温缓慢搅拌8h,后入透析袋,在PBS中,4℃透析72h(中间换水5次),然后于4℃条件下,4000rmp离心10min,取上清,即克拉霉素包被原溶液,分装于安培瓶中,-20℃保存,克拉霉素包被原简称CL-BSA(结构式如式(Ⅱ)所示,克拉霉素包被原溶液简称CL-BSA溶液。
(4)将CL-BSA溶液用PBS缓冲溶液稀释后,测定280nm和260nm的分光光度值,按公式计算稀释溶液中的蛋白浓度,将测得的蛋白浓度值乘以其稀释倍数后即为原CL-BSA溶液中的CL-BSA浓度。蛋白质浓度(mg/ml)=1.45*OD280-0.74*OD260。CL-BSA溶液中的CL-BSA浓度为8.6mg/ml。
二、克拉霉素包被原的表征
将CL-BSA溶液用PBS缓冲溶液稀释(使CL-BSA的浓度为5mg/ml),作为溶液甲;将含5mg/ml克拉霉素的PBS缓冲溶液作为乙;将含5mg/ml BSA的PBS缓冲溶液作为丙。分别将溶液甲、乙、丙,进行紫外(200-400nm)光谱扫描。紫外光谱扫描结果见图1。与溶液丙相比,溶液甲的紫外图谱发生了变化,说明化合物与BSA成功偶联。
溶液乙的最大吸收波长值为224nm,溶液丙的最大吸收波长值为278nm。根据公式K=A/CL(A为最大吸收波长值下的吸光度,C为溶液浓度,L为液层的厚度)计算各个化合物的消光系数(K)。
分别采用溶液乙和溶液丙的最大吸收波长值对溶液甲进行紫外光谱扫描,并根据已经计算出的该化合物的消光系数反向计算该化合物在溶液甲中的浓度,用浓度值除以分子量得到该化合物的摩尔浓度,计算偶联比,式(I)所示化合物和BSA的偶联比为8:1,即8个式(I)所示化合物结合1个BSA。
三、克拉霉素免疫原的合成
(1)将27.7mg实施例1制备得到的式(I)所示化合物溶于2ml N,N-二甲基甲酰胺中,加入10mg N-羟基琥珀酰亚胺和10mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐,室温下磁力搅拌2h,得到溶液c。
(2)将93.7mg鲎血蓝蛋白加入8ml去离子水中,室温下磁力搅拌,充分溶解,即为溶液d。
(3)将溶液c滴加至溶液d中,室温缓慢搅拌8h,后入透析袋,在PBS中,4℃透析72h(中间换水5次),然后于4℃条件下,4000rmp离心10min,取上清,即克拉霉素免疫原溶液,分装于安培瓶中,-20℃保存,克拉霉素免疫原简称CL-LPH(如式三所示),克拉霉素免疫原的溶液简称CL-LPH溶液。
(4)将CL-LPH溶液用PBS缓冲溶液稀释后,测定280nm和260nm的分光光度值,按公式计算稀释溶液中的蛋白浓度,将测得的蛋白浓度值乘以其稀释倍数后即为原CL-LPH溶液中的CL-LPH浓度。蛋白质浓度(mg/ml)=1.45*OD280-0.74*OD260。CL-LPH溶液中的CL-LPH浓度为9.3mg/ml。
二、克拉霉素免疫原的表征
将CL-LPH溶液用LPH缓冲溶液稀释(使CL-LPH的浓度为5mg/ml),作为溶液甲;将含5mg/ml克拉霉素的LPH缓冲溶液作为乙;将含5mg/ml BSA的PBS缓冲溶液作为丙。分别将溶液甲、乙、丙,进行紫外(200-400nm)光谱扫描。紫外光谱扫描结果见图2。与溶液丙相比,溶液甲的紫外图谱发生了变化,说明化合物与BSA成功偶联。
溶液乙的最大吸收波长值为224nm,溶液丙的最大吸收波长值为278nm。根据公式K=A/CL(A为最大吸收波长值下的吸光度,C为溶液浓度,L为液层的厚度)计算各个化合物的消光系数(K)。
分别采用溶液乙和溶液丙的最大吸收波长值对溶液甲进行紫外光谱扫描,并根据已经计算出的该化合物的消光系数反向计算该化合物在溶液甲中的浓度,用浓度值除以分子量得到该化合物的摩尔浓度,计算偶联比,式(I)所示化合物和LPH的偶联比为12:1,即12个式(I)所示化合物结合1个LPH。
实施例5、克拉霉素多克隆抗体的制备
一、动物免疫
新西兰大白兔:购于广东省实验动物中心。
将新西兰大白兔按实施例2制备的CL-LPH溶液进行免疫,免疫方式为脊柱两侧背部皮下多点免疫,免疫间隔为两周,每次免疫剂量为1mg/只,从第二次免疫开始,每次免疫后第七天,耳缘静脉采血检测血清效价及抑制,共免疫八次,八免后心脏采全血,离心收集血清即为多克隆抗体。将收集到的血清放于-20℃保存。
二、多克隆抗体的鉴定
将步骤一得到的多克隆抗体分别进行如下鉴定:
1、抗体效价的测定
(1)包被:采用实施例2制备的CL-BSA,采用pH9.6的碳酸盐缓冲液进行包被,100μL/孔,包被浓度为5μg/mL;4℃过夜包被。
(2)洗板并封闭:PBST洗板一次,拍干后200μL/孔封闭液37℃封闭两小时。
(3)弃去封闭液,拍干;
(4)每孔加入50μL抗体稀释液(采用PBS进行梯度稀释),及50μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗,室温孵育30min。
(5)PBST洗板三次;
(6)加入TMB显色液,避光显色15min。
(7)每孔加入50μL2moL/L硫酸终止反应;OD450及OD630双波长读数。
以OD值达到1.0左右时判定为阳性。克拉霉素多克隆抗体效价为1:5000。
3、多克隆抗体灵敏度的测定
(1)包被:采用实施例2制备的CL-BSA,采用pH 9.6的碳酸盐缓冲液进行包被,100μL/孔,包被浓度为5μg/mL;4℃过夜包被。
(2)洗板并封闭:PBST洗板一次,拍干后200μL/孔封闭液37℃封闭两小时。
(3)弃去封闭液,拍干;
(4)每孔加入50μL不同浓度的克拉霉素标准品溶液(由克拉霉素和PBS缓冲液组成),克拉霉素的浓度分别为0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L;将只加入PBS缓冲液的孔作为对照空;每个浓度设置3个重复孔。
(5)每孔加入50μL步骤一得到的多血清;
(6)每孔加入50μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗,室温孵育30min。
(7)PBST洗板三次;
(8)加入TMB显色液,避光显色15min。
(9)每孔加入50μL2moL/L硫酸终止反应;OD450及OD630双波长读数。
将采用不同浓度标准品溶液得到的吸光值(三个重复孔的平均值)除以对照孔的吸光值(平均值)再乘以100作为纵坐标,以各个标准品溶液中的克拉霉素浓度(μg/L)的自然对数值为横坐标绘制曲线图,见图3。
对照图,得到纵坐标值等于50%对应的克拉霉素浓度(μg/L),即为IC50值。IC50为0.9ppb。
4、交叉反应率的测定
(1)包被:采用实施例2制备的CL-BSA,采用pH 9.6的碳酸盐缓冲液进行包被,100μL/孔,包被浓度为5μg/mL;4℃过夜包被。
(2)洗板并封闭:PBST洗板一次,拍干后200μL/孔封闭液37℃封闭两小时。
(3)弃去封闭液,拍干;
(4)每孔加入50μL不同浓度的结构类似物标准品溶液(由结构类似物和PBS缓冲液组成),结构类似物的浓度分别为0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L;将只加入PBS缓冲液的孔作为对照空;每个浓度设置3个重复孔。
结构类似物为:红霉素、替米考星、阿奇霉素、泰乐菌素。
红霉素:中检所产品,货号130307。阿奇霉素:中检所产品,货号130593。替米考星:Sigma产品,货号33864-100。泰乐菌素:Sigma产品,货号32298-25。
(5)每孔加入50μL步骤一得到的多克隆抗体,
(6)每孔加入50μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗,室温孵育30min。
(7)PBST洗板三次;
(8)加入TMB显色液,避光显色15min。
(9)每孔加入50μL2moL/L硫酸终止反应;OD450及OD630双波长读数。
将采用各个浓度的结构类似物得到的吸光值(三个复孔的平均值)除以对照孔的吸光值(平均值)再乘以100作为纵坐标,以各个标准品溶液中的结构类似物浓度(μg/L)的自然对数值为横坐标绘制曲线图。对照曲线图,得到纵坐标值等于50%对应的结构类似物浓度(μg/L),即为IC50值
用以下公式计算多克隆抗体对其它结构类似物的交叉反应率。
结果见表1。
表1 多克隆抗体特异性
结果表明本发明制备的CL多克隆抗体特异性较好,与大环内酯类的红霉素及阿奇霉素有一定的交叉反应,与其它结构类似物无交叉反应。
5、稳定性
将步骤三得到的多克隆抗体溶液-20℃放置,不同时间取样,用PBS缓冲液稀释后检测效价,具体步骤同步骤2抗体效价的测定。
OD450及OD630值见表2。结果表明,在-20℃保存16周多克隆抗体效价不变。
表2 多克隆抗体的稳定性
6、非竞争酶免疫法测定亲和常数
(1)用CL-BSA作为包被原包被酶标板
采用实施例1制备的CL-BSA溶液用碳酸盐缓冲液进行包被,100μL/孔;分别设置以下包被浓度:10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL。4℃过夜包被。
(2)洗板并封闭
(3)每孔加入100μL多克隆抗体溶液的稀释液(用PBS缓冲液进行稀释);稀释液中的蛋白浓度分别为2.5、1.25、0.625、0.3125、1.5625×10-1、7.8×10-2、3.9×10-2、1.95×10-2、9.75×10-3、4.88×10-3mg/L;室温孵育1h。
(4)洗板,拍干。
(5)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG,室温孵育1h。
(6)洗板拍干。
(7)加入TMB显色液,避光显色15min。
(8)每孔加入100μL2mol/L硫酸终止反应;读OD450及OD630双波长值。
以多克隆抗体中的蛋白浓度(mol/L)的自然对数值为横坐标,以其对应的吸光值为纵坐标制作标准曲线。每个抗原包被浓度得到1条S型曲线,共得到4条S型曲线。找出S型曲线的顶部,对应的OD450及OD630双波长值设为ODMAX。分别找出各条曲线50%ODMAX对应的抗体浓度。将4个浓度两两一组,根据公式计算多克隆抗体的亲和常数
Ka=(n-1)/2(n[Ab]t1-[Ab]t2)
公式中,n为每组中两个包被浓度的倍数,[Ab]t1、[Ab]t2分别为每组中两个50%ODMAX对应的抗体浓度(mol/L)。最终取6个Ka值的平均值得出多克隆抗体的亲和常数为3.56×109M-1。。
以上所述的仅为本发明的较佳实施例,凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种克拉霉素衍生物,其特征在于,所述结构如式I所示:
2.制备权利要求1所述克拉霉素衍生物的方法,其特征在于,依次包括下述步骤:
1)将克拉霉加入反应瓶中,并且每1mmol加入10ml稀盐酸,在室温下磁力搅拌1.5-2.5小时,加水稀释,并调节溶液pH为8.0-9.0,析出白色固体,加固体氯化钠使溶液饱和,缓慢搅拌25-35分钟,抽滤,取滤饼溶于乙酸乙酯中,用饱和氯化钠水溶液洗涤,取乙酸乙酯层,用无水硫酸钠干燥2小时,过滤,减压旋蒸乙酸乙酯,得到白色固体,为中间体;
2)取步骤1)制备的中间体加入反应瓶中,再加溶剂和γ-氨基丁酸,在60℃,磁力搅拌10-14小时,冷却后减压旋蒸溶剂,再加入水使之析出淡黄色固体,过滤,滤饼用混合溶剂淋洗,鼓风烘干,得到克拉霉素衍生物;
其中:所述的中间体和所述γ-氨基丁酸摩尔比1:1.2~1.8。
3.根据权利要求2所述的克拉霉素衍生物的制备方法,其特征在于,所述的混合溶剂为体积比1:1的异丙醇和水。
4.一种克拉霉素包被原,其特征在于,所述的克拉霉素包被原由权利要求1所述的克拉霉素衍生物与牛血清白蛋白偶联制得的,结构式如式Ⅱ所示:
5.一种克拉霉素免疫原,其特征在于,所述的克拉霉素免疫原是由权利要求1所述的克拉霉素衍生物与鲎血蓝蛋白偶联制得的,结构如式Ⅲ所示:
6.一种克拉霉素多克隆抗体,其特征在于,依次通过下述步骤制得:
1)动物免疫
用权利要求5所述的克拉霉素免疫原免疫新西兰大白兔;
2)兔血清的收集与保存
取冲击免疫后第七天的耳缘静脉采血检测血清效价及抑制,免疫八次后,心脏采全血,离心收集血清即为多克隆抗体。
7.权利要求6所述的克拉霉素多克隆抗体在检测克拉霉素中的应用。
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Publication number | Publication date |
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CN106588857A (zh) | 2017-04-26 |
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Denomination of invention: Clarithromycin derivatives and their preparation methods and applications Granted publication date: 20191112 Pledgee: Shenzhen Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Dapeng Branch Pledgor: SHENZHEN LVSHIYUAN BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2024980003501 |