JP2023510482A

JP2023510482A - ヘリコバクター・ピロリに対するワクチンの製造における、ヘプトース鎖含有オリゴ糖化合物の使用

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Publication number: JP2023510482A
Application number: JP2022533083A
Authority: JP
Inventors: 胡静; 尹健
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-04-13
Filing date: 2020-06-23
Publication date: 2023-03-14
Anticipated expiration: 2040-06-23
Also published as: CN111467368A; WO2021208237A1; CN111467368B; US20210369834A1; JP7405983B2

Abstract

本発明は、ヘリコバクター・ピロリに対するワクチンの製造における、ヘプトース鎖含有オリゴ糖化合物の使用に関し、医薬分野に属する。化学合成されたそれぞれの抗原糖鎖フラグメントをチップの表面に固定して合成オリゴ糖チップを製造する。動物免疫実験と合成オリゴ糖チップの解析とを組み合わせ、抗血清の中で多糖に対して生じた抗体を用いて検出を行い、合成オリゴ糖と免疫原性との関係を研究した結果、抗原におけるヘプトース鎖が重要な免疫エピトープであると分かった。α－（１→３）－ヘプトース鎖を含む糖鎖抗原フラグメントは、優れた免疫活性を有し、ヘリコバクター・ピロリ感染の予防や治療のためのワクチンの製造や開発に適用可能である。
【選択図】図６

Description

本発明は、ヘリコバクター・ピロリに対するワクチンの製造における、ヘプトース鎖含有オリゴ糖化合物の使用に関し、医薬分野に属する。

微好気性グラム陰性病原菌であるヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）は、最も広範囲に見られる細菌性病原体の一つとして、世界中の人々へ感染率が約５０％とされている（Ｊ．Ｇ．Ｋｕｓｔｅｒｓｅｔａｌ．，ＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌＲｅｖ，２００６，１９：４４９）。研究により明らかになったように、ヘリコバクター・ピロリは、胃炎、胃の萎縮、消化性潰瘍、十二指腸潰瘍などの病気を起こす要因とされている（Ｂ．Ｍｏｌｎａｒｅｔａｌ．，ＤｉｇＤｉｓ，２０１０，２８：６０４）。また、ヘリコバクター・ピロリ感染は、胃がんのリスクの上昇に直接関連するとされている（Ｌ．Ｅ．Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉｅｔａｌ，ＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌＲｅｖ，２０１０，２３：７１３；Ｃ．Ｐｒｉｎｚｅｔａｌ，ＷｏｒｌｄＪＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２００６，１２：５４５８）。そのため、ヘリコバクター・ピロリは１９９４年に世界保健機関（ＷＨＯ）により、Ｉ型のヒト発がん性因子として明確に分類された（Ｌｙｏｎ：ＩＡＲＣ，１９９４，６１：１７７）。また、研究により明らかになったように、ヘリコバクター・ピロリ感染により胃がんのリスクは２～８倍上昇するとされている（ＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒａｎｄＣａｎｃｅｒＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＧｒｏｕｐ，Ｇｕｔ，２００１，４９：３４７；Ｆ．Ｋａｍａｎｇａｒｅｔａｌ．，ＪＮａｔｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ，２００６，９８：１４４５）。

現在、ヘリコバクター・ピロリ感染に対する治療は、主に、ビスマス製剤やプロトンポンプ阻害剤と、抗生物質との併用による３剤併用療法や４剤併用療法である。しかし、抗生物質（主にクラリスロマイシン）に基づく治療では、多くの欠点が存在する。例えば、抗生物質の長期的使用により、細菌の薬剤耐性が発生する虞があり（Ｇ．Ａｙａｌａｅｔａｌ，ＷｏｒｌｄＪｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２０１４，２０：１４５０；Ｎ．Ｖａｋｉｌ，ＣａｎｃｅｒＪＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２００３，１７：３０Ｂ）、また、抗生物質に基づく治療は、ヘリコバクター・ピロリの反復感染のリスクを防ぐことができない。そのため、ヘリコバクター・ピロリを治療するための新しい治療法の開発は急務となっている。そして、ヘリコバクター・ピロリに対するワクチンは、この世界規模の感染症を制御する最も効果的な方法と考えられている（Ｍ．Ｓｅｌｇｒａｄｅｔａｌ．，ＣｕｒｒＯｐｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌ，２００８，８：５９３）。ヘリコバクター・ピロリ感染に対するワクチンの開発については、研究者による多くの努力がなされてきた。例えば、２００９年に、ウレアーゼＢサブユニットと不耐熱のエンテロトキシンＢサブユニットとからなる融合タンパク質ワクチンが中国で承認された（Ｍ．Ｚｅｎｇｅｔａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，２０１５，３８６：１４５７）。しかしながら、市販に至る、ヘリコバクター・ピロリ感染に対するワクチンは、未だに無い。ところで、ヘリコバクター・ピロリ細胞の表面の主成分であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）Ｏ－抗原は、有力なワクチン候補として注目されている（Ｓ．Ｙｕｅｔａｌ．，ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ，２００７，７５：２９７４；Ｄ．Ｒｅｎｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１１，２９：４２１０）。研究により明らかになったように、ヘリコバクター・ピロリ感染に対抗する糖類ワクチンの開発は、非常に合理的である。また、糖類を基質とするコンジュゲートワクチンは、全身性感染の予防や、宿主でのコロニー形成の抑制に既に成功している（Ｊ．Ｈ．Ｐａｓｓｗｅｌｌｅｔａｌ．，ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ，２００１，６９：１３５１）。しかし、抽出によって得られるリポポリサッカライドは、構造が統一されにくく、構造的に類似した不純物が混在しやすいという問題があるため、実験での再現性が低く、ワクチンを用いる次の段階の治療への利用には限界があった。そのため、構造が統一され、確実に化学的に合成でき、且つ、ヘリコバクター・ピロリに対する優れた抑制効果を発揮できるワクチンの開発は、急務となっている。

本発明では、表面が糖鎖抗原であるオリゴ糖を化学的合成により得、合成されたオリゴ糖をそのアミノ基含有結合手を介してチップの表面に固定することで合成オリゴ糖チップを製造し、多糖に対して免疫する抗血清を動物免疫により得、抗血清の抗体組成と力価を合成オリゴ糖チップによって解析し、分子レベルでその免疫エピトープを解析し、表面における様々なオリゴ糖鎖と免疫活性との構造活性相関を探求したことで、糖類構造の構造的特性の多様性及び予測困難性といった問題を克服した。本発明はヘリコバクター・ピロリ感染を予防、治療するためのワクチンの製造や開発へ、合成糖鎖抗原を提供する。

本発明の第1の目的は、ヘリコバクター・ピロリに対するワクチンの製造における、一般式（Ｉ）で示されるヘプトース鎖含有オリゴ糖化合物の使用を提供することにある。

式中、ＲはＨ又は

であり；＊は、結合部位を示し；ａ＝１～１００；ｂ＝０～１００；ｃ＝０～１００；結合手を示すＬｉｎｋｅｒは、アミノ基含有結合手である－（ＣＨ_２）_ｎ－ＮＨ_２を含み；ｎは、結合手が、異なる炭素鎖長さを有しうることを表し、ｎ＝２～４０。

本発明の1つの実施形態において、前記ヘプトース鎖含有オリゴ糖化合物は、α－（１→３）－ヘプトース鎖を含み、且つルイス抗原フラグメントを含まない。

本発明の1つの実施形態において、aは０以外であり、ｂ及びｃは、同時に０であってもよい。

本発明の1つの実施形態において、ａは、１～５であることがさらに好ましい。

本発明の１つの実施形態において、ｂは、０～２であることがさらに好ましい。

本発明の１つの実施形態において、ｃは、０～２であることがさらに好ましい。

本発明の１つの実施形態において、ｎは、２～１０であることがさらに好ましい。

本発明の１つの実施形態において、前記抗原は、具体的には、以下の構造で示される化合物を含む。

本発明の１つの実施形態において、前記ヘプトース鎖含有オリゴ糖化合物を製造する方法は、以下のステップを含む。

ステップ（１）：化合物Ｉ＊又は化合物ＩＩ＊を有機溶媒に溶解し、塩基試薬を加えて脱保護を行い、反応が終了した後、中間体化合物を得る。
ステップ（２）：ステップ（１）で得られる中間体化合物を溶媒に溶解し、Ｐｄ／Ｃ還元剤を加え、水素ガス下で還元反応を行い、目的の化合物Ｉ又は目的の化合物ＩＩを得る。

本発明の１つの実施形態において、前記ステップ（１）における有機溶媒は、テトラヒドロフラン、メタノールのいずれか１つ、又は両者の混合物である。

本発明の１つの実施形態において、前記ステップ（１）における有機溶媒は、テトラヒドロフランとメタノールとの混合系であることが好ましい。ここで、ＴＨＦとＭｅＯＨとの体積比は１：１である。

本発明の１つの実施形態において、前記ステップ（１）における塩基試薬は、有機塩基及び／又は無機塩基である。有機塩基は、ナトリウムメトキシドを含み、無機塩基は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムのいずれか１つ以上を含む。

本発明の１つの実施形態において、前記ステップ（１）は、具体的には、以下の手順を含む。

化合物Ｉ＊又は化合物ＩＩ＊をＴＨＦ／ＭｅＯＨ（ｖ／ｖで１：１，２．０ｍＬ）に溶解し、ＣＨ_３ＯＮａを加え、室温下で０．５時間撹拌し、その後、ＮａＯＨ（ａｑ，１Ｍ，２００μＬ）を加え、室温下で１２時間撹拌して反応させる。

本発明の１つの実施形態において、前記ステップ（１）は、以下の手順を含む：反応が完了した後、ＡｍｅｒｌｉｔｅＩＲ１２０（Ｈ^＋）樹脂を添加して反応液をｐＨ７未満となるように中和し、溶液を濾過・濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離・精製する。

本発明の１つの実施形態において、前記ステップ（２）における溶媒は、ＭｅＯＨ、ＴＨＦ、Ｈ_２Ｏ及びＡｃＯＨからなる混合系である。ここで、ＭｅＯＨ、ＴＨＦ、Ｈ_２Ｏ及びＡｃＯＨの体積比は、１０：５：４：１である。

本発明では、ヘリコバクター・ピロリＯ６型リポポリサッカライドに対して免疫するウサギ（ＮｅｗＺｅａｌａｎｄ）から抗血清を抽出・精製し、化学合成されたヘリコバクター・ピロリＯ６型オリゴ糖フラグメントに係る免疫原性の結果を得た。

本発明は、糖フラグメントであるそれぞれのヘプトース鎖含有オリゴ糖化合物を抽出・精製し、化学合成されたヘリコバクター・ピロリＯ６型オリゴ糖フラグメントに係る免疫活性を、動物免疫実験を通して研究してはじめて、完成に至った。

本発明は、式（Ｉ）で示されるヘプトース鎖含有オリゴ糖化合物が、そのアミノ基含有結合手を介してチップの表面に固定されていることを特徴とする、ヘリコバクター・ピロリに対するワクチンを製造するためのオリゴ糖チップをさらに提供する。

本発明は、アミノ基含有結合手により合成オリゴ糖をチップの表面に固定し、抗血清中の抗体によるスクリーニングにより、オリゴ糖チップ中のオリゴ糖フラグメントと免疫原性との関係を調べた。その結果、Ｏ－抗原中のヘプトース鎖は、重要な免疫エピトープであることが明らかになった。例えば、ヘプトース鎖を含む五炭糖化合物３、五炭糖化合物４、及び八炭糖化合物６などは、ウサギの血清抗体に識別されるが、一方でルイス抗原は、この免疫的識別機能を阻害する場合がある。例えば、ルイス抗原を含むトリデコース７は、抗体に識別されない。なお、ヘプトース鎖は、糖鎖抗原フラグメントとして、ヘリコバクター・ピロリを予防、治療するためのワクチンの製造、開発に用いることができる。

本発明は、式（Ｉ）で示されるヘプトース鎖含有オリゴ糖化合物を糖鎖抗原として用いた、ヘリコバクター・ピロリの予防や治療のためのワクチンを提供する。

有利な効果
本発明では、化学的合成により、二炭糖化合物、三炭糖化合物、五炭糖化合物、八炭糖化合物及びトリデコース化合物をそれぞれ得た。合成して得られた抗原糖鎖フラグメントのいずれの還元末端にも、アミノ基含有結合手が組み込まれている。そして、合成オリゴ糖をチップの表面に固定し、合成オリゴ糖チップを製造した。また、動物免疫実験と合成オリゴ糖チップの解析とを組み合わせ、抗血清の中で多糖に対して生じた抗体を用いて検出を行い、合成オリゴ糖と免疫原性との関係を研究した。その結果、抗原中のヘプトース鎖が重要な免疫エピトープであることが明らかになった。例えば、ヘプトース鎖を含む五炭糖化合物３、五炭糖化合物４、及び八炭糖化合物６などは、ウサギの血清抗体に識別されるが、一方でルイス抗原は、この免疫的識別機能に対する阻害予想を有する可能性がある。例えば、ルイス抗原を含むトリデコース７は、抗体に認識されない。なお、ヘプトース鎖は、糖鎖抗原フラグメントとして、ヘリコバクター・ピロリを予防、治療するためのワクチンの製造、開発に用いることができる。

それぞれの抗原オリゴ糖の構造式である。完全に保護された抗原オリゴ糖の前駆体１＊、２＊、３＊、４＊、５＊、６＊及び７＊の構造式である。抽出されたヘリコバクター・ピロリＯ６型リポポリサッカライドのＨ^１核磁気共鳴画像である。抽出されたヘリコバクター・ピロリＯ６型リポポリサッカライドの銀染色像である。ＥＬＩＳＡ法による、ウサギ血清中の抗体の有効力価の検出結果である。糖チップによる、ウサギ血清の検出結果である。（ａ）は抗ウサギＩｇＧを用いた標識ＦＩＴＣの二次抗体の検出結果である。糖チップのスポッティングモードは右側グラフのとおりである。１：三炭糖１、１ｍＭのスポッティング濃度；２：四炭糖２、１ｍＭのスポッティング濃度；３：ヘプトース鎖含有五炭糖３、１ｍＭのスポッティング濃度；４：ヘプトース鎖含有五炭糖４、１ｍＭのスポッティング濃度；５：ルイスＯ－抗原のみを含む五炭糖４、１ｍＭのスポッティング濃度；６：ヘプトース鎖含有八炭糖６、１ｍＭのスポッティング濃度；７：ルイスＯ－抗原を含むトリデコース７、１ｍＭのスポッティング濃度；８：ヘリコバクター・ピロリのＯ６型リポポリサッカライド、１ｍｇ／ｍＬのスポッティング濃度。（ｂ）はリポポリサッカライド免疫ウサギグループ（ＮｅｗＺｅａｌａｎｄ）についての平均蛍光強度の定量検出結果である。誤差線は、異なる２つの検出領域に由来する異なる４つの点の標準偏差を示す。

以下、実施例を挙げて本発明の実施形態を詳細に説明するが、当業者であれば、下記の実施例は、本発明を説明するものにすぎず、本発明を限定するものではないと理解できる。実施例において、具体的な条件を明記していない実施事項は、通常の条件又はメーカー推奨の条件に従って行ったものである。また、使用された試薬や機器についてメーカーが言及されていないものは、いずれも市販により入手可能な通常の製品である。

＜実施例１抗原オリゴ糖化合物の合成＞
抗原オリゴ糖化合物は図１に示す。

化合物１、２、３、４、５、６及び７の合成は、全保護状態の当該化合物１＊、２＊、３＊、４＊、５＊、６＊及び７＊（これらの化合物は、中国特許ＣＮ２０１９１０１５６５３３．１、ＣＮ１０９７７６６３２Ａを参照して製造することができる）を出発材料とし、アルカリ性の条件下で、アシル基をすべて除去した。精製した後、１０％Ｐｄ／Ｃ及び水素を用いて、ベンジル基とベンジルオキシカルボニル基をすべて除去し、全脱保護状態の目的分子１、２、３、４、５、６及び７を得た。

具体的な操作及びステップは、以下のとおりである。
（化合物１）

化合物１＊（２８ｍｇ，０．０１４３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／ＭｅＯＨ（ｖ／ｖで１：１，２．０ｍＬ）に溶解し、ＣＨ_３ＯＮａ（２０ｍｇ）を加えて室温下で０．５時間撹拌した。次に、ＮａＯＨ（ａｑ，１Ｍ，１００μＬ）を加えて室温下で１２時間撹拌しながら反応させた。反応の完了をＴＬＣにより確認した後、ＡｍｅｒｌｉｔｅＩＲ１２０（Ｈ^＋）樹脂を添加して反応液をｐＨ７未満になるように中和した。溶液を濾過、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝５０／１）により分離、精製し、中間生成物を得た。アシル基が除去された該化合物をＭｅＯＨ／ＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ／ＡｃＯＨ（ｖ／ｖ／ｖ／ｖで１０：５：４：１，２ｍＬ）に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（５０ｍｇ）を加え、反応混合物を水素雰囲気下（１ｂａｒ）で４８時間撹拌した。反応の完了を飛行時間型質量分析計により確認した後、溶液を濾過、濃縮し、真空下で乾燥した。その後、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０ゲルカラムで分離、精製して化合物１（８ｍｇ，二つのステップを経て８６％であった）を得た。

^１ＨＮＭＲ（７００ＭＨｚ，ＤｅｕｔｅｒｉｕｍＯｘｉｄｅ）δ５．２２（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，１－Ｈ），５．０５（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ，１－Ｈ），４．９３（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ，１－Ｈ），４．００-３．９３（ｍ，５Ｈ），３．８５（ｄｄ，Ｊ＝３．３，１．８Ｈｚ，１Ｈ），３．８２-３．７４（ｍ，５Ｈ），３．７３（ｄｄ，Ｊ＝５．６，３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．７２-３．６６（ｍ，５Ｈ），３．６６-３．６２（ｍ，３Ｈ），３．５９（ｄｄ，Ｊ＝１０．０，２．９Ｈｚ，１Ｈ），３．５７-３．４９（ｍ，２Ｈ），３．１２-３．００（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２），１．９２（ｄｄｄｄ，Ｊ＝１５．０，１２．０，６．１，３．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_２）．^１３ＣＮＭＲ（１７６ＭＨｚ，ＤｅｕｔｅｒｉｕｍＯｘｉｄｅ）δ１０２．３，１００．５，９８．０，７８．８，７８．６，７４．０，７３．６，７３．３，７１．８，７１．５，７１．４，７０．７，７０．３，７０．１，６９．８，６７．５，６７．４，６７．２，６５．０，６１．７，６１．７，６１．６，６１．５，３７．５，２６．６．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚｃａｌｃｄｆｏｒＣ_２４Ｈ_４６Ｏ_１９Ｎ［Ｍ＋Ｈ］^＋６５２．２６５９，ｆｏｕｎｄ６５２．２７００．

（化合物２）

化合物２＊（３０ｍｇ，０．０１１９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／ＭｅＯＨ（ｖ／ｖで１：１，３．０ｍＬ）に溶解し、ＣＨ_３ＯＮａ（２０ｍｇ）を加えて室温下で０．５時間撹拌した。次に、ＮａＯＨ（ａｑ，１Ｍ，２００μＬ）を加えて室温で１２時間撹拌しながら反応させた。反応の完了をＴＬＣにより確認した後、ＡｍｅｒｌｉｔｅＩＲ１２０（Ｈ^＋）樹脂を添加して反応液をｐＨ７未満になるように中和した。溶液を濾過、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝５０／１）により分離、精製し、半脱保護状態の中間生成物を得た。アシル基が除去された当該化合物をＭｅＯＨ／ＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ／ＡｃＯＨ（ｖ／ｖ／ｖ／ｖで１０：５：４：１，３ｍＬ）に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（６０ｍｇ）を加え、反応混合物を水素雰囲気下（１ｂａｒ）で４８時間撹拌した。反応の完了を飛行時間型質量分析計により確認した後、溶液を濾過、濃縮し、真空下で乾燥した。その後、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０ゲルカラムで分離、精製して化合物２（８．３ｍｇ，二つのステップを経て８３％であった）を得た。

^１ＨＮＭＲ（７００ＭＨｚ，ＤｅｕｔｅｒｉｕｍＯｘｉｄｅ）δ５．１７（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，１Ｈ，１－Ｈ），５．０４（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ，１－Ｈ），４．９９（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，１Ｈ，１－Ｈ），４．９２（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ，１－Ｈ），４．０６-３．９９（ｍ，２Ｈ），３．９９-３．９０（ｍ，５Ｈ），３．８８-３．８２（ｍ，２Ｈ），３．８３-３．７４（ｍ，７Ｈ），３．７４-３．６９（ｍ，４Ｈ），３．６９-３．６５（ｍ，３Ｈ），３．６５-３．６０（ｍ，１Ｈ），３．５８（ｄｄ，Ｊ＝１０．１，２．９Ｈｚ，１Ｈ），３．０６（ｄｄｄｄ，Ｊ＝２０．３，１５．１，１２．８，７．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_２），１．９２（ｄｑ，Ｊ＝１４．１，７．４，７．０Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_２）．^１３ＣＮＭＲ（１７６ＭＨｚ，ＤｅｕｔｅｒｉｕｍＯｘｉｄｅ）δ１０２．７，１００．６，９８．２，９８．０，７９．８，７８．６，７６．４，７４．０，７３．３，７２．７，７２．３，７２．１，７１．５，７１．１，７０．６，７０．６，７０．４，７０．３，７０．０，６９．７，６７．６，６７．５，６７．４，６６．７，６４．９，６２．１，６１．７，６１．４，６０．８，３７．５，２６．７．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚｃａｌｃｄｆｏｒＣ_３１Ｈ_５８Ｏ_２５Ｎ［Ｍ＋Ｈ］^＋８４４．３２９２，ｆｏｕｎｄ８４４．３３３５．

（化合物３）

化合物３＊（２５ｍｇ，０．００８１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／ＭｅＯＨ（ｖ／ｖで１：１，２．０ｍＬ）に溶解し、ＣＨ_３ＯＮａ（２０ｍｇ）を加えて室温下で０．５時間撹拌した。次に、ＮａＯＨ（ａｑ，１Ｍ，２００μＬ）を加えて室温下で１２時間撹拌しながら反応させた。反応の完了をＴＬＣにより確認した後、ＡｍｅｒｌｉｔｅＩＲ１２０（Ｈ^＋）樹脂を添加して反応液をｐＨ７未満になるように中和した。溶液を濾過、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝５０／１）により分離、精製し、半脱保護状態の中間生成物を得た。アシル基が除去された当該化合物をＭｅＯＨ／ＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ／ＡｃＯＨ（ｖ／ｖ／ｖ／ｖで１０：５：４：１，２ｍＬ）に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（５０ｍｇ）を加え、反応混合物を水素雰囲気下（１ｂａｒ）で４８時間撹拌した。反応の完了を飛行時間型質量分析計により確認した後、溶液を濾過、濃縮し、真空下で乾燥した。その後、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０ゲルカラムで分離、精製して化合物３（７．４ｍｇ，二つのステップを経て８８％であった）を得た。

^１ＨＮＭＲ（７００ＭＨｚ，ＤｅｕｔｅｒｉｕｍＯｘｉｄｅ）δ５．１４-５．１１（ｍ，１Ｈ，１－Ｈ），５．０９-５．０８（ｍ，１Ｈ，１－Ｈ），５．０７-５．０６（ｍ，１Ｈ，１－Ｈ），５．０４-５．００（ｍ，１Ｈ，１－Ｈ），４．９５-４．９３（ｍ，１Ｈ，１－Ｈ），４．１２（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），４．０３-３．９５（ｍ，１２Ｈ），３．９２（ｄｄ，Ｊ＝９．３，３．３Ｈｚ，１Ｈ），３．９０-３．８７（ｍ，２Ｈ），３．８４（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１Ｈ），３．８３-３．７９（ｍ，３Ｈ），３．７９-３．６８（ｍ，１２Ｈ），３．６８-３．６０（ｍ，５Ｈ），３．５９（ｄｄ，Ｊ＝１０．０，２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．５７-３．４９（ｍ，３Ｈ），３．０５（ｔｑ，Ｊ＝１２．９，７．４，６．６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_２），１．９８-１．８６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）．^１３ＣＮＭＲ（１７６ＭＨｚ，ＤｅｕｔｅｒｉｕｍＯｘｉｄｅ）δ１０２．１，１０２．０，１００．５，９９．１，９８．１，７８．７，７８．４，７８．２，７７．４，７４．０，７３．６，７３．３，７３．１，７２．３，７２．１，７１．６，７１．４，７０．７，７０．６，７０．４，７０．１，６９．９，６９．６，６９．６，６７．５，６７．５，６７．４，６６．８，６６．５，６４．９，６２．０，６２．０，６１．７，６１．６，６１．５，３７．５，２６．７．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚｃａｌｃｄｆｏｒＣ_３８Ｈ_７０Ｏ_３１Ｎ［Ｍ＋Ｈ］^＋１０３６．３９２６，ｆｏｕｎｄ１０３６．３９５８．

（化合物４）

化合物４＊（２０ｍｇ，０．００６２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／ＭｅＯＨ（ｖ／ｖで１：１，２．０ｍＬ）に溶解し、ＣＨ_３ＯＮａ（１５ｍｇ）を加えて室温下で０．５時間撹拌した。次に、ＮａＯＨ（ａｑ，１Ｍ，１００μＬ）を加えて室温下で１２時間撹拌しながら反応させた。反応の完了をＴＬＣにより確認した後、ＡｍｅｒｌｉｔｅＩＲ１２０（Ｈ^＋）樹脂を添加して反応液をｐＨ７未満になるように中和した。溶液を濾過、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝５０／１）により分離、精製し、半脱保護状態の中間生成物を得た。アシル基が除去された当該化合物をＭｅＯＨ／ＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ／ＡｃＯＨ（ｖ／ｖ／ｖ／ｖで１０：５：４：１，２ｍＬ）に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（４０ｍｇ）を加え、反応混合物を水素雰囲気下（１ｂａｒ）で４８時間撹拌した。反応の完了を飛行時間型質量分析計により確認した後、溶液を濾過、濃縮し、真空下で乾燥した。その後、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０ゲルカラムで分離、精製して化合物４（５．９ｍｇ，二つのステップを経て８５％であった）を得た。

^１ＨＮＭＲ（７００ＭＨｚ，ＤｅｕｔｅｒｉｕｍＯｘｉｄｅ）δ５．０５（ｓ，１Ｈ，１－Ｈ），５．０３（ｓ，２Ｈ，１－Ｈ），５．０２（ｓ，１Ｈ，１－Ｈ），４．７７（ｓ，１Ｈ，１－Ｈ），４．１７（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，２Ｈ），４．０４（ｓ，１Ｈ），３．９９（ｑｄ，Ｊ＝７．１，３．５Ｈｚ，５Ｈ），３．９３-３．８７（ｍ，３Ｈ），３．８６-３．７１（ｍ，１３Ｈ），３．７１-３．６１（ｍ，７Ｈ），３．５９-３．５０（ｍ，２Ｈ），３．１４-２．９８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２），１．９２（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_２）．^１３ＣＮＭＲ（１７６ＭＨｚ，ＤｅｕｔｅｒｉｕｍＯｘｉｄｅ）δ１０２．２，１０２．１，１０２．１，１０２．０，９９．６，７８．１，７７．９，７７．９，７７．８，７３．９（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７３．８，７３．８，７３．１，７１．５，７１．４，７１．３，７０．６，６９．９，６９．４，６９．４，６７．４，６６．８，６６．７，６６．７，６４．９，６１．６，６１．５，３７．５，２６．６．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚｃａｌｃｄｆｏｒＣ_３８Ｈ_７０Ｏ_３１Ｎ［Ｍ＋Ｈ］^＋１０３６．３９２６，ｆｏｕｎｄ１０３６．３９１１．

（化合物５）

化合物５＊（１２ｍｇ，０．００４９ｍｍｏｌ）をＡｃ_２Ｏ（１ｍＬ）に溶解し、新たに活性化された亜鉛粉末（５０ｍｇ）を加えた。室温下で１５時間撹拌しながら反応させた。原料がすべて消費されたことをＴＬＣにより確認した後、溶液を濾過、減圧濃縮し、真空下で乾燥してＮＡｃ中間生成物を得た。当該中間生成物をＴＨＦ／ＭｅＯＨ（ｖ／ｖで１：１，１ｍＬ）に溶解し、ＣＨ_３ＯＮａ（１０ｍｇ）を加え、室温下で０．５時間撹拌した。その後、ＮａＯＨ（ａｑ，１Ｍ，１００μＬ）を加えて室温下で１２時間撹拌しながら反応させた。反応の完了をＴＬＣにより確認した後、ＡｍｅｒｌｉｔｅＩＲ１２０（Ｈ^＋）樹脂を添加して反応液をｐＨ７未満になるように中和した。溶液を濾過、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝５０／１）により分離、精製し、中間生成物を得た。アシル基が除去された当該化合物をＭｅＯＨ／ＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ／ＡｃＯＨ（１０：５：４：１，１ｍＬ）に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（４０ｍｇ）を加え、反応混合物を水素雰囲気下（１ｂａｒ）で４８時間撹拌した。反応の完了を飛行時間型質量分析計により確認した後、溶液を濾過、濃縮し、真空下で乾燥した。その後、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０ゲルカラムで分離、精製して化合物５（３．６ｍｇ，三つのステップを経て８１％であった）を得た。

^１ＨＮＭＲ（７００ＭＨｚ，ＤｅｕｔｅｒｉｕｍＯｘｉｄｅ）δ５．２０（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ，１－Ｈ），５．０４（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ，１－Ｈ），４．８０（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），４．６５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ_２），４．４４（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ_２），４．３３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ_２），４．１８（ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），４．０９-４．０４（ｍ，１Ｈ），３．９７（ｄｔ，Ｊ＝１１．３，６．４Ｈｚ，１Ｈ），３．９３（ｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ，１Ｈ），３．９１-３．８３（ｍ，３Ｈ），３．７９（ｄｑ，Ｊ＝１２．５，６．０，４．６Ｈｚ，３Ｈ），３．７６-３．６８（ｍ，６Ｈ），３．６７-３．５８（ｍ，５Ｈ），３．５８-３．５１（ｍ，４Ｈ），３．４９（ｔ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），３．３８（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），３．０８（ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_２），１．９５（ｓ，３Ｈ，ＣＨ_３ＣＯ），１．９２（ｄｔ，Ｊ＝１３．２，６．６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_２），１．１９（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ，Ｆｕｃｏｓｅ－ＣＨ_３），１．１６（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ，Ｆｕｃｏｓｅ－ＣＨ_３）．^１３ＣＮＭＲ（１７６ＭＨｚ，ＤｅｕｔｅｒｉｕｍＯｘｉｄｅ）δ１７４．７，１０２．９，１０２．４，１００．２，９９．４，９８．６，８２．３，７６．４，７５．４，７４．８，７４．７，７４．７，７３．５，７３．０，７１．９，７１．７，６９．７，６９．７，６９．１，６８．７，６８．３，６８．２，６７．９，６７．７，６６．９，６６．８，６１．５，６１．４，６０．９，５９．８，３７．６，２６．８，２２．３，１５．４（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚｃａｌｃｄｆｏｒＣ_３５Ｈ_６３Ｏ_２４Ｎ_２［Ｍ＋Ｈ］^＋８９５．３７６５，ｆｏｕｎｄ８９５．３７６６．

（化合物６）

化合物６＊（２０ｍｇ，４．２μｍｏｌ）をＴＨＦ／ＭｅＯＨ（１：１，２ｍＬ）に溶解し、ＭｅＯＮａ（５０ｍｇ）を加えて室温下で０．５時間撹拌した。次に、ＮａＯＨ（ａｑ，１Ｍ，１００μＬ）を加えて室温下で１２時間撹拌しながら反応させた。反応の完了をＴＬＣにより確認した後、ＡｍｅｒｌｉｔｅＩＲ１２０（Ｈ^＋）樹脂を添加して反応液をｐＨ７未満になるように中和した。溶液を濾過、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝５０／１）により分離、精製し、中間生成物を得た。アシル基が除去された当該化合物をＭｅＯＨ／ＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ／ＡｃＯＨ（ｖ／ｖ／ｖ／ｖで１０：５：４：１，２ｍＬ）に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（４０ｍｇ）を加え、反応混合物を水素雰囲気下（１ｂａｒ）で４８時間撹拌した。反応の完了を飛行時間型質量分析計により確認した後、溶液を濾過、濃縮し、真空下で乾燥した。その後、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０ゲルカラムで分離、精製して化合物６（５．４ｍｇ，二つのステップを経て８０％であった）を得た。

^１ＨＮＭＲ（７００ＭＨｚ，ＤｅｕｔｅｒｉｕｍＯｘｉｄｅ）δ５．１３（ｓ，１Ｈ，１－Ｈ），５．０９（ｓ，１Ｈ，１－Ｈ），５．０４（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，２Ｈ，１－Ｈ），５．０３（ｓ，３Ｈ，１－Ｈ），５．０２（ｓ，１Ｈ，１－Ｈ），４．９４（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ，１－Ｈ），４．１７（ｐ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，４Ｈ），４．１２（ｔ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），３．９８（ｄｔ，Ｊ＝１０．２，３．５Ｈｚ，１６Ｈ），３．９０（ｄｄｄ，Ｊ＝１３．９，８．９，２．９Ｈｚ，８Ｈ），３．８５-３．７２（ｍ，２３Ｈ），３．７２-３．６８（ｍ，３Ｈ），３．６８-３．６１（ｍ，８Ｈ），３．６０（ｄｄ，Ｊ＝９．６，６．７Ｈｚ，１Ｈ），３．５８-３．５６（ｍ，１Ｈ），３．５６-３．５０（ｍ，３Ｈ），３．０３（ｄｄｔ，Ｊ＝１４．７，１２．７，６．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_２），１．９６-１．８６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）．^１３ＣＮＭＲ（１７６ＭＨｚ，ＤｅｕｔｅｒｉｕｍＯｘｉｄｅ）δ１０２．２，１０２．１，１００．５，９８．１，７８．６，７８．２，７８．０，７７．８，７７．７，７３．９，７３．８，７３．７，７３．３，７３．２，７２．４，７２．１，７１．６，７１．４，７１．３，７０．７，７０．６，７０．４，７０．２，６９．９，６９．６，６９．５，６８．１，６７．５，６７．４，６６．８，６６．７，６５．０，６２．０，６１．７，６１．６，６１．５，６１．４，３７．５，２６．９，２５．３．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚｃａｌｃｄｆｏｒＣ_５９Ｈ_１０６Ｏ_４９Ｎ［Ｍ＋Ｈ］^＋１６１２．５８２８，ｆｏｕｎｄ１６１２．５８３１．

（化合物７）
化合物７＊（９ｍｇ，０．００１４ｍｍｏｌ）をＡｃＯＨ（１ｍＬ）に溶解し、新たに活性化された亜鉛粉末（５０ｍｇ）を加えた。室温下で１２時間撹拌しながら反応させた。原料がすべて消費されたことをＴＬＣにより確認した後、溶液を濾過、減圧濃縮した。その後、適量のＤＣＭを加えて希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３で洗浄した。無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、溶液を濾過した後、減圧濃縮し、真空下で乾燥してＮＡｃ中間生成物を得た。当該中間生成物をＴＨＦ／ＭｅＯＨ（１：１，１ｍＬ）に溶解し、ＭｅＯＮａ（１０ｍｇ）を加え、室温下で１５分間撹拌した。その後、ＮａＯＨ（ａｑ，１Ｍ，１００μＬ）を加え、室温下で１２時間撹拌しながら反応させた。反応の完了をＴＬＣにより確認した後、ＡｍｅｒｌｉｔｅＩＲ１２０（Ｈ^＋）樹脂を添加して反応液をｐＨ７未満になるように中和した。溶液を濾過、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝５０／１）により分離、精製し、中間生成物を得た。アシル基が除去された当該化合物をＭｅＯＨ／ＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ／ＡｃＯＨ（１０：５：４：１，１ｍＬ）に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（４０ｍｇ）を加え、反応混合物を水素雰囲気下（１ｂａｒ）で２４時間撹拌した。反応の完了を飛行時間型質量分析計により確認した後、溶液を濾過、濃縮し、真空下で乾燥した。その後、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０ゲルカラムで分離、精製して化合物７（３ｍｇ，三つのステップを経て８２％であった）を得た。

^１ＨＮＭＲ（７００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）δ＝５．２０（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ，ａｎｏｍｅｒｉｃＨ），５．１３（ｓ，１Ｈ，ａｎｏｍｅｒｉｃＨ），５．１０（ｓ，１Ｈ，ａｎｏｍｅｒｉｃＨ），５．０９（ｓ，１Ｈ，ａｎｏｍｅｒｉｃＨ），５．０６－５．０１（ｍ，５Ｈ，ａｎｏｍｅｒｉｃＨ），４．９５（ｓ，１Ｈ，ａｎｏｍｅｒｉｃＨ），４．８２－４．７８（ｍ，１Ｈ），４．６５（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ，ａｎｏｍｅｒｉｃＨ），４．４４（ｄｄ，Ｊ＝７．８，４．１Ｈｚ，２Ｈ），４．２１－４．１４（ｍ，６Ｈ），４．１２（ｓ，１Ｈ），４．０６（ｓ，１Ｈ），３．９９（ｔ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１０Ｈ），３．９５－３．８６（ｍ，８Ｈ），３．８６－３．６８（ｍ，３７Ｈ），３．６４（ｄｔ，Ｊ＝２１．４，９．９Ｈｚ，１４Ｈ），３．６０－３．５０（ｍ，５Ｈ），３．４１－３．３６（ｍ，１Ｈ），３．１１－３．０１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２），１．９５（ｓ，３Ｈ，ＣＨ_３ＣＯ），１．９４－１．８９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２），１．１９（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ，Ｆｕｃｏｓｅ－ＣＨ_３），１．１６（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ，Ｆｕｃｏｓｅ－ＣＨ_３）．^１３ＣＮＭＲ（１７６ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）δ＝１５８．８，１０２．６（ａｎｏｍｅｒｉｃ），１０２．１（ａｎｏｍｅｒｉｃ），１０２．０４（ａｎｏｍｅｒｉｃ），１０１．９９（ａｎｏｍｅｒｉｃ），１０１．９（ａｎｏｍｅｒｉｃ），１０１．７（ａｎｏｍｅｒｉｃ），１０１．２（ａｎｏｍｅｒｉｃ），１００．５（ａｎｏｍｅｒｉｃ），１００．２（ａｎｏｍｅｒｉｃ），９９．４（ａｎｏｍｅｒｉｃ），９９．２（ａｎｏｍｅｒｉｃ），９８．５（ａｎｏｍｅｒｉｃ），９８．１（ａｎｏｍｅｒｉｃ），８２．１，７９．７，７９．０，７８．６，７８．６，７８．２，７７．９，７７．８，７６．３，７５．４，７４．８，７４．８，７４．０，７３．９，７３．８，７３．７，７３．５，７３．２，７３．１，７２．１，７１．９，７１．７，７１．５，７１．３９，７１．３６，７１．３，７０．６，７０．４，７０．１，６９．９，６９．７，６９．５，６９．４５，６９．４４，６９．４１，６９．１，６８．７，６８．４，６８．３，６７．７５，６７．６８，６７．５，６７．４６，６６．９，６６．８１，６６．７７，６６．７，６６．６８，６６．６７，６６．０，６５．９，６５．７，６４．９，６２．０５，６２．０，６１．７３，６１．６９，６１．６，６１．５，６１．４７，６１．４６，６１．０，５９．８，３７．５，２６．６，２２．３，１５．４．ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：ｃａｌｃｄｆｏｒＣ_９１Ｈ_１６０Ｏ_７２Ｎ_２［Ｍ＋２Ｈ］^２＋１２１６．４４５５，ｆｏｕｎｄ１２１６．４２８７；Ｃ_９１Ｈ_１６０Ｏ_７２Ｎ_２Ｋ［Ｍ＋２Ｈ＋Ｋ］^３＋８２３．９５１４，ｆｏｕｎｄ８２３．９４４２．

＜実施例２ヘリコバクター・ピロリＯ６型の培養、不活化、及びリポポリサッカライドの抽出＞
ヘリコバクター・ピロリＯ６型の培養は、まず、血液寒天培地プレートにて、７％ＣＯ_２の雰囲気環境下、３７℃下で７２時間培養した。続いて、ブルセラブロス培地（ＥＬＩＴＥ－ＭＥＤＩＡ）に移して７％ＣＯ_２の雰囲気環境下、３７℃下で７２時間培養して菌液を得た。

ヘリコバクター・ピロリＯ６型の不活化は、１．７×１０^１１ＣＦＵ／ｍＬの菌液５０ｍＬに、４％パラホルムアルデヒド５ｍＬを加えて最終濃度を０．４％とした。続いて３７℃下で、７２時間インキュベートした。菌体を遠心分離により収集し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、最後にＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５×１０^１２ＣＦＵ／ｍＬになるまで希釈し、４℃で保存した。

ヘリコバクター・ピロリＯ６型のリポポリサッカライドは、フェノール・水法を用いて抽出した。具体的には、菌体を遠心分離により収集し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、沈殿させて湿重量を秤量した。菌体の湿重量の３倍の質量である無菌水を用いて再懸濁させ、菌体の懸濁液を得た。菌体の懸濁液を５回繰り返して凍結・融解した。等体積の９０％フェノールと混合し、恒温水浴中で振とうした後、混合液を４℃に冷却し、遠心分離して上層の水相を吸い取った。続いて、等体積の無菌水を加え、恒温水浴中で振とうした後、４℃に冷却し、遠心分離して上澄み液を吸い取った。２つの上澄み液を混合し、これを、塩化第二鉄を用いる測定において紫色が生じなくなるまで、蒸留水にて透析し、凍結乾燥して保存した。

凍結乾燥したＬＰＳ粉末をＴｒｉｓ－ＨＣｌ（１００ｍｍｏｌ，ｐＨ８．０）に溶解し、ＤＮａｓｅＩを最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように加え、ＲＮａｓｅＡを最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように加えた。３７℃下で一晩消化した後、１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを加え、２時間作用させた。その後、１００℃の沸騰水中で１０分間加熱して酵素を不活化し、４℃に冷却し、遠心分離して上澄み液を収集した。上澄み液に、水飽和フェノールを加えて均一に混合し、再度遠心分離し、澄み液を収集して透析、凍結乾燥を行った。最終濃度が８５％になるまで、凍結乾燥粉末に無水エタノールを加え、－２０℃下で一晩沈殿させた。遠心分離した後、上澄み液を捨て、沈殿、凍結乾燥を行い、重量を秤量した。得られた凍結乾燥粉末をＨ^１ＮＭＲにより測定したところ（図２）、炭素鎖における多糖を示す特徴的なピークが確認され、且つ化学シフト１．９５において、Ｎ-アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を示す特徴的なピークが確認され、且つ化学シフト１．１８において、フコース（Ｆｕｃｏｓｅ－ＣＨ_３）を示す特徴的なピークが確認された。抽出したリポポリサッカライドは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動、銀染色（図３及び図４）を実施した結果、純度が良く、得られた該リポポリサッカライドの平均分子量の分布が２９ＫＤａ以下の範囲に集中していることが分かった。

（ヘリコバクター・ピロリＯ：６血清型リポポリサッカライドの免疫実験）
１．８～２．２ｋｇのウサギ（ＮｅｗＺｅａｌａｎｄ）を、３匹からなる実験グループと、３匹からなる対照グループとの二グループに振り分けた。０日目に、実験グループのウサギ（ＮｅｗＺｅａｌａｎｄ）に対しては、皮下の複数個所からの免疫注射により、リポポリサッカライドと完全フロイントアジュバントとからなる１：１混合乳液を５００μＬ注射した。対照グループのマウスに対しては、ＰＢＳと完全フロイントアジュバントとからなる１：１混合乳液を５００μＬ注射した。１４日目と２８日目に、完全フロイントアジュバントの代わりに、不完全フロイントアジュバントを用いて免疫強化を行った。実験グループのウサギ（ＮｅｗＺｅａｌａｎｄ）１匹につき、１回あたりの抗原の注射量は、４００μｇのリポポリサッカライド抗原に相当する量であった。３５日目のウサギ（ＮｅｗＺｅａｌａｎｄ）の血清を採取し、ＥＬＩＳＡ検出を行った。

（ヘリコバクター・ピロリＯ：６血清型リポポリサッカライド抗血清のＥＬＩＳＡ検出）
０．０５ＭＣＢＳ緩衝液（ｐＨ９．６）でＬＰＳを２０μｇ／ｍＬになるまで希釈した後、１００μＬ／ウェルのＥＬＩＳＡウェルプレートを用いて４℃下で２４時間固相化し、ＰＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄し、叩いて水切りした。固相化後のＥＬＩＳＡウェルプレートに、３００μＬ／ウェルでブロッキング液（５％の脱脂牛乳を含むＰＢＳＴ）を加え、シーリングフィルムでプレートをシールし、２５℃、６時間ブロッキングした。ブロッキング液を捨て、ＰＢＳＴで３回洗浄し、叩いて水切りした。１％ＢＳＡ－ＰＢＳ（ｗ／ｖ）で希釈したそれぞれの勾配のウサギ血清を１００μＬ／ウェルで固相化済みのウェルプレートを加えた。３７℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄し、叩いて水切りした。１：５０，０００に希釈したホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ二次抗体を１００μＬ／ウェルで添加し、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄し、叩いて水切りした。ＴＭＢ発色液を２００μＬ／ウェルで用い、３７℃、遮光下でインキュベートし、発色が確認さされると、直ちに２ＭのＨ_２ＳＯ_４を５０μＬ／ウェルで用いて終了させた。４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。図５に示す抗体の力価を得た。抗体の力価が最も高いウサギ血清を選び、糖チップのスクリーニングに用いた。ＥＬＩＳＡ検出により、ヘリコバクター・ピロリＯ６型ＬＰＳを注射したウサギ（ＮｅｗＺｅａｌａｎｄ）の血清が、抽出されたＬＰＳと結合可能なことが確認され、また、血清中の抗体の有効力価が１：１０，０００に達したことが確認された。

＜実施例３オリゴ糖化合物のヘリコバクター・ピロリに対するワクチンの製造における使用＞

（オリゴ糖化合物とＣＲＭ－１９７との糖タンパク質コンジュゲートの製造）
ビス（ｐ－ニトロフェニルアジペート）（ＰＮＰ，２６．３３ｍｇ，６７．８μｍｏｌ）のＤＭＳＯ／ピリジン溶液（１：１，２５ｍＬ：０．２５ｍＬ）に、トリエチルアミン（１２μＬ，８６μｍｏｌ）を加え、室温下で５分間攪拌した。ＤＭＳＯ／ピリジン（１／１，０．１ｍＬ：０．１ｍＬ）に溶解したオリゴ糖化合物（１．６ｍｇ，２．２６μｍｏｌ）を滴下し、室温下で７時間撹拌して反応させた。原料が完全に反応したことをＴＬＣ検出により確認し、生成物を砂糖ステイン（０．１％（ｖ／ｖ）３－メトキシフェノール、２．５％（ｖ／ｖ）硫酸－エタノール）により確認した。反応混合物を凍結乾燥した。凍結乾燥の固体をクロロホルム（１ｍＬ）で６回洗浄し、オリゴ糖－ＰＮＰエステルを得た。限外ろ過チューブ内において、ＣＲＭ_１９７タンパク質（１ｍｇ，０．０１７μｍｏｌ）を滅菌水（４００μＬ）で３回洗浄し、さらにリン酸塩溶液（ｐＨ８．０，４００μＬ）で１回洗浄した。洗浄したＣＲＭ_１９７タンパク質をオリゴ糖－ＰＮＰエステルに加え、室温下で２４時間撹拌しながら反応させた後、混合物を滅菌水及びリン酸塩溶液で洗浄し、糖タンパク質コンジュゲートを得た。得られた糖タンパク質コンジュゲートについて、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ－ＭＳ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて同定した。

（糖コンジュゲートの免疫実験）
６週齢のＢａｌｂ／ｃマウス８匹を、５匹からなる実験グループと、３匹からなる対照グループとの二グループに振り分けた。０日目に、実験グループのマウスに対しては、皮下免疫注射により、糖コンジュゲートと完全フロイントアジュバントとの１：１混合乳液を１００μＬ注射した。対照グループのマウスに対しては、ＰＢＳと完全フロイントアジュバントとの１：１混合乳液を１００μＬ注射した。１４日目と２８日目に、完全フロイントアジュバントの代わりに、不完全フロイントアジュバントを用いて免疫強化を行った。実験グループのマウス１匹につき、１回あたりの抗原の注射量は、４μｇの糖鎖抗原に相当する量であった。０日目、７日目、１４日目、２１日目、３５日目に、マウスから血清を採取し、チップ検出を行った。

（オリゴ糖チップの構築とテスト）
化学的に合成したオリゴ糖抗原を、アミノ基含有結合手を介してチップの表面に固定した。オリゴ糖チップを用いて抗血清をインキュベートした後、これを、さらに二次抗体を用いてインキュベートした。

チップスキャナを用い、オリゴ糖フラグメントと抗体との結合を示す蛍光を観測できた。なお、この手法を採用すれば、オリゴ糖フラグメントと血清中の抗体との結合の強さを定量することができる。そのため、化学的に合成したオリゴ糖の量及び抗血清を節約することができるとともに、反応の結果を確認することができる。

（免疫原性研究における抗血清中抗体の検出プロセスへの、オリゴ糖チップの利用）

具体的には、以下のステップを含む。
（１）活性化を経たアミノ化スライドガラスに対して、バイオチップスポッターを用いてスポッティングした。スポッティングした後、２６℃、５５％の湿度で、一晩インキュベートした。
（２）次に、スライドガラスを溶液Ｂ（５０ｎＭＮａ_２ＨＰＯ_４、１００ｎＭエタノールアミンの水溶液）に５０℃で１時間浸漬した。スライドガラスを超純水で３回洗浄し、遠心分離して残留の水を除去した。
（３）３％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）のＰＢＳ溶液を使用し、４℃で一晩ブロッキングした。ＰＢＳＴ（０．１％ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ）で１回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離により水切りした。
（４）スライドガラスを１６ウェル式インキュベーター（ＰｒｏＰｌａｔｅ）に入れた。１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）のＰＢＳ溶液中に１：５０で希釈したマウス血清サンプルを、１ウェルにつき、１２０μＬ加え、遮光下、ウェットボックス内において３７℃下で、１時間インキュベートした。サンプルを取り除き、１５０μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。
（５）１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）のＰＢＳ溶液中に１：４００で希釈した二次抗体を加え、遮光下、ウェットボックス内において３７℃下で、４５分間インキュベートした。二次抗体の溶液を取り除き、１５０μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。１６ウェル式インキュベーターを取り外し、超純水で洗浄した後、再度、超純水で１５分間洗浄した。遠心分離して残留の水を除去した。チップスキャナでスキャンした。

（ヘリコバクター・ピロリＯ：６血清型合成オリゴ糖フラグメントの免疫原性の測定）
ＮＨＳスライドガラス（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ，ＤＮ０１－００２５）をバイオチップスポッター（江蘇瑞明生物科技有限公司）を用いてスポッティングした。スポッティングした後、２６℃、５５％の湿度で、一晩インキュベートした。次に、スライドガラスを溶液Ｂ（５０ｎＭＮａ_２ＨＰＯ_４、１００ｎＭエタノールアミンの水溶液）に５０℃で１時間浸漬した。スライドガラスを超純水で３回洗浄し、遠心分離して残留の水を除去した。３％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）のＰＢＳ溶液を使用し、４℃で一晩ブロッキングした。ＰＢＳＴ（０．１％ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ）で１回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離により水切りした。スライドガラスを１６ウェル式インキュベーター（ＰｒｏＰｌａｔｅ）に入れた。１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）のＰＢＳ溶液中に１：５０で希釈したマウスの血清サンプルを、１ウェルにつき、１２０μＬ加え、遮光下、ウェットボックス内において３７℃下で、１時間インキュベートした。サンプルを取り除き、１５０μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）のＰＢＳ溶液中に１：４００で希釈した二次抗体を加え、遮光下、ウェットボックス内において３７℃下で、４５分間インキュベートした。二次抗体の溶液を取り除き、１５０μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。１６ウェル式インキュベーターを取り外し、超純水で洗浄した後、再度、超純水で１５分間洗浄した。遠心分離して残留の水を除去した。チップスキャナでスキャンした。図６に示す結果、すなわち、五炭糖３、五炭糖４、八炭糖６の蛍光強度が強かったことを示す結果を得た。この結果から分かるように、ヘリコバクター・ピロリＯ：６血清型から精製した多糖に対して生じた血清抗体は、α－（１→３）－ヘプトース鎖を含むフラグメント（五炭糖３、五炭糖４、八炭糖６）に対して、強い識別性、結合性を顕著に示したが、ルイス構造５、及び同様にα－（１→３）－ヘプトース鎖を含むトリデコース７に対しては識別できなかった。すなわち、ルイス構造が、抗体の、ヘプトースに対する免疫的識別を阻害したと考えられる。このように、α－（１→３）－ヘプトース鎖は重要な免疫エピトープであり、半合成糖質ワクチンにおける重要な抗原物質として使用することができる。

Claims

ヘリコバクター・ピロリに対するワクチンの製造における、一般式（Ｉ）で示されるヘプトース鎖含有オリゴ糖化合物の使用。

（式中、ＲはＨ又は

であり；＊は、結合部位を示し；ａ＝１～１００；ｂ＝０～１００；ｃ＝０～１００；結合手を示すＬｉｎｋｅｒは、アミノ基含有結合手である－（ＣＨ_２）_ｎ－ＮＨ_２を含み；ｎは、結合手が、異なる炭素鎖長さを有しうることを表し、ｎ＝２～４０。）
ａは１～５であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
ｂは０～２であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
ｃは０～２であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
ｎは２～１０であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
前記ヘプトース鎖含有オリゴ糖化合物は、α－（１→３）－ヘプトース鎖を含むことを特徴とする、請求項１に記載の使用。
前記ヘプトース鎖含有オリゴ糖化合物は、以下の構造で示される化合物を含むことを特徴とする、請求項１に記載の使用。
前記ヘプトース鎖含有オリゴ糖化合物は、以下に示す手順で合成されることを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用。
請求項１～７のいずれか一項に記載のヘプトース鎖含有オリゴ糖化合物が、その構造中のアミノ基含有結合手を介してチップの表面に固定されていることを特徴とする、
ヘリコバクター・ピロリに対するワクチンを製造するためのオリゴ糖チップ。
請求項１～７のいずれか一項に記載のヘプトース鎖含有オリゴ糖化合物を糖鎖抗原として用いた、
ヘリコバクター・ピロリ感染の予防、治療のためのワクチン。