CN106581619A - 高效抗耐药菌的珊瑚姜有效成分纳米剂型的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效抗耐药菌的珊瑚姜有效成分纳米剂型的制备方法，其特征在于：先将油酸、硬脂酸、聚乙二醇、丙二醇、乙二醇、无水乙醇、蒸馏水混合均匀，在30～50℃条件下，通过超声波或乳化机反应搅拌混合30～60分钟，静置，冷却至溶液清亮透明，得到前驱溶液；分别取得到的清亮透明的前驱溶液100份，与1～25份松油烯‑4‑醇，1～25份珊瑚姜油超声波混合均匀，得到高效抗耐药的珊瑚姜有效成分纳米剂型。

Description

高效抗耐药菌的珊瑚姜有效成分纳米剂型的制备方法
技术领域
本发明涉及两种高效抗耐药的珊瑚姜有效成分纳米剂型的制备方法，属于纳米剂型中药制的制备领域。
背景技术
近年来，随着医疗活动的复杂化，医院感染逐渐升高，影响了医疗质量，加重了患者的经济负担。引起医院感染的病原体主要是条件致病菌，从医院感染患者分离的细菌，大多数具有耐药性，部分是多重耐药。解决细菌耐药性问题，目前除了加强防止抗细菌药物的滥用、加强细菌耐药性的监测等辅助治疗措施之外，目前的研究方向侧重于鼓励开发新型抗菌药物及新型酶抑制剂，寻找现有抗菌药物的增敏剂、加强联合抗菌作用的测定与评价方法研究等。随着社会的发展，天然药物在治疗和预防某些疾病方面以其独特的疗效和作用受到越来越多的关注。我国是一个天然药物大国，传统中草药具有不良反应小、不易产生耐药性、能够辨证施治和标本兼治，且来源广泛、价格低廉，从中药发掘抗菌药活性成分是抗菌中药研究的一个主要趋势，对新型抗菌中药的研究与开发，寻找克服细菌耐药性的对策，减缓细菌耐药性的发展，近些年来已成为国内外学者研究的热点，具有重大意义。
珊瑚姜(Zingiber corallinum Hance)别名阴姜，为姜科姜属植物的根茎，多年草本生，主要分布在云南、广西及贵州等地，系苗族习用药材，少数民族常以珊瑚姜块茎入药。其味苦，性寒。具有健胃、消积之功、消肿、解毒、抗菌的功能，药用价值高。珊瑚姜气味温辛，含多种挥发成分，其中珊瑚姜有效成分珊瑚姜油有较强的抗菌特性，临床上常用作抗菌的药物。珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇也是的主要组份之一，国内外很多学者通过研究证实了珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇具有抗细菌、杀螨虫、抗炎、抗病毒等作用。相关文献已报道，在珊瑚姜有效成分珊瑚姜油及有效成分松油烯-4-醇的抗细菌研究中，两者均对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌及肺炎克雷伯菌的临床分离菌株有抑制作用。由于珊瑚姜有效成分珊瑚姜油及松油烯-4-醇均不易溶于水，透皮吸收差，导致其无法完全发挥药理作用，限制了其被推广应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种从中药中发掘抗菌活性成分且确保药物疗效的高效抗耐药菌的珊瑚姜有效成分纳米剂型的药物及其制备方法，可以克服现有技术及应用的不足与限制。
本发明的技术方案是：一种高效抗耐药菌的珊瑚姜有效成分纳米剂型的制备方法，先将油酸、硬脂酸、聚乙二醇、丙二醇、乙二醇、无水乙醇、蒸馏水混合均匀，在30～50℃条件下，通过超声波或乳化机反应搅拌混合30～60分钟，静置，冷却至溶液清亮透明，得到前驱溶液；分别取得到的清亮透明的前驱溶液100份，与1～25份松油烯-4-醇，1～25份珊瑚姜油超声波混合均匀，得到高效抗耐药的珊瑚姜有效成分纳米剂型。
所述的将松油烯-4-醇、珊瑚姜油直接加入至清亮透明的前驱溶液中，室温下使用超声波分散混合形成透明溶液。
所述的其组分按重量份数计，所述的油酸40～50份，硬脂酸0～1份，聚乙二醇10～40份，丙二醇0～15份，乙二醇0～15份，无水乙醇0～10份，蒸馏水0～10份。
所述的其组分按重量份数计，所述的油酸45～50份，硬脂酸0.5～1份，聚乙二醇35～40份，丙二醇10～15份，乙二醇10～15份，无水乙醇2～10份，蒸馏水1～10份。
所述的其组分按重量份数计，所述的油酸50份，硬脂酸1份，聚乙二醇10份，丙二醇15份，乙二醇15份，无水乙醇5份，蒸馏水4份。
本发明的有益效果：
功能性成分纳米化是改善其水溶性，提高分散率及生物利用率的一种有效途径。相对微米材料，纳米材料体积小、流动性好，穿透作用更强，细胞摄取率也更高。
纳米化的通常方法有制备纳米粒子、纳米胶束、纳米脂质体、纳米自组装体、纳米乳液、纳米微乳液等。为了改善药物从皮肤或其它适用部位向病变部位的移动，开发纳米乳液、纳米微乳液型的药物制剂是普遍使用的方法。已知的普遍办法是加入至少一种乳化剂以帮助药物增溶在油中、水中或油水混合液中，形成乳剂、微乳剂使用。这种方法形成的乳剂属于热力学不稳定的非均相体系，常常会体系和外界条件变化导致分层、絮凝等；这种方法形成的微乳剂虽然可形成热力学稳定体系，但乳化剂含量需达到15％～30％，因此这类制剂的最大缺陷是不得不使用大量的乳化剂，在使用过程中存在微毒的问题，同时这些乳化剂是附加到制剂中的物质，不管是从制造成本，还是身体健康来看，是人们所不需要的。
综上所述，目前需要一种没有乳化剂缺点的液体制剂，能够改进制剂在皮肤上的铺展性和相溶性，给使用者带来不油腻、不刺激的感觉。本发明将珊瑚姜有效成分珊瑚姜油及有效成分松油烯-4-醇运用成熟的纳米载体技术对脂溶性药物进行剂型改造，以提高药物溶解度及生物利用度。采用本发明方法制备的微乳剂，不但可达到增溶、分散、稳定的目的，还解决了制剂在皮肤上的铺展、吸收问题，获得了制剂在病变部位中的浓度得以持续的效果。
本发明将珊瑚姜有效成分珊瑚姜油及有效成分松油烯-4-醇运用成熟的纳米载体技术对脂溶性药物进行剂型改造，以提高药物溶解度及生物利用度。该发明方法不仅能解决珊瑚姜有效成分难溶于水的问题，还可以延长药物作用时间，靶向输送至组织或器官，增加药物对生物膜的透过性，减少给药剂量及药物的副作用，可解除生物屏障对药物作用的阻碍，且载体及其分解产物易被清除。
本发明将松油烯-4-醇，珊瑚姜油直接加入至清亮透明的前驱溶液中，室温下形成透明溶液使用，使抗耐药的珊瑚姜有效成分最大程度保留。
本发明提供的的制备方法简单，在室温条件下将松油烯-4-醇，珊瑚姜油直接加入至清亮透明的前驱溶液中得到透明溶液使用，不会因高温产生对珊瑚姜有效成分的破坏，最大程度保留起有效成分。
附图说明
图1为珊瑚姜有效成分A纳米制剂对受试细菌的时间杀菌曲线a-g分别为珊瑚姜有效成分A纳米制剂对受试菌株S.aureus ATCC 25923、E.coli ATCC 25922、S.aureus SS081、E.coli SS074、S.epidermidis SS012、P.aeruginosa SS069、K.pneumoniae SS004的时间杀菌曲线；
图2为珊瑚姜有效成分B纳米制剂对受试细菌的时间杀菌曲线a-g分别为珊瑚姜有效成分B纳米制剂对受试菌株S.aureus ATCC 25923、E.coli ATCC 25922、S.aureus SS081、E.coli SS074、S.epidermidis SS012、P.aeruginosa SS069、K.pneumoniae SS004的时间杀菌曲线；
图3为流式细胞术检测活菌细胞，其中图a表示在FSC-SSC双参数图中设门圈定拟进行分析的密集的细菌群；图b表示FITC和PI对数荧光散点；图c表示散点图中各象限的细胞比例，UL为图b的左上象限，代表坏死细胞(FITC-/PI+)，UR为图b的右上象限，代表晚期凋亡细胞(FITC+/PI+)，LL为图b的左下象限，代表活细胞(FITC-/PI-)，LR为图b的右下象限，代表早期凋亡细胞(FITC+/PI-)；
图4为流式细胞术检测死亡菌细胞，图a表示在FSC-SSC双参数图中设门圈定拟进行分析的密集的细菌群；图b表示FITC和PI对数荧光散点；图c表示散点图中各象限的细胞比例，UL为图b的左上象限，代表坏死细胞(FITC-/PI+)，UR为图b的右上象限，代表晚期凋亡细胞(FITC+/PI+)，LL为图b的左下象限，代表活细胞(FITC-/PI-)，LR为图b的右下象限，代表早期凋亡细胞(FITC+/PI-)；
图5为流式细胞术检测药物作用金黄色葡萄球菌ATCC 25923的散点图，图a、b分别为流式细胞术测定珊瑚姜有效成分A纳米制剂、对照组珊瑚姜有效成分A作用于金黄色葡萄球菌ATCC 25923的结果；图c、d分别为流式细胞术测定珊瑚姜有效成分B纳米制剂、对照组珊瑚姜有效成分B作用于金黄色葡萄球菌ATCC 25923的结果；
图6为流式细胞术检测药物作用大肠埃希菌ATCC 25922的散点图，图a、b分别为流式细胞术测定珊瑚姜有效成分A纳米制剂、对照组珊瑚姜有效成分A作用于大肠埃希菌ATCC25922的结果；图c、d分别为流式细胞术测定珊瑚姜有效成分B纳米制剂、对照组珊瑚姜有效成分B作用于大肠埃希菌ATCC 25922的结果；e为阳性对照，f为阴性对照；
图7为流式细胞术检测药物作用金黄色葡萄球菌耐药株SS081的散点图，图a、b分别为流式细胞术测定珊瑚姜有效成分A纳米制剂、对照组珊瑚姜有效成分A作用于金黄色葡萄球菌耐药株SS081的结果；图c、d分别为流式细胞术测定珊瑚姜有效成分B纳米制剂、对照组珊瑚姜有效成分B作用于金黄色葡萄球菌耐药株SS081的结果；e为阳性对照，f为阴性对照；
图8为流式细胞术检测药物作用大肠埃希菌耐药株SS074的散点图，图a、b分别为流式细胞术测定珊瑚姜有效成分A纳米制剂、对照组珊瑚姜有效成分A作用于大肠埃希菌耐药株SS074的结果；图c、d分别为流式细胞术测定珊瑚姜有效成分B纳米制剂、对照组珊瑚姜有效成分B作用于大肠埃希菌耐药株SS074的结果；e为阳性对照，f为阴性对照；
图9为流式细胞术检测药物作用表皮葡萄球菌耐药株SS012的散点图，图a、b分别为流式细胞术测定珊瑚姜有效成分A纳米制剂、对照组珊瑚姜有效成分A作用于表皮葡萄球菌耐药株SS012的结果；图c、d分别为流式细胞术测定珊瑚姜有效成分B纳米制剂、对照组珊瑚姜有效成分B作用于表皮葡萄球菌耐药株SS012的结果；e为阳性对照，f为阴性对照；
图10为流式细胞术检测药物作用铜绿假单胞菌耐药株SS069的散点图，图a、b分别为流式细胞术测定珊瑚姜有效成分A纳米制剂、对照组珊瑚姜有效成分A作用于铜绿假单胞菌耐药株SS069的结果；图c、d分别为流式细胞术测定珊瑚姜有效成分B纳米制剂、对照组珊瑚姜有效成分B作用于铜绿假单胞菌耐药株SS069的结果；e为阳性对照，f为阴性对照；
图11为流式细胞术检测药物作用肺炎克雷伯菌耐药株SS004的散点图，图a、b分别为流式细胞术测定珊瑚姜有效成分A纳米制剂、对照组珊瑚姜有效成分A作用于肺炎克雷伯菌耐药株SS004的结果；图c、d分别为流式细胞术测定珊瑚姜有效成分B纳米制剂、对照组珊瑚姜有效成分B作用于肺炎克雷伯菌耐药株SS004的结果；e为阳性对照，f为阴性对照。
具体实施方式
实施例1：取油酸45kg，，聚乙二醇40kg，无水乙醇10kg，蒸馏水4.5kg，在超声波或乳化机加热搅拌条件下，缓慢加入硬脂酸0.5kg，保持30～50℃，搅拌硬脂酸完全溶解，反应搅拌混合30～60分钟，静置，冷却至室温，得到清亮透明的前驱溶液，备用。取40kg上述前驱溶液，加入松油烯-4-醇10kg，室温下超声波搅拌均匀，得到一种高效抗耐药的珊瑚姜有效成分纳米剂型；取40kg上述前驱溶液，加入珊瑚姜油10kg，室温下超声波搅拌均匀，得到另一种高效抗耐药的珊瑚姜有效成分纳米剂型。
实施例2：取油酸50kg，，聚乙二醇40kg，无水乙醇5kg，蒸馏水4.5kg，在超声波或乳化机加热搅拌条件下，缓慢加入硬脂酸0.5kg，保持30～50℃，搅拌硬脂酸完全溶解，反应搅拌混合30～60分钟，静置，冷却至室温，得到清亮透明的前驱溶液，备用。取40kg上述前驱溶液，加入松油烯-4-醇10kg，室温下超声波搅拌均匀，得到一种高效抗耐药的珊瑚姜有效成分纳米剂型；取40kg上述前驱溶液，加入珊瑚姜油10kg，室温下超声波搅拌均匀，得到另一种高效抗耐药的珊瑚姜有效成分纳米剂型。
实施例3：取油酸45kg，，聚乙二醇10kg，丙二醇15kg，乙二醇15kg，无水乙醇10kg，蒸馏水4.5kg，在超声波或乳化机加热搅拌条件下，缓慢加入硬脂酸0.5kg，保持30～50℃，搅拌硬脂酸完全溶解，反应搅拌混合30～60分钟，静置，冷却至室温，得到清亮透明的前驱溶液，备用。取40kg上述前驱溶液，加入松油烯-4-醇10kg，室温下超声波搅拌均匀，得到一种高效抗耐药的珊瑚姜有效成分纳米剂型；取40kg上述前驱溶液，加入珊瑚姜油10kg，室温下超声波搅拌均匀，得到另一种高效抗耐药的珊瑚姜有效成分纳米剂型。
实施例4：取油酸50kg，，聚乙二醇10kg，丙二醇15kg，乙二醇15kg，无水乙醇5kg，蒸馏水4.5kg，在超声波或乳化机加热搅拌条件下，缓慢加入硬脂酸0.5kg，保持30～50℃，搅拌硬脂酸完全溶解，反应搅拌混合30～60分钟，静置，冷却至室温，得到清亮透明的前驱溶液，备用。取40kg上述前驱溶液，加入松油烯-4-醇10kg，室温下超声波搅拌均匀，得到一种高效抗耐药的珊瑚姜有效成分纳米剂型；取40kg上述前驱溶液，加入珊瑚姜油10kg，室温下超声波搅拌均匀，得到另一种高效抗耐药的珊瑚姜有效成分纳米剂型。
为证明珊瑚姜有效成分纳米制剂用本发明方法及工艺制取药物在抗细菌、杀螨虫、抗炎、抗病毒等药效方面维持不变，申请人对本发明的两种高效抗耐药菌的珊瑚姜有效成分纳米剂型及未纳米剂型进行了抗菌作用研究对比，以临床常见耐药菌为实验对象，研究珊瑚姜有效成分珊瑚姜油及有效成分松油烯-4-醇纳米制剂的抗菌作用，对照组为未纳米化的珊瑚姜有效成分珊瑚姜油及有效成分松油烯-4-醇，比较两者抗菌效果。并对药物联合的抗菌作用进行分析，探讨珊瑚姜有效成分纳米制剂对常见耐药菌的抗菌效应，为顽固性耐药菌感染的控制提供新途径，并为开发高效抗菌化合物提供一定的实验参数，其抗菌比对结果如下：
Kirby-Bauey纸片扩散法的药物敏感性检测
Kirby-Bauey纸片扩散法结果见表1，药物对受试细菌的抑菌圈直径以表示，根据抑菌圈直径，由中药药理学抑菌圈结果判定标准可知，受试细菌对珊瑚姜有效成分纳米制剂敏感，且不同测试药物对受试细菌的抑制作用差异有统计学意义(F处理＝35.65，P＜0.05)，药物对不同种类细菌的抑菌效果差异无统计学意义(F区组＝1.67，P>0.05)。其中，珊瑚姜有效成分A纳米制剂对受试细菌的抑菌圈直径为14.64～19.80mm、珊瑚姜有效成分B纳米制剂对受试细菌的抑菌圈直径为18.00～21.71mm，对照组珊瑚姜有效成分A的抑菌圈直径为13.37～16.34mm，珊瑚姜有效成分B对受试细菌的抑菌圈直径为15.00～18.20mm。
质控组氨苄西林药敏纸片对大肠埃希菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 25923细菌的抑菌圈直径分别为20.07±1.26mm、18.25±1.46mm，是CLSI M100-S22列出的质控实验可接受的抑菌圈直径质控范围。每次实验以质控菌株为参照菌株，只有当其抑菌圈直径界于质控范围时，方认为实验操作准确可靠。同时实验菌株生长良好，则可认为实验成功，结果可接受。
表1珊瑚姜有效成分纳米制剂对受试细菌的抑菌圈直径(mm,)
单用药物最小抑菌浓度(MIC)的测定
根据微量肉汤稀释法结果见表2，珊瑚姜有效成分珊瑚姜油纳米制剂、珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇纳米制剂对受试菌株的MIC值范围在0.39％v/v-1.56％v/v，对照组未纳米组(珊瑚姜有效成分A、珊瑚姜有效成分B)对实验菌株的MIC值范围在0.78％v/v-1.56％v/v。其中，质控组多西环素对大肠埃希菌ATCC 25922细菌的MIC值为1.25μg/mL，是CLSIM100-S22列出的质控实验可接受的MIC质控范围。每次实验以此株菌为参照菌株，只有当其MIC值界于质控范围时，方认为实验操作准确可靠。同时实验菌株生长良好，则可认为实验成功，结果可接受。
表2珊瑚姜有效成分纳米制剂对受试细菌的MIC值(％,v/v)
时间-杀菌曲线
用时间-杀菌曲线法可观察珊瑚姜有效成分纳米制剂杀菌的动态过程及不同浓度的抗菌过程。珊瑚姜有效成分珊瑚姜油纳米制剂对受试细菌的24h时间-杀菌曲线如图1-1所示，随着药物浓度的增加杀菌曲线斜率的负值逐渐加大，说明珊瑚姜有效成分珊瑚姜油纳米制剂的抑菌程度随着浓度的增加而增强，提示其为浓度依赖性抗菌药物。由杀菌效应的判定标准判断，当珊瑚姜有效成分珊瑚姜油纳米制剂浓度为各菌株对应的1/2MIC值时，对受试细菌均无杀菌效应(菌落数的对数值log10CFU/mL<初始接种菌浓度的菌落数3×log10CFU/mL)；当其浓度为0.78％v/v时，表现出对S.aureus ATCC 25923、E.coli ATCC25922、E.coli SS074、S.epidermidis SS012的杀菌效应(菌落数的对数值log10CFU/mL≧初始接种菌浓度的菌落数3×log10CFU/mL)；当其浓度为1.56％v/v时，表现出对S.aureusSS081、P.aeruginosa SS069的杀菌效应；当其浓度为1.56％v/v时，表现出对K.pneumoniaeSS004的杀菌效应。
珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇纳米制剂对受试细菌的24h时间-杀菌曲线如图1-2所示，随着药物浓度的增加杀菌曲线斜率的负值逐渐加大，说明珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇纳米制剂也显示了相同的浓度依赖的特性，当珊瑚姜有效成分珊瑚姜油纳米制剂浓度为各菌株对应的1/2MIC值时，对受试细菌均无杀菌效应；当其浓度为0.39％v/v时，表现出对S.aureus ATCC 25923、E.coli ATCC 25922、E.coli SS074、S.epidermidis SS012的杀菌效应；当其浓度为0.78％v/v时，表现出对S.aureus SS081的杀菌效应；当其浓度为1.58％v/v时，表现出对P.aeruginosa SS069的杀菌效应；当其浓度为3.13％v/v时，表现出对K.pneumoniae SS004的杀菌效应。
棋盘式微量稀释法测定FIC值
所有受试菌种在37℃、培养18h后生长良好，在培养板的第8行1-9孔和第10列为单独药敏区域，每种测试药物对每种受试细菌的MIC值与微量稀释法结果中单独应用时各药的MIC值一致，确保了实验的一致性及可靠性。
珊瑚姜有效成分珊瑚姜油纳米制剂与有效成分松油烯-4-醇纳米制剂联合前后的抗菌效果见表3，两者联合后以协同及相加作用为主。珊瑚姜有效成分纳米制剂对临床耐药病原菌联合用药时各药物的MIC值比单用有显著降低，具有统计学差异(t＝3.41,P<0.05)。对照组珊瑚姜有效成分珊瑚姜油与珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇联合前后的抗菌效果见表4，两者联合后以无关及相加作用为主，联用时各药物的MIC值与单用时MIC值差异有统计学意义(t＝5.07,P＜0.05)。
表3珊瑚姜有效成分A纳米制剂与珊瑚姜有效成分B纳米制剂联合抗菌效果(18h)
表4珊瑚姜有效成分A与珊瑚姜有效成分B联合抗菌效果(18h)
流式细胞术对细胞凋亡的检测
流式细胞术检测对数生长期的金黄色葡萄球菌ATCC 25923活菌悬液(不加入药物，为阴性对照)的结果见图3所示。其中，图a表示在FSC-SSC双参数图中设门圈定拟进行分析的密集的细菌群，菌细胞数＝106个；图b表示FITC和PI对数荧光散点，一群菌细胞(99.61％)集中在FITC阴性/PI阴性区域，即为活细胞；图c表示散点图中各象限的细胞比例。FITC/PI双染法检测金黄色葡萄球菌ATCC 25923的活菌悬液细胞，各比例分别为活细胞(99.61％)、坏死细胞(0.23％)、晚期凋亡细胞(0.16％)、早期凋亡细胞(0.00％)。
流式细胞术检测金黄色葡萄球菌ATCC 25923死亡菌悬液(经高压处理，为阳性对照)的结果见图4所示。其中，图-a表示在FSC-SSC双参数图中设门圈定拟进行分析的密集的细菌群，菌细胞数＝106个；图b表示FITC和PI对数荧光散点，一群大小一致的菌细胞(99.63％)集中在FITC阴性/PI阳性区域，即为坏死细胞；图c表示散点图中各象限的细胞比例可知，FITC/PI双染法检测金黄色葡萄球菌ATCC 25923的活菌悬液细胞，各比例分别为坏死细胞(99.63％)、晚期凋亡细胞(0.37％)、早期凋亡细胞(0.00％)、活细胞(0.00％)。
流式细胞术检测珊瑚姜有效成分珊瑚姜油纳米制剂、珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇纳米制剂分别作用对数生长期的金黄色葡萄球菌ATCC 25923细胞凋亡的结果如图5所示，并以珊瑚姜有效成分珊瑚姜油、珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇为对照组，4个散点图中各象限的坏死细胞、晚期凋亡细胞、早期凋亡细胞、活细胞的细胞比例见表5所示。
表5实验药物处理后的金黄色葡萄球菌ATCC 25923的菌细胞比率(％)
由散点图可知，在测试药物作用3小时后，使金黄色葡萄球菌ATCC 25923菌细胞均产生凋亡现象，以珊瑚姜有效成分珊瑚姜油纳米制剂使菌细胞进入晚期凋亡较明显，比例为57.79％，其对照组珊瑚姜有效成分珊瑚姜油使菌细胞的晚期凋亡比例为19.44％，珊瑚姜有效成分珊瑚姜油纳米制剂使菌细胞进入晚期凋亡率增加38.35％。在珊瑚姜有效成分珊瑚姜油纳米制剂作用下的活细胞比例为11.86％，与对照组珊瑚姜有效成分珊瑚姜油作用下的活细胞比例48.20％相比，其活细胞比例降低36.34％。珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇纳米制剂作用下的活细胞比例为7.31％，与对照组珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇作用下的活细胞比例37.96％相比，活细胞比例降低30.65％。
流式细胞术检测测试药物分别作用对数生长期的大肠埃希菌ATCC 25922的细胞凋亡结果(如图6所示)，各散点图中各象限的的细胞比例见表6所示。
表6实验药物处理后的大肠埃希菌ATCC 25922的菌细胞比率(％)
由散点图可知，测试药物作用3小时后，药物可使大肠埃希菌ATCC 25922菌细胞产生凋亡现象，其中珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇纳米制剂作用细菌后坏死细胞较明显，比例为74.87％，其对照组珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇使菌细胞的坏死细胞比例为10.35％，珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇纳米制剂使菌细胞进入坏死率增加增高64.52％。在珊瑚姜有效成分珊瑚姜油纳米制剂作用下的活细胞比例为19.13％，与对照组珊瑚姜有效成分珊瑚姜油作用下的活细胞比例60.41％相比，其活细胞比例降低41.28％。珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇纳米制剂作用下的活细胞比例为9.25％，与对照组珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇作用下的活细胞比例24.26％相比，活细胞比例降低15.01％。
流式细胞术检测测试药物分别作用对数生长期的金黄色葡萄球菌耐药株SS081的细胞凋亡结果(如图7所示)，各散点图中各象限的细胞比例见表7所示。
表7实验药物处理后的金黄色葡萄球菌耐药株SS081的菌细胞比率(％)
由散点图可知，在测试药物作用3小时后，使金黄色葡萄球菌耐药株SS081菌细胞均产生凋亡现象，以珊瑚姜有效成分珊瑚姜油纳米制剂使菌细胞进入晚期凋亡较明显，比例为51.19％，其对照组珊瑚姜有效成分珊瑚姜油使菌细胞的晚期凋亡比例为27.12％，珊瑚姜有效成分珊瑚姜油纳米制剂使菌细胞进入晚期凋亡率增加24.07％。在珊瑚姜有效成分珊瑚姜油纳米制剂作用下的活细胞比例为18.23％，与对照组珊瑚姜有效成分珊瑚姜油作用下的活细胞比例40.87％相比，其活细胞比例降低22.64％。珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇纳米制剂作用下的活细胞比例为8.24％，与对照组珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇作用下的活细胞比例19.14％相比，活细胞比例降低10.90％。
流式细胞术检测测试药物分别作用对数生长期的大肠埃希菌耐药株SS074的细胞凋亡结果(见图8)，药物处理后的菌细胞比率见表8。
表8实验药物处理后的大肠埃希菌耐药株SS074的菌细胞比率(％)
由散点图可知，测试药物作用3小时后，药物可使大肠埃希菌耐药株SS074菌细胞产生凋亡现象，其中珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇纳米制剂作用细菌后坏死细胞较明显，比例为55.28％，其对照组珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇使菌细胞的坏死细胞比例为13.10％，珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇纳米制剂使菌细胞进入坏死率增加增高42.18％。在珊瑚姜有效成分珊瑚姜油纳米制剂作用下的活细胞比例为22.80％，与对照组珊瑚姜有效成分珊瑚姜油作用下的活细胞比例55.28％相比，其活细胞比例降低32.48％。珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇纳米制剂作用下的活细胞比例为13.27％，与对照组珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇作用下的活细胞比例27.14％相比，活细胞比例降低13.87％。
流式细胞术检测测试药物分别作用对数生长期的表皮葡萄球菌耐药株SS012的细胞凋亡结果(见图9)，药物处理后的菌细胞比率见表9所示。
表9实验药物处理后的表皮葡萄球菌耐药株SS012的菌细胞比率(％)
由散点图可知，在测试药物作用3小时后，使表皮葡萄球菌耐药株SS012菌细胞均产生凋亡现象，以珊瑚姜有效成分珊瑚姜油纳米制剂使菌细胞进入晚期凋亡较明显，比例为51.72％，其对照组珊瑚姜有效成分珊瑚姜油使菌细胞的晚期凋亡比例为29.85％，珊瑚姜有效成分珊瑚姜油纳米制剂使菌细胞进入晚期凋亡率增加21.87％。在珊瑚姜有效成分珊瑚姜油纳米制剂作用下的活细胞比例为9.34％，与对照组珊瑚姜有效成分珊瑚姜油作用下的活细胞比例41.09％相比，其活细胞比例降低31.75％。珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇纳米制剂作用下的活细胞比例为7.64％，与对照组珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇作用下的活细胞比例23.91％相比，活细胞比例降低16.72％。
流式细胞术检测测试药物分别作用对数生长期的铜绿假单胞菌耐药株SS069的细胞凋亡结果(见图10)，药物处理后的菌细胞比率见表10所示。
表10实验药物处理后的铜绿假单胞菌耐药株SS069的菌细胞比率(％)
由散点图可知，测试药物作用3小时后，药物可使铜绿假单胞菌耐药株SS069菌细胞产生凋亡现象，其中珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇纳米制剂作用细菌后坏死细胞较明显，比例为55.63％，其对照组珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇使菌细胞的坏死细胞比例为23.25％，珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇纳米制剂使菌细胞进入坏死率增加增高32.38％。在珊瑚姜有效成分珊瑚姜油纳米制剂作用下的活细胞比例为22.97％，与对照组珊瑚姜有效成分珊瑚姜油作用下的活细胞比例57.36％相比，其活细胞比例降低34.39％。珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇纳米制剂作用下的活细胞比例为13.10％，与对照组珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇作用下的活细胞比例38.45％相比，活细胞比例降低25.35％。
流式细胞术检测测试药物分别作用对数生长期的肺炎克雷伯菌耐药株SS004的细胞凋亡结果(见图11)，药物处理后的菌细胞比率见表11所示。
表11实验药物处理后的肺炎克雷伯菌耐药株SS004菌细胞比率(％)
由散点图可知，测试药物作用3小时后，药物可使肺炎克雷伯菌耐药株SS004菌细胞产生凋亡现象，其中珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇纳米制剂作用细菌后坏死细胞较明显，比例为71.27％，其对照组珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇使菌细胞的坏死细胞比例为39.41％，珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇纳米制剂使菌细胞进入坏死率增加增高31.86％。在珊瑚姜有效成分珊瑚姜油纳米制剂作用下的活细胞比例为27.46％，与对照组珊瑚姜有效成分珊瑚姜油作用下的活细胞比例62.19％相比，其活细胞比例降低34.73％。珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇纳米制剂作用下的活细胞比例为13.77％，与对照组珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇作用下的活细胞比例37.55％相比，活细胞比例降低23.78％。
统计学分析
综合3.5.5.1-3.5.5.9实验数据分析可知，药物作用于细菌3小时后，菌细胞出现了部分凋亡及坏死现象。将测试药物对不同类型菌细胞作用结果以表示，见表12所示。不同测试药物对菌细胞的影响无统计学意义(F处理＝1.48，P>0.05)，药物对产生的晚期凋亡细胞、早期凋亡细胞、坏死细胞及活细胞的差异有统计学意义(F区组＝8.067，P＜0.05)。其中，珊瑚姜有效成分珊瑚姜油纳米制剂作用于不同细菌菌细胞的活细胞比例为18.83％±0.06，对照组珊瑚姜有效成分珊瑚姜油作用菌细胞的活细胞比例为52.20％±0.09；珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇纳米制剂作用菌细胞的活细胞百分率为10.37％±0.03，珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇作用菌细胞的活细胞百分率为29.77％±0.08。实验组活细胞比例较对照组低，可提示珊瑚姜有效成分珊瑚姜油及松油烯-4-醇纳米制剂的抑菌效果较其对照组好。另外，由统计可知，珊瑚姜有效成分珊瑚姜油纳米制剂作用于受试细菌后菌细胞以晚期凋亡为主(35.79％±0.14)，珊瑚姜有效成分松油烯-4-醇纳米制剂作用于受试细菌后菌细胞以坏死为主(46.40％±0.24)。
表12药物处理后的受试菌株的菌细胞比率(％)
结论：珊瑚姜有效成分珊瑚姜油及松油烯-4-醇纳米制剂对常见院感耐药细菌具有一定的抑制作用，均为浓度依赖性抗菌药物，当两者联用时抗菌效果增强，表现为相加以协同作用为主；并且，珊瑚姜有效成分珊瑚姜油与松油烯-4-醇纳米制剂可使受试菌细胞快速进入晚期凋亡及坏死阶段。珊瑚姜有效成分纳米制剂作为天然消毒液极具前景。本研究为开发新型抗菌化合物提供了一定的实验参数。

Claims (5)

1.一种高效抗耐药菌的珊瑚姜有效成分纳米剂型的制备方法，其特征在于：先将油酸、硬脂酸、聚乙二醇、丙二醇、乙二醇、无水乙醇、蒸馏水混合均匀，在30～50℃条件下，通过超声波或乳化机反应搅拌混合30～60分钟，静置，冷却至溶液清亮透明，得到前驱溶液；分别取得到的清亮透明的前驱溶液100份，与1～25份松油烯-4-醇，1～25份珊瑚姜油超声波混合均匀，得到高效抗耐药的珊瑚姜有效成分纳米剂型。
2.根据权利要求1所述的一种高效抗耐药菌的珊瑚姜有效成分纳米剂型的制备方法，其特征在于：将松油烯-4-醇、珊瑚姜油直接加入至清亮透明的前驱溶液中，室温下使用超声波分散混合形成透明溶液。
3.根据权利要求1所述的一种高效抗耐药菌的珊瑚姜有效成分纳米剂型的制备方法，其特征在于：其组分按重量份数计，所述的油酸40～50份，硬脂酸0～1份，聚乙二醇10～40份，丙二醇0～15份，乙二醇0～15份，无水乙醇0～10份，蒸馏水0～10份。
4.根据权利要求3所述的一种高效抗耐药菌的珊瑚姜有效成分纳米剂型的制备方法，其特征在于：其组分按重量份数计，所述的油酸45～50份，硬脂酸0.5～1份，聚乙二醇35～40份，丙二醇10～15份，乙二醇10～15份，无水乙醇2～10份，蒸馏水1～10份。
5.根据权利要求3所述的一种高效抗耐药菌的珊瑚姜有效成分纳米剂型的制备方法，其特征在于：其组分按重量份数计，所述的油酸50份，硬脂酸1份，聚乙二醇10份，丙二醇15份，乙二醇15份，无水乙醇5份，蒸馏水4份。
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