CN106581042B

CN106581042B - 聚乙二醇青蒿琥酯在制备抗肝脏病变药物中的应用

Info

Publication number: CN106581042B
Application number: CN201611147844.4A
Authority: CN
Inventors: 黄照昌; 宋立明; 刘国光; 朱泽; 曾涛; 李鹏辉
Original assignee: KPC Pharmaceuticals Inc
Current assignee: KPC Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2016-12-13
Filing date: 2016-12-13
Publication date: 2019-10-18
Anticipated expiration: 2036-12-13
Also published as: CN106581042A

Abstract

本发明提供了式(I)所示的聚乙二醇青蒿琥酯在制备抗肝脏病变药物中的应用，其可明显降低四氯化碳致肝纤维化大鼠的肝纤维化状况、肝功能异常，降低血清纤维化标志物透明质酸酶(HA)、层粘连蛋白(LN)、III型前胶原(PC‑III)的量，降低血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)的量，减少肝组织丙二醛(MDA)和羟脯氨酸(HyP)含量，可有效阻止肝纤维化的发展并促进肝纤维化的逆转，且在同等剂量下，与青蒿琥酯相比具有显著差异。另外，聚乙二醇青蒿琥酯的水溶性较好，生物利用度高，半衰期长，能够减少给药次数。

Description

聚乙二醇青蒿琥酯在制备抗肝脏病变药物中的应用

技术领域

本发明涉及青蒿琥酯衍生物技术领域，尤其涉及一种聚乙二醇青蒿琥酯在制备抗肝脏病变药物中的应用。

背景技术

肝纤维化(hepatic fibrosis)是肝硬化的病理学基础，多种病因(如病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性肝病、药物及化学因素损伤等)引起肝脏损害和炎症，导致肝纤维化，最终发展为肝硬化。肝纤维化是细胞外基质过度沉积的结果，也是进一步向肝硬化、肝癌发展的主要中间环节。

肝硬化有很高的致病率和致死率，据统计，国内因肝硬化住院的病人占同期住院人数的0.36％～0.64％。肝脏慢性病变如寄生虫感染、病毒感染、免疫源性肝炎、遗传性金属超负荷、毒性作用等均可引起肝纤维化，有25％～40％肝纤维化病人可进一步发展为肝硬化，部分进展性肝纤维化可最终转变为肝癌，故预防肝纤维化可能减少肝癌的发病率。肝纤维化发展隐匿，当慢性肝病发展到肝硬化甚至腹水时，各种治疗难以奏效。我国是乙型病毒性肝炎高发区，肝炎后肝硬化发病率高。随着生活条件的改善，酒精性肝硬化的发病率也逐年增高。已有证据表明肝纤维化及早期肝硬化是可逆的，阻断或逆转肝纤维化是治疗慢性肝病的一个重要目标，但目前尚无批准的抗肝纤维化的化学或生物制剂进入临床应用。

聚乙二醇青蒿琥酯为青蒿琥酯的聚乙二醇衍生物，是将青蒿琥酯和含有游离氨基的多价聚乙二醇修饰剂置于惰性溶剂中，在偶联剂和有机碱催化作用下，青蒿琥酯的羧基和多价聚乙二醇修饰剂的氨基或羟基进行偶联反应而得到。研究表明，聚乙二醇青蒿琥酯在抗疟疾方面与青蒿琥酯相当，且具有更好的水溶性，半衰期也较青蒿琥酯延长了10倍左右。但是，目前尚未见聚乙二醇青蒿琥酯在抗肝纤维化方面的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种聚乙二醇青蒿琥酯在制备抗肝脏病变药物中的应用，聚乙二醇青蒿琥酯可有效阻止肝纤维化的发展并促进肝纤维化的逆转。

本发明提供了式(I)所示的聚乙二醇青蒿琥酯在制备抗肝脏病变药物中的应用：

式(I)中，POLY为聚乙二醇残基，数均分子量为200～100000Da；

X选自-NH-、-O-或甲氧基；

Y选自含有双氨基和单羧基的氨基酸残基，所述氨基酸的羧基与X成酰胺键或酯键，向远端引出多氨基基团与青蒿琥酯的羧基成酰胺；

m和n独立地选自0、1或2；

r和s代表与Y通过酰胺键相连的青蒿琥酯的数量；并且：

当m和n均不为0时，r和s分别为n和m的2倍数，并且青蒿琥酯通过羧基与Y引出的多氨基成酰胺；

当m为0且n不为0或者m不为0且n为0时，r和s分别为n和m的2倍数，并且青蒿琥酯通过羧基与Y引出的多氨基成酰胺，m为0或n为0的一端的X为甲氧基；或

当m和n同时为0时，r和s均为1，青蒿琥酯通过羧基与X成酯或酰胺。

在一个实施例中，所述聚乙二醇青蒿琥酯具有式(I-a)结构：

式(I-a)中，POLY的数均分子量为10000～30000Da。

在另外一个实施例中，所述聚乙二醇青蒿琥酯具有式1结构：

式1结构中，PEG_20k代表数均分子量为20000的PEG。

在本发明中，所述肝脏病变选自肝纤维化、慢性肝炎、肝硬化或肝脏肿瘤。

聚乙二醇青蒿琥酯为青蒿琥酯的聚乙二醇衍生物，是将青蒿琥酯和含有游离氨基的多价聚乙二醇修饰剂置于惰性溶剂中，在偶联剂和有机碱催化作用下，青蒿琥酯的羧基和多价聚乙二醇修饰剂的氨基或羟基进行偶联反应而得到。本发明对所述据聚乙二醇青蒿琥酯的来源没有特殊限制，可以按照中国专利CN103450468B公开的方法制备。

与其他青蒿素类衍生物相比，式(I)所示的聚乙二醇青蒿琥酯聚乙二醇青蒿琥酯具有更好的水溶性和更长的半衰期。发明人研究发现，其可明显降低四氯化碳致肝纤维化大鼠的肝纤维化状况、肝功能异常，降低血清纤维化标志物透明质酸酶(HA)、层粘连蛋白(LN)、III型前胶原(PC-III)的量，降低血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)的量，减少肝组织丙二醛(MDA)和羟脯氨酸(HyP)含量，可有效阻止肝纤维化的发展并促进肝纤维化的逆转，且在同等剂量下，与青蒿琥酯相比具有显著差异。另外，聚乙二醇青蒿琥酯的水溶性较好，生物利用度高，半衰期长，能够减少给药次数。

式(I)所示的聚乙二醇青蒿琥酯可被制成药学上可接受的剂型。

具体实施方式

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的聚乙二醇青蒿琥酯在制备抗肝脏病变药物中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1聚乙二醇青蒿琥酯对大鼠肝纤维化的作用研究

1.试验材料

聚乙二醇青蒿琥酯，昆药集团药物研究院根据中国专利CN103450468B实施例1公开的方法自制，具有式1结构；青蒿琥酯，重庆华方武陵山制药有限公司；秋水仙碱片，昆药集团股份有限公司；透明质酸酶(HA)、层粘连蛋白(LN)、III型前胶原(PC-III)试剂盒，中生北控生物科技有限公司；血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、血清白蛋白(ALB)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、羟脯氨酸(HyP)试剂盒、HE染液，南京建成生物工程有限公司；四氯化碳(AR)，重庆川江化学试剂厂；精密电子天平，北京赛多利斯天平有限公司；TDL-5离心机，上海安亭科学仪器厂；722分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；恒温水浴箱，上海医疗器械七厂；光学显微镜和光学照相系统，日本OYLMPUS公司；倒置显微镜，美国Bio-Rad公司；SD大鼠，雌性，180～220g，昆药集团实验动物中心提供。

2.肝纤维化模型的建立

每只大鼠腹腔注射四氯化碳0.025ml(用花生油1：6稀释)，每周3次，共14周。

3.动物分组及给药

正常对照组：20只大鼠，腹腔注射生理盐水(0.15ml/只/次)，每周3次，共14周，于第8周结束后处死5只大鼠。

模型对照组：20只大鼠，腹腔注射四氯化碳0.025ml(用花生油1：6稀释)，每周3次，共14周，于第8周结束后处死5只大鼠。

聚乙二醇青蒿琥酯低剂量组：15只大鼠，腹腔注射四氯化碳0.025ml(用花生油1：6稀释)，每周3次，共14周，于第9周起注射1mg/kg聚乙二醇青蒿琥酯，每周3次，共6周。

青蒿琥酯低剂量组：15只大鼠，腹腔注射四氯化碳0.025ml(用花生油1：6稀释)，每周3次，共14周，于第9周起注射1mg/kg青蒿琥酯，每周3次，共6周。

聚乙二醇青蒿琥酯中剂量组：15只大鼠，腹腔注射四氯化碳0.025ml(用花生油1：6稀释)，每周3次，共14周，于第9周起注射5mg/kg聚乙二醇青蒿琥酯，每周3次，共6周。

青蒿琥酯中剂量组：15只大鼠，腹腔注射四氯化碳0.025ml(用花生油1：6稀释)，每周3次，共14周，于第9周起注射5mg/kg青蒿琥酯，每周3次，共6周。

聚乙二醇青蒿琥酯高剂量组：15只大鼠，腹腔注射四氯化碳0.025ml(用花生油1：6稀释)，每周3次，共14周，于第9周起注射10mg/kg聚乙二醇青蒿琥酯，每周3次，共6周。

青蒿琥酯高剂量组：15只大鼠，腹腔注射四氯化碳0.025ml(用花生油1：6稀释)，每周3次，共14周，于第9周起注射10mg/kg青蒿琥酯，每周3次，共6周。

秋水仙碱组：15只大鼠，腹腔注射四氯化碳0.025ml(用花生油1：6稀释)，每周3次，共14周，于第9周起按10mg/kg体重灌胃给予秋水仙碱，每周3次，共6周。

3.实验方法

动物实验结束后，试管编号，采用摘眼球采血法最大量取血，并置于未加抗凝剂的普通干净玻璃试管中。静置使其充分凝固，离心分离血清，置于-20℃保存待检；剖开大鼠腹腔暴露肝脏，留取肝脏左叶，取部分肝组织于4％甲醛固定，其余肺组织置于-70℃冷冻保存。

3.1肝脏病理学检查

HE染色，光镜下观察肝组织病理学改变，肝纤维化病理学分级参照2002年上海会议上由中华医学会肝脏病学分会、中华医学会传染病与寄生虫病学分会联合修订的慢性肝炎分级分期标准：

0级：无胶原纤维增生；

1级：汇管区纤维化扩大，限局窦周及小叶内纤维化；

2级：汇管区周围纤维化，纤维间隔形成，小叶结构保留；

3级：纤维间隔伴小叶结构紊乱，无肝硬化

4级：早期肝硬化。

3.2肝功能指标检测

血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、血清白蛋白(ALB)，参照测定试剂盒说明书进行测定。

3.3肝纤维化指标检测

透明质酸酶(HA)、层粘连蛋白(LN)、III型前胶原(PC-III)是纤维化标志物，其含量的高低可以反映出纤维化的程度。其检测参照测定试剂盒说明书进行测定。

3.4丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、羟脯氨酸(HyP)检测

氧自由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，形成脂质过氧化物，主要是丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)，其含量的高低可以反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤程度。HyP主要存在于胶原，HyP含量的测定可以间接反映胶原含量，因此，测定HyP的含量常被用于肝纤维化的研究。

新鲜肝组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、羟脯氨酸(HyP)测定，参照测定试剂盒说明书进行测定。

3.5数据统计与分析

数据以表示,采用SPSS16.0软件进行方差分析。

4.结果与结论

4.1肝脏病理学检查

正常对照组肝细胞呈单核，肝小叶网状纤维结构完整，分界清楚，无肝细胞变性坏死，无炎性细胞浸润及纤维组织增生。模型组大鼠肝小叶结构异常，肝组织肿胀、普遍空泡性变性，可见明显的点状和灶状坏死，炎性细胞浸润，小叶周围纤维组织增生明显。提示肝纤维化模型造模成功。聚乙二醇青蒿琥酯中高剂量组、青蒿琥酯高剂量组及拉米夫定对照组与模型组相比，肝组织结构完整，汇管区轻度炎症，肝脏纤维化程度轻，肝纤维化情况明显好转。其试验结果见表1。

表1聚乙二醇青蒿琥酯和青蒿琥酯对肝纤维化病理学的影响

注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组相比，P<0.05，

表1结果表明：聚乙二醇青蒿琥酯中剂量组、青蒿琥酯高剂量组及秋水仙碱对照组与模型组相比，肝组织结构完整，汇管区轻度炎症，肝脏纤维化程度轻，肝纤维化情况明显好转；而聚乙二醇青蒿琥酯高剂量组与模型组相比，肝组织结构完整，汇管区轻度炎症，肝脏纤维化程度轻，肝纤维化情况显著好转。

4.2肝功能指标检测

各组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、血清白蛋白(ALB)检测结果见表2。

表2大鼠血清ALT、AST活性及ALB含量的比较

注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组相比，

表2结果表明：较之对照组，模型组大鼠血清中ALT、AST活性含量明显升高，而ALB含量有所降低，差异具有统计学意义；聚乙二醇青蒿琥酯低、中、高组，青蒿琥酯高剂量组及秋水仙碱阳性对照组明显降低四氯化碳致血清中ALT、AST的量。

4.3肝纤维化指标检测

各组大鼠血清透明质酸酶(HA)、层粘连蛋白(LN)、III型前胶原(PC-III)的检测结果见表3。

表3大鼠血清中肝纤维化指标水平的比较

表3结果表明：聚乙二醇青蒿琥酯低剂量(1mg/kg)注射组和青蒿琥酯高剂量组即可明显降低四氯化碳致大鼠血清纤维化标志物透明质酸酶(HA)、层粘连蛋白(LN)、III型前胶原(PC-III)的量。

4.4丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、羟脯氨酸(HyP)测定

大鼠肝组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、羟脯氨酸(HyP)测定结果见表4。

表4大鼠肝组织中MDA、SOD和HyP的检测结果

表4结果表明：聚乙二醇青蒿琥酯低剂量(1mg/kg)注射组和青蒿琥酯高剂量组即可明显降低四氯化碳致大鼠肝组织中MDA和HyP的量，升高SOD的量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.式1所示的聚乙二醇青蒿琥酯在制备抗肝脏病变药物中的应用：

所述肝脏病变选自肝纤维化。